專利名稱：S－腺苷同型半胱氨酸的醫(yī)學用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及在生物體氨基酸代謝過程中，S-腺苷蛋氨酸在甲基轉移酶的作用下，將甲基轉移給其他物質，參與生成多種含甲基的重要生物活性物質如蛋白質、脂質和核酸。更具體地說是體內的S-腺苷蛋氨酸通過上述反應提供甲基后，轉變?yōu)镾-腺苷同型半胱氨酸(S-(5’-Adenosyl)-L-homocysteine，AdoHcy)，而S-腺苷同型半胱氨酸是S-腺苷蛋氨酸依賴的轉甲基反應強大的抑制劑。
背景技術：
在生物體氨基酸代謝過程中，S-腺苷蛋氨酸在甲基轉移酶的作用下，將甲基轉移給其他物質，參與生成多種含甲基的重要生物活性物質如蛋白質、脂質和核酸。體內的S-腺苷蛋氨酸通過上述反應提供甲基后，轉變?yōu)镾-腺苷同型半胱氨酸(S-(5’-Adenosyl)-L-homocysteine，AdoHcy)，而S-腺苷同型半胱氨酸是S-腺苷蛋氨酸依賴的轉甲基反應強大的抑制劑。
蛋白質、脂質、核酸(尤其是mRNA)等生物分子的甲基化對于維持細胞的活性是必需的，一些細胞膜信號分子的翻譯后加工也需要甲基化的參與。以前的研究表明，甲基化抑制劑S-腺苷同型半胱氨酸能影響腦內神經物質代謝，防治神經細胞缺血壞死，具有誘導睡眠和抗驚厥的作用。文獻也表明S-腺苷同型半胱氨酸是一個安全無毒的甲基化抑制劑。但是迄今為止，S-腺苷同型半胱氨酸在體內對于免疫系統(tǒng)的影響一直沒有研究。我們在此進行了大量的S-腺苷同型半胱氨酸體內免疫抑制活性研究。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)的醫(yī)學用途。
S-腺苷同型半胱氨酸是生物體氨基酸代謝過程中的代謝中間產物。本發(fā)明對S-腺苷同型半胱氨酸在體內的藥效藥理學研究中發(fā)現(xiàn)并證明，AdoHcy體內給藥能產生強烈的抗炎免疫抑制活性作用。AdoHcy作為新型抗炎免疫抑制藥物有非常好的研究和開發(fā)應用前景，將有可能用于治療自身免疫性疾病、嚴重過敏性疾病、糖尿病等與機體免疫系統(tǒng)的功能及反應狀態(tài)異常有關疾病，以及用于預防器官等移植后的排斥反應。
經動物試驗證明，S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)具有如下免疫抑制活性(一)AdoHcy能夠抑制DNFB誘導的小鼠遲發(fā)性超敏反應(二)AdoHcy能夠抑制卵清蛋白(OVA)誘導的抗原特異性免疫反應(三)AdoHcy能夠阻止髓磷脂少突細胞糖蛋白35-55肽段(MOG 35-55)誘導實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎(四)AdoHcy能夠改善MRL-lpr/lpr小鼠自發(fā)性紅斑狼瘡疾病的癥狀


圖1是S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)體內給藥能抑制OVA免疫誘導小鼠的淋巴細胞對抗原特異性刺激的增殖反應。A是抑制脾淋巴細胞對OVA的反應；B是抑制淋巴結細胞對OVA的反應。
圖2是S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)體內給藥能抑制OVA免疫誘導小鼠的淋巴細胞對抗原特異性刺激的細胞因子產生。A是抑制脾淋巴細胞對OVA的反應；B是抑制淋巴結細胞對OVA的反應。
圖3是S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)體內給藥能抑制抗OVA特異性抗體的產生。
圖4是S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)體內給藥能有效抑制MOG 35-55誘導的小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎的發(fā)病嚴重程度。
實心園圈代表EAE模型組，空心圓圈代表5mg/kg S-腺苷同型半胱氨酸給藥組圖5是S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)體內給藥能有效抑制MOG 35-55誘導的小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎的淋巴細胞對抗原特異性刺激的增殖反應。A是抑制脾淋巴細胞對MOG 35-55的反應；B是抑制淋巴結細胞對MOG 35-55的反應。
黑色條圖代表EAE模型組，灰色條圖代表5mg/kg S-腺苷同型半胱氨酸給藥組圖6是S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)體內給藥能有效抑制MOG 35-55誘導的小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎的淋巴細胞對抗原特異性刺激的細胞因子產生。左面兩圖抑制脾淋巴細胞對MOG 35-55的反應；右面兩圖抑制淋巴結細胞對MOG 35-55的反應。
黑色條圖代表EAE模型組，灰色條圖代表5mg/kg S-腺苷同型半胱氨酸給藥組
具體實施例方式
實驗藥物、動物及材料藥物名稱S-腺苷同型半胱氨酸S-(5’-Adenosyl)-L-homocysteine)，MW384.4。
實驗動物實驗采用Balb/c小鼠，C57BL/6小鼠，6-8周齡，全為雌性小鼠，購于中科院上海實驗動物中心，動物合格證書號中科滬動管第99-003號。MRL-lpr/lpr小鼠從日本引進，由中科院上海藥物研究所SPF級動物房繁育提供。動物飼養(yǎng)于中科院上海藥物所清潔級動物房，12小時光/暗循環(huán)，24℃室溫，50-60％濕度。
試劑百日咳毒素(Pertussis toxin，PTX)和Ovalbumin(grade V)購自Sigma公司(St.Louis，MO，USA)。
完全弗氏佐劑(Complete Freund’s adjuvant，CFA)和結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis H37Ra)購自Difco公司(Detroit，MI，USA)。MOG 35-55由上海生工生物工程技術有限公司合成(Shanghai，P.R.China)。
ELISA試劑盒為Pharmegen公司產品。
RPMI-1640培養(yǎng)液及小牛血清為GIBCOL公司產品。
-胸腺嘧啶核苷為上海原子能研究所產品，其余試劑均為國產分析純。
實驗方法[一]遲發(fā)性超敏反應動物模型(DTH)1.Day0，Balb/c小鼠(雌性，6-8周齡)每只后腳以20ul 0.5％DNFB致敏。次日加強。(DNFB溶于[丙酮∶橄欖油＝4∶1]油劑中)；2.Day(7-9)，鼠左耳內外兩側各10ul 0.4％DNFB進行攻擊；3.攻擊前1小時腹腔注射一次。12小時后，再給藥一次；4.攻擊后24-48小時，檢測各指標。
實驗數(shù)據(jù)表1.
S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)體內給藥能抑制DNFB誘導的小鼠遲發(fā)性超敏反應(抑制耳腫脹程度)

S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)抑制DNFB誘導的小鼠遲發(fā)性超敏反應(DTH)我們選用了經典的小鼠DTH反應模型。DTH實驗是一種體內檢測細胞介導免疫功能的方法，與接觸性超敏反應相似。DTH也包括致敏和觸發(fā)兩個階段。致敏約需要6天，在觸發(fā)后的24～48小時DTH的炎癥反應達到高峰。在初始的致敏階段有記憶性的抗原特異性細胞分布到外周各淋巴組織，在任何局部的抗原刺激會使這些細胞迅速活化引起DTH。結果顯示，體內腹腔給藥AdoHcy劑量在0.2，1和5mg/kg時，能顯著抑制耳腫脹程度，與對照組相比抑制率分別22.9％，28.5％和39.1％(見實驗數(shù)據(jù)表)，(*P＜0.05；**P＜0.01)。
卵清蛋白(OVA)誘導的抗原特異性免疫反應將OVA(2mg/ml)與等體積的CFA充分乳化，給雌性C57BL/6小鼠背部皮下注射(100μl/只)。為了探討S-腺苷同型半胱氨酸的免疫抑制作用，我們將OVA免疫的小鼠隨機分成4組①模型對照組腹腔注射等體積的PBS，每天1次；②S-腺苷同型半胱氨酸低劑量組(0.2mg/kg/d，i.p.)；③S-腺苷同型半胱氨酸中劑量組(1mg/kg/d，i.p.)；④S-腺苷同型半胱氨酸高劑量組(5mg/kg/d，i.p.)。
免疫后21天處死小鼠，無菌取脾臟和淋巴結細胞(腋窩和腹股溝)，制成單細胞懸液，計數(shù)。調細胞濃度為5×106/ml，加入96孔培養(yǎng)板中(100μl)，RPMI 1640和OVA(終濃度100μg/ml)分別加入，終體積200μl，每實驗組設3個復孔。細胞于含5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，用3H摻入法測細胞增殖；培養(yǎng)2天收上清，用ELISA檢測細胞因子IL-2、INF-γ和IL-4。
免疫后第21天摘眼球取血，用ELISA檢測血清中OVA特異性IgG、IgG1、IgG2a和IgG3。結果用OD570±S.E.M表示。
S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)抑制OVA誘導的抗原特異性免疫反應卵清蛋白(OVA)免疫的小鼠，體外用100μg/ml OVA能誘導脾細胞和淋巴結細胞抗原特性增殖，產生細胞因子白介素-2(IL-2)、γ-干擾素(INF-γ)和白介素-4(IL-4)。S-腺苷同型半胱氨酸(1和5mg/kg/d)給藥21天明顯抑制脾細胞和淋巴細胞OVA特異性增殖反應(見實驗數(shù)據(jù)圖1A和1B)，(*P＜0.05；**P＜0.01)；S-腺苷同型半胱氨酸對淋巴細胞產生Th1型細胞因子(IL-2和INF-γ)的抑制作用明顯強于Th2型細胞因子(IL-4)(見實驗數(shù)據(jù)圖2A和2B)，(*P＜0.05；**P＜0.01)；對降低血中抗體總IgG的水平，IgG2a和IgG3的抑制作用也明顯強于IgG1(見實驗數(shù)據(jù)圖表3)，(*P＜0.05；**P＜0.01)。
MOG 35-55誘導小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎將MOG 35-55(4mg/ml)與等體積的CFA(含4mg/ml Mycobacterium tuberculosisH37Ra)充分乳化，給雌性C57BL/6小鼠背部皮下注射(100μl/只)。在免疫當天和免疫后48小時腹腔注射PTX(400ng/只)。免疫后按體重年齡將小鼠隨機分成2組①模型對照組(9只)腹腔注射等體積的磷酸緩沖液(Phosphate-buffered saline，PBS)，每天1次；②S-腺苷同型半胱氨酸給藥組(10只)腹腔注射5mg/kg AdoHcy，每天1次。
實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎的臨床評分采用常用的5分制。評分標準如下0分，沒有明顯疾病癥狀；1分，尾巴張力消失或者后肢無力；2分，尾巴張力消失和后肢無力；3分，后肢部分癱瘓；4分，后肢完全癱瘓；5分，瀕死狀態(tài)或者死亡。免疫后每天觀察小鼠的狀態(tài)和臨床評分。
實驗結束時處死小鼠，無菌取脾臟和淋巴結細胞(腋窩和腹股溝)，制成單細胞懸液，計數(shù)。調細胞濃度為5×106/ml，加入96孔培養(yǎng)板中(100μl/Well)，RPMI1640和MOG 35-55(終濃度10μg/ml)分別加入，終體積200μl，每實驗組設3個復孔。細胞于含5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，用3H摻入法測細胞增殖；培養(yǎng)2天收上清，用ELISA檢測細胞因子IL-2和INF-γ。
AdoHcy抑制MOG 35-55誘導小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎3.1.AdoHcy抑制MOG 35-55誘導實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎在MOG 35-55免疫C57BL/6小鼠當天腹腔注射AdoHcy(5mg/kg/d)，能明顯降低EAE的發(fā)病率(模型組發(fā)病率8/9，AdoHcy給藥組發(fā)病率3/10)，延遲EAE的發(fā)病時間(模型組7天開始發(fā)病，平均發(fā)病時間為12天；AdoHcy給藥組14天開始發(fā)病，平均發(fā)病時間為15天)。如(見實驗數(shù)據(jù)圖4)所示，AdoHcy能明顯降低平均臨床評分，減輕疾病的嚴重程度。
3.2AdoHcy抑制MOG 35-55誘導淋巴細胞增殖和Th1細胞因子的產生MOG 35-55免疫的小鼠，體外用10μg/ml MOG 35-55能誘導脾細胞和淋巴結細胞抗原特性增殖以及Th1型細胞因子IL-2和INF-γ的產生；而AdoHcy給藥24天能明顯抑制淋巴細胞MOG 35-55特異性增殖反應(見實驗數(shù)據(jù)圖5A和5B)，(*P＜0.05；**P＜0.01)；AdoHcy給藥24天能明顯抑制淋巴細胞MOG 35-55特異性IL-2和INF-γ的產生(見實驗數(shù)據(jù)圖6)，(*P＜0.05；**P＜0.01)。
MRL-lpr/lpr小鼠自發(fā)性紅斑狼瘡疾病將16周雌性MRL-lpr/lpr小鼠隨機分成2組①模型對照組(10只)腹腔注射等體積的磷酸緩沖液(Phosphate-buffered saline，PBS)，每天1次；②S-腺苷同型半胱氨酸給藥組(10只)腹腔注射5mg/kg AdoHcy，每天1次。連續(xù)給藥8周致24周左右，處死小鼠。稱體重，取脾臟和淋巴結、稱重并計數(shù)。
AdoHcy改善MRL-lpr/lpr小鼠自發(fā)性紅斑狼瘡疾病的癥狀S-腺苷同型半胱氨酸(5mg/kg/d，i.p.)給藥8周對MRL-lpr/lpr小鼠體重沒有明顯影響，提示其在體內沒有明顯的毒性。S-腺苷同型半胱氨酸明顯降低取脾臟和淋巴結的重量，減少脾細胞計數(shù)，抑制自發(fā)性紅斑狼瘡模型動物過渡激活的免疫系統(tǒng)，改善疾病的癥狀(見實驗數(shù)據(jù)下表)，(*P＜0.05；**P＜0.01)。
S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)體內給藥能有效改善MRL-lpr/lpr小鼠自發(fā)性紅斑狼瘡疾病的癥狀

結論在體內實驗中S-腺苷同型半胱氨酸對于DTH反應模型的小鼠的耳腫脹程度都具有顯著的抑制作用，能夠抑制卵清蛋白(OVA)誘導的抗原特異性免疫反應，防治實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎，改善MRL-lpr/lpr小鼠自發(fā)性紅斑狼瘡疾病的癥狀。試驗證明一種S-腺苷同型半胱氨酸及含S-腺苷同型半胱氨酸的組合物在制備免疫抑制藥物中應用?？梢赃M一步將其開發(fā)成為高效低毒的免疫抑制藥物，如在無菌條件下被制成液體劑型如針劑、溶液，或者是口服劑型如片劑和膠囊等。由于這些技術都是藥物研發(fā)領域的常規(guī)技術手段，因此不再贅述。
權利要求
1.一種S-腺苷同型半胱氨酸及含S-腺苷同型半胱氨酸的組合物在制備免疫抑制藥物中應用。
2.根據(jù)權利要求1所述的S-腺苷同型半胱氨酸及含S-腺苷同型半胱氨酸的組合物在制備免疫抑制藥物中應用，其特征在于在制備預防、治療自身免疫疾病的藥物中應用。
3.根據(jù)權利要求2所述的S-腺苷同型半胱氨酸及含S-腺苷同型半胱氨酸的組合物在制備免疫抑制藥物中應用，其特征在于免疫性疾病為多發(fā)性硬化癥，系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕關節(jié)炎、慢性腎炎、糖尿病。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種S－腺苷同型半胱氨酸的醫(yī)學用途，通過對AdoHcy能夠抑制DNFB誘導的小鼠遲發(fā)性超敏反應，AdoHcy能夠抑制卵清蛋白(OVA)誘導的抗原特異性免疫反應，AdoHcy能夠阻止髓磷脂少突細胞糖蛋白35－55肽段(MOG 35－55)誘導實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎，AdoHcy能夠改善MRL－lpr/lpr小鼠自發(fā)性紅斑狼瘡疾病的癥狀實驗，證明S－腺苷同型半胱氨酸具有明顯的免疫抑制作用，具有高效低毒的優(yōu)點，可用于制備免疫抑制劑。
文檔編號A61P37/00GK1939332SQ20051010846
公開日2007年4月4日 申請日期2005年9月30日 優(yōu)先權日2005年9月30日
發(fā)明者左建平, 付云峰 申請人:中國科學院上海藥物研究所