專利名稱：：半胱氨酸雙加氧酶中的多態(tài)性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及半胱氨酸雙加氧酶(CDO)中多態(tài)性(polymorphism)的檢測和鑒定，該鑒別用于鑒定患者患上類風濕性關(guān)節(jié)炎和/或產(chǎn)生眾多藥物副作用的傾向；編碼所述多態(tài)性的核酸和分離的蛋白；用于CDO活性和用于影響CDO活性的化合物的鑒定的測定；另外，本發(fā)明還涉及干擾素-Y任選聯(lián)合不同化合物在治療類風濕性關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種自身免疫性疾病，其特征在于患者關(guān)節(jié)中的慢性炎癥和組織破壞。這種疾病是如何被引發(fā)的確切原因還未清楚。然而，存在遺傳易感性和微生物傳播方面的證據(jù)，但是這兩方面都沒有得到令人滿意的描述。疾病發(fā)作時，促炎細胞因子加大釋放，導(dǎo)致肢體關(guān)節(jié)周圍的慢性炎癥，慢慢促成患者失能加劇。關(guān)節(jié)周圍的滑膜長得比正常大小明顯要大。這種組織的增生會造成關(guān)節(jié)翳(即，在其擴散時導(dǎo)致韌帶和骨質(zhì)破壞的大量成纖維細胞)的形成。通常，隨著滑液在關(guān)節(jié)周圍聚集，關(guān)節(jié)會發(fā)炎?；罕旧硎巧眢w血清、淋巴細胞和分泌的許多化學(xué)信號物質(zhì)的混合物。其中，所述化學(xué)信號物質(zhì)是促炎細胞因子，其延續(xù)受影響的個體的慢性炎癥和進程性機能不全。在類風濕性關(guān)節(jié)炎的情況中，促炎細胞因子的兩個例子是TNFa(腫瘤壞死因子a)和IL-1(白介素-1)。已知類風濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)作早期中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的超表達非常有助于疾病癥狀的發(fā)展，而所述細胞因子的持續(xù)合成則有利于疾病狀態(tài)的維持。類風濕性關(guān)節(jié)炎治療的很多研究都基于對所述細胞因子的阻斷。例如，市場上有很多的抗TNF藥物(例如由Centocor制造的Ifliximab和由Amgen制造的Etanercept)。另外，已知還有抗IL-1的藥物(例如由Amgen制造的Anakira)。半胱氨酸雙加氧酶(CDO)是參與含硫化合物代謝的酶。其催化半胱氨酸形成半胱氨酸磺酸。這又在很多不同途徑例如生成?；撬?、磺基丙氨酸、丙氨酸和(3-亞磺酰丙酮酸等途徑中得到利用。由于后一種化合物被代謝成亞硫酸鹽，然后代謝成硫酸鹽，因此特別受到關(guān)注。雖然存在其他的硫酸鹽形成途徑，但是它們明顯沒有那么重要。與自身免疫性或炎性組分有關(guān)的各種病況如類風濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、原發(fā)性膽汁性硬化、克羅恩病和強直性脊柱炎已表明和患有這些疾病的患者中的高血漿水平的半胱氨酸和低血漿濃度的無機硫酸鹽有關(guān)。硫酸鹽參與見于關(guān)節(jié)本身的滑液、蛋白和糖胺聚糖的磺化?；腔降慕档蛯?dǎo)致這些物質(zhì)保護性能和潤滑性能的下降，從而使疾病的病況惡化。WilkinsonL丄禾卩WaringR.H.(Toxicolinvitro(2002)，第481483頁)已證明，CDO是參與無機硫酸鹽氧化降解的限速酶。他們留意到，炎性病況如類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)與患者中半胱氨酸硫酸鹽的高比率有關(guān)。他們還證明，腫瘤壞死因子-a(TNF-a)和轉(zhuǎn)化生長因子-l3(TGF-p)能夠抑制某些細胞系中的CDO生成的表達。他們推斷這些細胞因子可能通過降低CDO表達來參與RA的惡化。在這篇文章中，通過使用抗體和Western印跡檢測CDO來測定人神經(jīng)元和肝(Chang)細胞系中的CDO。目前類風濕性關(guān)節(jié)炎測試包括類風濕性因子測試(RF)。類風濕性因子是最終存在于大部分RA患者中的抗體。然而，不是所有的RA患者的RF測試都呈陽性，尤其是在疾病早期，所述測試得到極限值的陰性結(jié)果。相反，RF測試呈陽性的其他患者從不患上這種疾病。這種測試有60%至70%類風濕性關(guān)節(jié)炎患者呈陽性，這通常是關(guān)節(jié)炎患者中診斷類風濕性關(guān)節(jié)炎而沒有其他明顯診斷結(jié)果的論據(jù)。然而，類風濕性因子還出現(xiàn)在其他疾病中。還有很多常規(guī)的生物化學(xué)指示物為炎癥的活性和程度提供一些跡象，但是這些指示物同樣對類風濕性關(guān)節(jié)炎沒有特異性。使用X射線或MRI(核磁共振成像)的放射學(xué)檢査也可能檢測到類風濕性關(guān)節(jié)炎，但是同樣滯后于疾病的進展。另外，HLA分型可以用于查找與DR1和DR4有關(guān)的標記。在基于醫(yī)院的調(diào)查中，70%至90%類風濕性關(guān)節(jié)炎患者具有這些標記，但是約30%的普通群體也有這些標記。因此，還需要針對類風濕性關(guān)節(jié)炎的進一步的診斷測試。本發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)，在RA患者和具有RA家族史的人群中，有很多見于編碼CDO的DNA或控制CDO表達的調(diào)節(jié)區(qū)中的多態(tài)性，因而提示RA和低濃度CDO有關(guān)。而且，他們發(fā)現(xiàn)了新的用于CDO表達的測定，并確定有大量的藥物包括干擾素-y(IFN-力增強CDO的表達，從而表明IFN-y可以用于治療RA。EP0974358A建議用IFN-y來治療與HTLV-1有關(guān)的疾病。HTLV-1與成人T細胞白血病有關(guān)。還推測HTLV-1可能參與大量的其他疾病，包括斯耶格倫氏綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、葡萄膜炎和慢性類風濕性關(guān)節(jié)炎?，F(xiàn)已知道，HTLV只是罕見地(如果有的話)與慢性RA有關(guān)。本申請的發(fā)明人認為，CDO可能是用于關(guān)節(jié)組分磺化的硫酸鹽的生成中的關(guān)鍵限制步驟。他們因此研究兩類不同群體的核酸樣品患有類風濕性關(guān)節(jié)炎群體和對照群體。在對CDO基因進行測序時，他們意外地發(fā)現(xiàn)，與對照群體相比，類風濕性關(guān)節(jié)炎群體的突變水平很高。而且，他們還留意到，鑒定有突變之一的一個對照只有25歲，但是具有類風濕性關(guān)節(jié)炎家族史，因此表明所述突變不僅是提示類風濕性關(guān)節(jié)炎存在的標記，而且是提示個體一生中的后期可能發(fā)展為類風濕性關(guān)節(jié)炎的標記。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明提供了一種用于診斷CDO介導(dǎo)的病況的方法，該方法包括(i)從個體中獲取樣品；(ii)檢測是否存在變異性CDO蛋白、或編碼CDO變體和/或CDO調(diào)節(jié)區(qū)變體的核酸；(iii)參考CDO基因和/或其調(diào)節(jié)區(qū)中的多態(tài)性來確定所述個體的狀況?；腔砍霈F(xiàn)下降可能是由于CDO蛋白表達下降的緣故。優(yōu)選的是，所述調(diào)節(jié)區(qū)是編碼CDO的區(qū)域的5'。其可以是啟動子區(qū)或增強子區(qū)。作為選擇，可以生成CDO蛋白，但是編碼該蛋白的DNA中的突變會導(dǎo)致CDO中的一個或多個氨基酸發(fā)生改變，從而造成CDO具有較低的酶活性。CDO蛋白生成水平的下降和CDO酶活性的下降都會導(dǎo)致硫酸鹽生產(chǎn)量的下降。因此，通過査找編碼CDO變體的核酸、其調(diào)節(jié)區(qū)中的多態(tài)性，或者作為選擇，查找與具有正常水平CDO的正常個體比較所述變體生成的蛋白在蛋白結(jié)構(gòu)上的變化，可以對變異性CDO進行檢測。據(jù)認為，CDO的正常水平為10至30皮摩爾/毫克蛋白，可能為5至100皮摩爾/毫克蛋白。認為正常CDO的酶活性為10至30皮摩爾/毫克蛋白/小時，可能為5至100皮摩爾/毫克蛋白/小時。本發(fā)明還提供了人中CDO基因或其調(diào)節(jié)序列中的一個或多個多態(tài)性的鑒定方法，該方法包括確定編碼至少一部分CDO基因和/或CDO調(diào)節(jié)區(qū)的核酸分子序列和參考CDO基因和/或其調(diào)節(jié)區(qū)中的多態(tài)性來確定該人的狀況。多態(tài)性是指群體中出現(xiàn)兩個以上遺傳決定的備選等位基因或序列。多態(tài)性標記是趨異發(fā)生的位點。例如，一個堿基(如腺嘌呤)可以被不同的堿基(如胸腺嘧啶)所替代。作為選擇，一個或多個另外的堿基可以在所述位點插入。一個堿基取代另一個堿基時的多態(tài)性可能導(dǎo)致例如密碼子的改變，使得在衍生自核酸序列的信使RNA被翻譯為最終的酶時導(dǎo)致不同氨基酸被插入到蛋白中。例如，GCC是編碼丙氨酸的密碼子。如果該密碼子發(fā)生改變，使得其含有腺嘌呤殘基如GAC，該密碼子將被錯讀并導(dǎo)致插入的是天冬氨酸殘基而不是丙氨酸。一個或多個堿基的取代還可能導(dǎo)致例如終止密碼子的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致蛋白形成的終止。這種取代如果發(fā)生在調(diào)節(jié)序列，如發(fā)生在CDO基因上游的啟動子序列，就可能會導(dǎo)致CDO表達水平的下降。作為選擇，編碼加工信號的序列也可能影響到最終CDO產(chǎn)物的表達。其他突變包括當一個或多個堿基插入到DNA中時的添加突變和當一個或多個堿基從編碼調(diào)節(jié)序列或CDO序列本身的DNA中缺失時的缺失突變。所述缺失可能導(dǎo)致截斷蛋白的生成，或者作為另外一種可能，導(dǎo)致CDO基因表達水平的下降。優(yōu)選的是，査找兩個以上的多態(tài)性。優(yōu)選所述標記具有至少兩個等位基因，每個等位基因以大于1%，優(yōu)選至少為10%以上、15%以上、20%以上、30。/。以上的所選群體(例如患有RA的群體)的頻率發(fā)生。單核苷酸多態(tài)性(SNP)通常如其名稱所意指的，是存在于某物種的某些成員的核酸序列中的單核苷酸變異或點變異。物種中的所述多態(tài)性變異通常被認為是整個進化過程中的自發(fā)突變的結(jié)果。多態(tài)性還影響mRNA的合成、突變、運輸和穩(wěn)定性。沒有導(dǎo)致氨基酸變化(沉默多態(tài)性)或者沒有改變?nèi)我庖阎谋Ｊ匦蛄械亩鄳B(tài)性例如通過改變mRNA的折疊、穩(wěn)定性、拼接、轉(zhuǎn)錄速度、翻譯速度和忠實性而仍然具有生物學(xué)作用。實際上已有報道，即使是沒有導(dǎo)致氨基酸改變的多態(tài)性，也可以導(dǎo)致mRNA的結(jié)構(gòu)上的不同折疊，具有潛在的不同生物學(xué)功能(Shen等(1999)PNASUSA，第96巻，第78717876頁)。因此，發(fā)生在編碼區(qū)之外(例如在內(nèi)含子序列和啟動子區(qū))的改變可能影響該序列的轉(zhuǎn)錄和/或信使穩(wěn)定性，從而影響細胞中CDO蛋白的水平。優(yōu)選所述多態(tài)性選自外顯子位置SNP類型外顯子l:+673A插外顯子l:+697G插外顯子l:+1103C-A取外顯子3:+15A-T取外顯子3:+16T-C取外顯子3:+17A-C取外顯子3:+29T-A取外顯子3:+30G添外顯子4:+33A-T取外顯子4:+34G-C取外顯子4:+43A添外顯子4:+46C-A取已知CDO包含5個外顯子。CDO的核苷酸序列可以通過Genbank(可從http://www.ncbi.nlm.nih.gov登陸)獲得。該核苷酸序列可以以三段獲得。第一段CDO的長度為4186個核苷酸，包括外顯子1(核苷酸6091026)和外顯子2(核苷酸40004077)，并可以由Genbank登錄號U60232.1,GI:入入代代代代代加代代加代2138108獲得。第二段CDO的長度為2739個核苷酸，包括外顯子3(核苷酸17351889)，并可以由Genbank登錄號U78979.1，GI:1699035獲得。第三段CDO的長度為2995個核苷酸，包括外顯子4(核苷酸U151284個)和外顯子5(核苷酸21732907)，并可以由Genbank登錄號U80055.1，GI:2138109獲得。在序列表中，第一段=SEQIDNo.1，第二段=SEQIDNo.2，第三段=SEQIDNo.3，外顯子1=SEQIDNo.4，外顯子2=SEQIDNo.5，外顯子3=SEQIDNo.6,外顯子4=SEQIDNo.7，而外顯子5=SEQIDNo.8。以上給出的SNP坐標指的是可從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得的野生型CDO核苷酸序列的SNP坐標。對于外顯子1，該坐標對應(yīng)于第一段(即Seq.IDNo.1)的編號。因此，所鑒定的多態(tài)性沒有位于外顯子l的編碼序列中，而是位于外顯子1的側(cè)翼區(qū)。對于外顯子3和4，SNP坐標分別對應(yīng)于外顯子3(即S叫IDNo.6)和外顯子4(即Seq.IDNo.7)的編號。多態(tài)性可以在基因組DNA中檢測到。作為選擇，多態(tài)性也可以在RNA如mRNA或由所述mRNA獲得的cDNA中檢測到。本發(fā)明的方法提供了指示該人具有濃度降低的CDO和/或表達酶活性降低的CDO。可以從例如血液或其他身體組織或者口腔檢查用拭子獲取所述樣品。所述鑒別優(yōu)選在體外進行。CDO介導(dǎo)的病況可以是類風濕性關(guān)節(jié)炎和/或一種或多種選自D-青霉胺和硫代蘋果酸金的藥物引起的副作用進程。利用一種或多種多態(tài)性的存在與否來輔助所述診斷。鑒定個體或人患上類風濕性關(guān)節(jié)炎的傾向的能力使得所述個體可以在形成類風濕性關(guān)節(jié)炎疼痛癥狀之前用例如氨甲喋呤進行治療。這有助于防止患者發(fā)生侵蝕性類風濕性關(guān)節(jié)炎。這意味著可以早期鑒定所述個體，并能夠通過防止類風濕性關(guān)節(jié)炎的完全發(fā)作來顯著提高他們的生活質(zhì)量。已知D-青霉胺和硫代蘋果酸金等藥物在對正用這些化合物治療的類風濕性關(guān)節(jié)炎患者中引起副作用。據(jù)認為，由于這些患者具有低水平的CDO或低水平的活性CDO，所述藥物不能被正確氧化。因此，能夠鑒定出可能出現(xiàn)所述副作用的那些患者是有幫助的，因為這可以讓所述患者采用另外的藥物。鑒定核酸區(qū)中是否存在多態(tài)性的方法本身是公知的。優(yōu)選的是，在鑒定多態(tài)性之前，采用聚合酶鏈式反應(yīng)對多態(tài)性進行擴增。這可以簡單地通過如下方法來實現(xiàn)使用針對多態(tài)性上游的序列的引物，擴增一段編碼多態(tài)性的核酸，然后對所擴增的序列進行測序。作為選擇，引物可以針對多態(tài)性位點，讓引物的序列基本上與感興趣的多態(tài)性序列互補，使得引物雜交到多態(tài)性位點上，然后用以生成PCR產(chǎn)物。如果所述位點不存在感興趣的多態(tài)性，那么引物就不會結(jié)合到該位點上，也不會生成PCR產(chǎn)物。結(jié)果就沒有檢測可用的PCR產(chǎn)物。實時PCR可以用來鑒定SNP。由于采用例如熒光分子標記引物、探針和擴增子的各種化學(xué)方法的出現(xiàn)，實時PCR得到了發(fā)展。反應(yīng)通常在用作比色杯的毛細管中建立，因而可以在每個循環(huán)結(jié)束時對熒光信號進行監(jiān)測。這可以在同一管子中進行靶擴增和檢測，形成不需要擴增后處理和檢測的封閉管體系。例如，W097/46712公開的熱循環(huán)方法和設(shè)備。WO00/18965公開了針對檢測突變或多態(tài)性的存在的方法。該方法基于雜交探針解鏈曲線分析，使用聚合酶鏈式反應(yīng)和熒光標記寡核苷酸雜交探針來鑒定突變和多態(tài)性。所用的熒光團可以是本領(lǐng)域已知的眾多不同化合物中的一種，包括溴乙錠、YO-PRO-l和SYBRGreenI。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescentresonanceenergytransfer,FRET)依賴、于兩個雜交探針的相鄰?fù)嘶?LayNJ.和WittwerCT.Clin.Chem.(1997)，第43巻，第22622267頁)。第一探針在其3'端含有供體染料，而另一個探針在其5'端含有受體染料。當通過外源加光時，所述供體染料受到激發(fā)并在熒光共振能量轉(zhuǎn)移過程中將能量轉(zhuǎn)移到受體染料上。只有當兩個引物在緊密靠近處退火時，才可能發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。因此，所述技術(shù)可以檢測互補引物與特異多態(tài)性的結(jié)合。作為選擇，可以采用較簡單的技術(shù)，例如在可能存在多態(tài)性的位點附近進行核酸的擴增?？梢岳缡褂秒娪緛矸蛛x所擴增的DNA，并使用與感興趣的多態(tài)性互補的標記探針來探測所述DNA?？梢允褂帽绢I(lǐng)域己知的放射性標記或例如熒光標記來標記所述標記探針。優(yōu)選所用的方法包括本發(fā)明的方法，其中通過選自ARMS-等位基因特異性擴增、等位基因特異性雜交、寡核苷酸連接測定和限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)的方法來測定核酸序列。ARMS-等位基因特異性擴增在例如EP0332435和US5,595,890中有描述。這種方法依賴于引物的3'末端核苷酸及其模板的互補性。引物的3'末端核苷酸與待檢測的特異性突變、等位基因或多態(tài)性要么互補要么不互補。RFLP依賴于影響限制性內(nèi)切酶位點的序列的改變，由此防止該位點被限制性酶所消化。個體中是否存在一個或多個(優(yōu)選為兩個以上)不同多態(tài)性可以確定個人患上例如類風濕性關(guān)節(jié)炎和/或產(chǎn)生待測定藥物副作用的傾向。與所述CDO缺陷有關(guān)的其他疾病可包括自身免疫疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、斯耶格倫氏綜合征、葡萄膜炎、克羅恩病、強直性脊柱炎，神經(jīng)退行性疾病如帕金森癥和阿爾茨海默癥和運動神經(jīng)元病。可能與CDO缺陷有關(guān)的其他疾病包括那些涉及針對炎性細胞因子的抗體的疾病。本發(fā)明還提供用于本發(fā)明方法的等位基因特異性探針或引物。如上所述，用以鑒定多態(tài)性的方法本身是公知的。一旦鑒定出多態(tài)性，適當?shù)奶结樆蛞锏蔫b定本身一般在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍之內(nèi)。優(yōu)選的探針或引物包括以下序列:外顯子1:外顯子l:外顯子l:正向引物反向引物反向引物gagggccgttggtacattccgccagtcactttgggctgcctactggccttgctgacctc[SEQIDNo.[SEQIDNo.[SEQIDNo.9]10]17]外顯子2:外顯子2:正向引物反向引物gcttgtttcagcaacgaacttttttcatatgctagaaaacatgctc[SEQIDNo.[SEQIDNo.11]12]外顯子3:外顯子3:正向引物反向引物gaccatctactgagttcagttgtcttcccacttgcccttaga[SEQIDNo.[SEQIDNo.13]14]外顯子4:外顯子4:正向引物反向引物tttttccttcccggatattgcagtgccaacctacagagca[SEQIDNo.[SEQIDNo.15]16]開始時設(shè)計外顯子1引物來與登錄號為D85778.1GI:1747325(外顯子l)的序列雜交，所述登錄號為D85778.1GI:1747325的序列可從www.ncbi.nlm.nih.gov公開獲f尋。優(yōu)選的探針特異性地與含有所述感興趣的SNP的核酸區(qū)域雜交，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉用于設(shè)計具有適當?shù)奶匦岳缣禺愋院徒怄湝囟鹊囊锏募夹g(shù)。優(yōu)選的是，所述探針或引物能夠檢測到如下多態(tài)性<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>本發(fā)明的探針或引物優(yōu)選對應(yīng)于待檢測的多態(tài)性，即它們與待檢測的多態(tài)性互補。本發(fā)明的探針或引物的長度優(yōu)選為1750個核苷酸，更優(yōu)選為約1730個核苷酸。所述引物或探針可對應(yīng)于多態(tài)性的約68個核苷酸。如果將所述探針或引物簡單作為探針使用，即作為標記使用，而不是作為PCR引物使用，可以將探針的大小減少到例如825，優(yōu)選為815個堿基的長度。優(yōu)選的是，本發(fā)明的探針或引物與多態(tài)性位點具有至少為90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性。優(yōu)選的是，它們與所述多態(tài)性位點相同，或作為選擇與所述多態(tài)性位點互補。當然，所述探針或引物可以結(jié)合到編碼CDO的核酸或其含有多態(tài)性的調(diào)節(jié)區(qū)上的鏈上，或者作為選擇，結(jié)合到其互補鏈(當存在時)上。還提供了包含一個或多個本發(fā)明探針或引物的診斷試劑盒。本發(fā)明的另一方面提供了編碼CDO或CDO調(diào)節(jié)多態(tài)性或者與所述多態(tài)性互補的具有至少5個堿基的分離的核酸。優(yōu)選所述多態(tài)性選自<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>以及與所述序列互補的序列。優(yōu)選的是，所述分離的核酸包含至少10、15、20、30或40個堿基。更優(yōu)選的是，所述分離的核酸分子編碼CDO或其片段，更優(yōu)選的是，所述CDO或其片段包含多態(tài)性。還提供了可獲自所述核酸分子的分離的CDO蛋白。由分離的核酸分子制備重組蛋白的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的。所述分離的核酸分子可以克隆到適當?shù)妮d體中并在適當?shù)脑嘶蛘婧怂拗髦斜磉_。因此，本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明的所述分離的核酸分子的載體和宿主細胞。所述載體優(yōu)選含有本領(lǐng)域已知類型的適當啟動子和終止序列。作為選擇，可以使用CDO自身的啟動子和調(diào)節(jié)序列，由此使得可以研究多態(tài)性對一個或多個這些序列的影響。在后一種情況中，所述調(diào)節(jié)序列可以結(jié)合到本領(lǐng)域己知的適當?shù)膱蟾嫘蛄?，如可以容易測定其表達的|3-半乳糖苷酶或綠色熒光蛋白。如上所述，多態(tài)性可以導(dǎo)致CDO的氨基酸序列的變化，從而造成酶結(jié)構(gòu)的變化。通過分離一個或多個抗體，如CDO蛋白特異性的單克隆抗體，可以容易地鑒定酶結(jié)構(gòu)的所述變化。即，所述抗體不會同樣與編碼核酸序列中不含有多態(tài)性的CDO結(jié)合。單克隆抗體的制備本身是眾所周知的，例如可以通過Kohler和Milstein的方法進行。本發(fā)明的又一方面提供了確定個體具有CDO介導(dǎo)病況的傾向的方法，所述方法包括(i)從所述個體獲取樣品；和入入代代代代代加代代加代菌菌扠僅僅議僅泰，R權(quán)泰.R+1-+1.耳耳耳耳s*耳耳紹耳(ii)使用本發(fā)明的抗體檢測含有所述多態(tài)性的CDO的存在。優(yōu)選的是，本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，CDO在白細胞中表達。先前已發(fā)現(xiàn)CDO在大腦和肺組織中。所述組織不易獲得。因此，優(yōu)選本發(fā)明方法中所用的具有例如變異性CDO或編碼CDO的核酸或者實際上其調(diào)節(jié)序列的樣品獲自白細胞。含有CDO的組織樣品相對容易的獲得性允許對將產(chǎn)生的CDO活性進行測定。因此，本發(fā)明的另一方面提供了確定化合物對CDO活性的影響的方法，所述方法包括(i)提供白細胞樣品；(ii)使所述白細胞與CDO底物和所述化合物接觸；和(iii)確定所述化合物對所述白細胞中的CDO使所述底物向可檢測產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的影響。CDO底物的例子包括半胱氨酸、S-羧甲基半胱氨酸、S-甲基半胱氨酸、金硫代蘋果酸鹽(aurothiomalate)、N-乙酰基半胱氨酸、烷基-半胱氨酸和D-青霉胺。這些底物分解生成包括半胱氨酸亞磺酸在內(nèi)的產(chǎn)物。所述方法可以用來鑒定用于治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的藥物候選物。艮口，可以測定例如細胞因子，或者作為另一種選擇的不同化合物對白細胞中CDO表達的影響。本發(fā)明人的其他工作還表明，干擾素-Y(IFN-力可以提高CDO的表達。這與降低CDO表達的TNF-a相反。由于CDO對人體吸收硫酸鹽而言是關(guān)鍵的，而低水平的硫酸鹽與類風濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)，因此預(yù)期IFN-Y可以用作治療劑。因此，本發(fā)明提供了一種治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的方法，所述方法包括施用藥學(xué)有效量的干擾素-Y(IFN-力。優(yōu)選的是，所述類風濕性關(guān)節(jié)炎為非HTLV-1相關(guān)的類風濕性關(guān)節(jié)炎。如已表明的那樣，HTLV-I相關(guān)的類風濕性關(guān)節(jié)炎被認為是相對罕見的。干擾素-Y可以與一種或多種能夠提高硫酸鹽生成水平的化合物聯(lián)合施用。所述化合物包括半胱氨酸、甲硫氨酸、D-青霉胺、N-乙酰基半胱氨酸、S-垸基-半胱氨酸、Y-谷?；腚装彼?、白介素-4和白介素-10。還提供用于制造用以治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的藥物的IFN-Y，其任選與以上所列的硫酸鹽誘導(dǎo)化合物聯(lián)合。本發(fā)明的又一方面提供了一種藥用組合物，所述藥用組合物包含干擾素-y以及諸如以下一種或多種的硫酸鹽誘導(dǎo)化合物的組合半胱氨酸、甲硫氨酸、D-青霉胺、n-乙?；腚装彼帷-烷基-半胱氨酸、y-谷?；腚装彼?、白介素-4、S-羧甲基半胱氨酸、S-甲基半胱氨酸和白介素-10。干擾素-y已被許可臨床上用于治療慢性肉芽腫病以有助于減少嚴重感染。其劑量為90毫克，每周3次。適用于治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的劑量預(yù)計處在類似的劑量范圍內(nèi)。IFN-Y和上述可選的其他化合物可以與一種或多種諸如葡萄糖、蔗糖或海藻糖等穩(wěn)定劑聯(lián)合使用。可以使用IFN-y和/或所述硫酸鹽誘導(dǎo)化合物的藥用鹽。另外，可以加入一種或多種可接受的藥用稀釋劑、賦形劑、填充劑、穩(wěn)定劑、pH控制劑、生物活性物質(zhì)等。優(yōu)選的是，所述物質(zhì)形成口服劑，如膠囊劑、粉劑或片劑。作為選擇，所述物質(zhì)可以通過另外途徑如肌肉內(nèi)注射而使用。下面將通過參考以下附圖，僅通過舉例方式來描述本發(fā)明。圖1顯示人CDO基因的內(nèi)含子和外顯子排列。圖2顯示CDO的外顯子1、2、3和4的內(nèi)含子和外顯子序列。大寫字母表示外顯子序列，小寫黑體字母表示內(nèi)含子序列。各行的數(shù)字為該編碼行第一個堿基的位置。CDO序列由NationalCenterforBiotechnologyInformation(www.ncbi.nhn.nih.gov)獲得。CDO的登錄號為U60232(U60232.1，GI:2138108)。圖3顯示設(shè)計用于擴增CDO外顯子2(A部分)、外顯子3(B部分)、外顯子4(C部分)和外顯子1(D部分)的第一套引物的圖。引物區(qū)域以小寫字母但沒有加粗顯示，并畫上下劃線，旁邊標以箭頭而表示根據(jù)引物進行合成的方向。顯示有兩個不同的外顯子1反向引物。在備選的外顯子1反向引物(SEQIDNo17)和外顯子1的引物結(jié)合區(qū)域(即，靶區(qū)域)之間有單核苷酸不同。圖4顯示降落PCR產(chǎn)物的凝膠圖像。各泳道為(從圖的左邊開始數(shù))-(1)對照外顯子4;(2)對照外顯子3;(3)對照外顯子2;(4)DNA梯度序列。圖5顯示使用對照模板并向反應(yīng)物中加入DMSO所得到的PCR產(chǎn)物的凝膠圖像。可以看到外顯子2、3和4(畫有圓圈)。在PCR擴增外顯子1時沒有使用DMSO(未示出)。圖6顯示A)對照PCR反應(yīng)的鎂梯度系列。各泳道為(從左數(shù)起)(1)E4，[MgCl2]4;(2)E3，[MgCl2]4;(3)E2，[MgCl2]4;(4)E4，[MgCl2]3;(5)E3，[MgCl2〗3;(6)E2，[MgCl2]2;(7)E4，[MgCl2]2;(8)E3，[MgCl2]2;(9)E2，[MgCl2]2;(10)梯度序列。B)類風濕性關(guān)節(jié)炎模板PCR反應(yīng)(包含DMSO)的鎂梯度系列。各泳道為(從左數(shù)起)(1)E4，[MgCl2]4;(2)E3，[MgCl2]4;(3)E2，[MgCl2]4;(4)E4，[MgCl2]3;(5)E3，[MgCl2]3;(6)E2，[MgCl2]3;(7)E4，[MgCl2]2;(8)E3，[MgCl2]2;(9)E2，[MgCl2]2;(10)E4，[MgCl2〗1;(11)E3[MgCl2]1;(12)E2，[MgCl2]l;(13)梯度序列。在這些圖中，由E2(外顯子2)、E3(外顯子3)和E4(外顯子4)鑒定到外顯子，所用的MgCl2的體積以微升計。例如泳道(l)顯示外顯子4，其在4MgCl2的存在下進行擴增。圖7顯示降落PCR的PCR產(chǎn)物的凝膠圖像。來自對照和RADNA的所有外顯子都得到成功擴增。圖8以舉例的方式顯示均來自RA外顯子3的兩個測序結(jié)果的比較。(A)PCR產(chǎn)物純化時的結(jié)果，序列差，雙重信號，有很多"N"沐確定的核苷酸)；(B)凝膠提取結(jié)果，序列好，并且堿基位置得到很好的確定。圖9顯示多態(tài)性對氨基酸取代的預(yù)計影響。己包括所有潛在的SNP(見表3)，因此所示影響更加突出它們將在體內(nèi)發(fā)生。以加粗箭頭標出的位點表示取代SNP。較細的箭頭表示添加SNP。帶下劃線表示不同于正常(對照)序列的氨基酸序列。(A)外顯子2多態(tài)性；(B)外顯子3多態(tài)性；(C)外顯子4多態(tài)性。圖IO顯示經(jīng)過濾的SNP分析。外顯子3顯示氨基酸序列變化明顯減少，而外顯子4盡管SNP數(shù)減少了，但是仍然保持非常高水平的氨基酸間斷。圖11顯示外顯子1的PCR產(chǎn)物的凝膠圖像。泳道l:DNA梯度序列；泳道27:外顯子l;泳道8:陽性對照。具體實施方式材料和方法基因組DNA樣品由類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者和對照志愿者(C)的血液獲得。通過靜脈穿刺將血液收集到經(jīng)EDTA處理的管子中。按如下所述進行PCR。引物設(shè)計設(shè)計特異性PCR引物以擴增CDO的外顯子1、2、3和4。設(shè)計引物時使用獲自NCBI數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov)的序列數(shù)據(jù)和基于互聯(lián)網(wǎng)的引物設(shè)計工具Primer3(http:〃frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3一www.cgi，該網(wǎng)站由MassachusettsInstituteofTechnology(http:〃web.mit.edu/index.html)主辦)。寡核苷酸弓l物由AltaBiosciences(Birmingham,UK)合成，隨后使用蒸餾水稀釋至100皮摩爾(pM)/pL的濃度。聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)CDO外顯子2、3和4通過PCR進行擴增。對于每個外顯子，混合引物(母液為10pM/ml)樣品各10^1，并在蒸餾水中進一步稀釋至5pM的濃度，而獲得用于每個外顯子的正向弓I物和反向引物的混合溶液。用于反應(yīng)的模板DNA有兩種對照"C"和"RA"?？色@得多個對照和患者樣品。對照樣品僅用數(shù)字命名，而RA患者DNA樣品則用數(shù)字加前綴"A"命名。這樣，模板樣品有90、91、92、93和94(對照)以及A11、A12、A13、A14、A16、A17、A18和A19(RA)。PCR反應(yīng)在熱循環(huán)儀中進行。在冰上在0.5ml微量離心管中建立以下反應(yīng)DNA3piIOXPCR緩沖液5pldNTP混合物(200|aM)2.5正向引物2.5pi反向引物2.5pi聚合酶2U無菌水補至50pidNTP混合物、聚合酶和PCR緩沖液獲自Bioline(London,UK)。PCR緩沖液為NH4反應(yīng)緩沖液。有些反應(yīng)中也使用DMSO(二甲亞砜)。氯化鎂(50nM)以1pl5^的體積加入。PCR混合物的總體積為50jliI。典型的PCR程序1.94°C，5分鐘。解鏈步驟。2.94°C，30秒鐘，解鏈步驟。3.53°C*，30秒鐘。退火步驟。4.72°C，1分鐘。延伸步驟。5.步驟24重復(fù)30個循環(huán)。6.72°C，10分鐘。最后的延伸步驟。*退火溫度由計算引物的解鏈溫度并減去5"C計算確定。引物的解鏈溫度可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的公式算得。進行初始PCR后，由于沒有馬上取得成功，因此促使采用降落PCR。降落PCR使用非典型的程序，其中退火溫度在整個循環(huán)中定期改變。降落PCR由比預(yù)計退火溫度高的溫度開始，并在經(jīng)過設(shè)定數(shù)目的循環(huán)(例如5個循環(huán))后降低rc，最終在最后一組循環(huán)中達到"降落式"的退火溫度。如此進行的原因在于要確定是否需要調(diào)整PCR程序的退火溫度。還已表明，降落PCR減少錯誤的引發(fā)(Don，RH，Cox，PT,Wainwright，BJ，Baker，K禾口Mattick，JS(1991);"Touchdown"PCRtocircumventspuriousprimingduringgeneamplification.NucleicAcidsResearch19:4008)，艮卩，引物在不正確的位置發(fā)生非特異性退火，導(dǎo)致很多不同的PCR產(chǎn)物生成，因而在凝膠上得到差的(彌散的或擴散的)條帶。降落PCR程序:194°C，5分鐘294°C，30秒鐘)步驟24重復(fù)5個循環(huán)358°C，30秒鐘472'C，l分鐘594°C，30秒鐘)步驟57重復(fù)5個循環(huán)656°C，30秒鐘72°C，1分鐘894°C，30秒鐘)步驟810重復(fù)5個循環(huán)954°C，30秒鐘1072°C，1分鐘1194°C，30秒鐘)步驟1113重復(fù)5個循環(huán)1252°C，30秒鐘1372°C，1分鐘1494°C，30秒鐘)步驟1416重復(fù)5個循環(huán)1550°C，30秒鐘1672'C，1分鐘1794°C，30秒鐘)步驟1719重復(fù)5個循環(huán)1848°C，30秒鐘1972°C，1分鐘2072°C，10分鐘PCR的優(yōu)化對PCR程序進行優(yōu)化以準確并可靠地擴增出半胱氨酸雙加氧酶外顯子2、3和4。采用多種策略進行優(yōu)化，其中大部分都涉及到改變特定反應(yīng)組分的濃度或者在添加劑存在或不存在的情況下進行試驗。加以控制的變量包括氯化鎂濃度模板DNA濃度引物濃度引物設(shè)計DMSO添加/省略然而，對于外顯子1采用以下PCR程序:步驟1.步驟2.l個循環(huán)的-30個循環(huán)的:94°C，1分鐘94°C，30秒鐘61°C，30秒鐘72°C，1分鐘步驟3.l個循環(huán)的72°C，IO分鐘。并且反應(yīng)組分為DNA3jilIOXPCR緩沖液5|iddNTP混合物2.5^外顯子引物12.5pl(兩個引物中的每一個，濃度各為10pM)聚合酶的酶混合物2U無菌水補至50pl這些實驗的結(jié)果采用瓊脂糖凝膠電泳和隨后的DNA"質(zhì)粒到曲線(PlasmidtoProfile)"測序進行評價。外顯子1的PCR擴增釆用標準PCR或降落PCR，使用如SEQIDNo.9禾[U0所示的PCR引物對外顯子1進行擴增。還使用SEQIDNo.9和17通過降落PCR擴增外顯子l。瓊脂糖凝膠電泳在該研究的不同階段使用1%、2%和3%的瓊脂糖凝膠。在TAE緩沖液中制備瓊脂糖凝膠。TAE緩沖液的50X母液的組成為242gTris堿、57.1ml冰醋酸、100ml的0.5MEDTA(pH8);用蒸餾水補至1升。根據(jù)標準方法制備瓊脂糖凝膠(MolecularCloning:Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis，1989)，并且其中含有標準濃度的溴乙錠(Sigma)。PCR結(jié)束后，將10的PCR產(chǎn)物等分試樣加到0.5ml微量離心管中的4pl體積的凝膠上樣染料(這種情況下為橙G和甘油)中。然后將這些樣品上樣到凝膠中。除了PCR引物外，將2pi上樣染料和5^tl100bpDNA梯度序列(Bioline)的混合物吸移到每塊凝膠的第一個孔。將凝膠在125伏特電泳不同的時間(通常為至少1小時)，讓DNA片段在凝膠上充分遷移，使得用肉眼在紫外線下可以觀察到它們的分離。對電泳條件進行優(yōu)化研究以獲得適當?shù)姆直媛什⑹箺l帶得以充分的分離。PCR產(chǎn)物純化進行凝膠電泳后，對所選的PCR產(chǎn)物進行純化，以將所述DNA與產(chǎn)物混合物的其他組分(變性的7^DNA聚合酶、引物、dNTP等)分離。這采用QiagenPCR產(chǎn)物純化試劑盒(Qiagen，UK)進行。該試劑盒使用多種緩沖液(結(jié)合緩沖液、洗滌緩沖液和洗脫緩沖液)和離心柱，以從所述PCR混合物中分離出所述DNA。根據(jù)制造商說明書(與試劑盒一起提供)使用該試劑盒。該試劑盒從PCR產(chǎn)物中洗脫出在50^EB緩沖液溶液(洗脫緩沖液)中的所述DNA。凝膠提取用以在PCR后獲得純DNA樣品的另一種方法是從瓊脂糖凝膠中提取感興趣的條帶。嵌入有溴乙錠使得DNA可以在紫外線下得以辨認。使用鋒利的潔凈刀片從凝膠上切下感興趣的條帶。將切下的條帶放入1.5ml微量離心管中，使用Qiagen凝膠提取試劑盒(Qiagen，UK)分離所述DNA。該試劑盒有多種緩沖液(類似于PCR純化試劑盒的緩沖液)和離心柱組成(與來自PCR純化試劑盒的離心柱相同)。在50)al體積的洗脫緩沖液(EB緩沖液)中獲得最后純化的DNA樣品。DNA定量DNA測序要求所提交的樣品含有特定量的DNA(在目前的情況中為200ng600ng的DNA)。因此，使用紫外分光光度計在260nm波長處對從純化過程得到的終溶液中存在的DNA的量進行定量。為了將吸光值轉(zhuǎn)換成每微升的DNA納克數(shù)，進行以下公知計算UV吸光度X50X500=DNAng/|al用于測序的DNA樣品的制備將濃度準確的用于進行"質(zhì)粒到曲線"測序的DNA分裝(由制造商進行)為200ng/ml600ng/ml。在該研究階段，部分實驗的目的是確定測序溶液中DNA的最佳濃度以獲得最佳結(jié)果。實驗后，將樣品稀釋至適當?shù)腄NA濃度，以得到最佳的結(jié)果。最后，將含有適當引物的等分試樣(0.64^tl的5pM1的引物溶液)加到DNA樣品中，以使引物在測序樣品中的量為3.2pM(0.64X5=3.2)。然后將其提交到UniversityofBirminghamFunctionalGenomicsLaboratory進行"質(zhì)粒至lj曲線"觀!j序。序列分析所完成的測序結(jié)果以Chromas(軟件Chromasv4.1tm和ChromasProvl.5TMTelynesiumPty.Ltd.http:〃www.telynesium.com.au)格式(.abl文件)由FunctionalGenomicsLaboratory網(wǎng)站獲得。這些文件可以使用所述Chromas軟件打開和讀取。在該軟件中，可以(結(jié)合互聯(lián)網(wǎng)連接)對從測序獲得的序列數(shù)據(jù)進行BLAST檢索。這種檢索的結(jié)果可以得到一系列的來自眾多來源的基因和DNA序列，其中以同源性的順序排列顯示與所查詢的序列(即，來自質(zhì)粒到曲線測序的數(shù)據(jù))的同源性。這些結(jié)果稱為"BLAST命中記錄(hit)"。如果測序完全順利，頂部的BLAST命中記錄將為"HomosapiensCysteineDioxygenaseExon…"。在BLAST輸出中也包括序列比對圖，其顯示査詢序列和對照序列之間的匹配緊密程度。這具有兩種重要作用首先，其可以顯示測序結(jié)果中存在的任何差異(由此可作為測序成功的量度)，其次，其可以顯示測序樣品中存在的任何多態(tài)性。這是本研究的重要目的為了鑒定對照CDO基因和在疾病癥狀中具有重要影響的疾病CDO基因之間的任何多態(tài)性。如果發(fā)現(xiàn)多態(tài)性能夠解釋類風濕性關(guān)節(jié)炎患者中CDO活性的下降，例如在活性位點區(qū)域的有害多態(tài)性，這距離解釋體內(nèi)觀察到現(xiàn)象(即，高血漿半胱氨酸水平)又近了一步。結(jié)果引物設(shè)計使用Primer3網(wǎng)絡(luò)工具(Primer3互聯(lián)網(wǎng)引物設(shè)計工具，http:〃frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3—www.cgi，為MassachusettsInstituteofTechnology(http:〃web.mit.edu/index.html)主辦)來設(shè)計用于PCR反應(yīng)的寡核苷酸引物。對于每一套引物，將基因的所述特定部分(例如，外顯子2、3或4)的內(nèi)含子和外顯子序列上載到Primer3中。然后Primer3將針對每一個外顯子組裝起數(shù)套可用的引物。而且還預(yù)測了額外的信息，如引物的解鏈溫度、它們的特異性。所用的前三套引物的結(jié)果和外顯子l引物的結(jié)果如圖3所示。PCR優(yōu)化PCR是一種特別靈敏的技術(shù)。其特別容易受到外源DNA的污染，反應(yīng)具有很多組分，這些組分的相對比例對反應(yīng)的成功具有很大的影響。要對這些變量進行試驗以確定最佳濃度。理論上，可以改變反應(yīng)的每一種組分，但是為本研究目的，只探究了關(guān)鍵的變量。以下是PCR反應(yīng)中的常量和變量因素的列表。常量7^DNA聚合酶濃度和體積，引物體積，緩沖液濃度和體積，氯化鎂濃度，模板DNA體積。變量引物濃度，引物序列，模板濃度，氯化鎂溶液體積，DMSO添加劑的有無。除了這些參數(shù)以外，在該研究中還使用了兩種不同的模板DNA，因此必須根據(jù)兩種模板來優(yōu)化用于擴增外顯子2、3和4的PCR條件。理想的是，不同模板可以在相同條件下得以成功擴增，但是在本情況下，發(fā)現(xiàn)對照DNA和類風濕性關(guān)節(jié)炎DNA對PCR擴增具有不同的要求(見下文結(jié)果)。瓊脂糖凝膠電泳分離為了評價PCR反應(yīng)的成功性，將10pl體積的PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進行電泳。發(fā)現(xiàn)2%瓊脂糖凝膠最適合本研究的PCR產(chǎn)物，因為它們主要是小分子(<300bp)，而且凝膠百分比越大，小分子分離越充分。還發(fā)現(xiàn)以120伏特進行凝膠電泳能夠在條帶分辨度和凝膠電泳花費的時間之間取得最佳平衡；在該電壓下跑凝膠大概需要75分鐘(數(shù)據(jù)未示出)。一旦上樣染料(橙G和甘油)從上樣孔開始遷移了四分之三的凝膠長度，就認為凝膠電泳結(jié)束。初始PCR測試使用典型程序(見材料與方法)和反應(yīng)組分嘗試進行擴增CDO外顯子的初始反應(yīng)顯示出極為有限的成功性，表明該擴增要求進行極大的優(yōu)化。電泳檢測顯示，在該反應(yīng)中沒有(或者極少)擴增到DNA，而且必須更換所提供的DNA梯度序列(在凝膠中沒有看到該梯度序列)。該凝膠上沒有DNA的結(jié)果暗示，對照模板DNA樣品不含有任何DNA。然而，這種可能可以排除，因為對照模板樣品的等分試樣在凝膠上遷移，這表明對照模板DNA樣品確實含有DNA。為了探究初始不成功的可能原因，圍繞針對所述3個CDO外顯子設(shè)計的特異性引物設(shè)計降落PCR程序。由于平均解鏈溫度為58。C(因此PCR退火溫度為53。C)，因此降落式程序通過53。C上下的一系列溫度下降，降到48。C的溫度。以下是所述程序。降落PCROl號程序<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>所述程序的應(yīng)用使得PCR獲得部分的成功，其中CDO外顯子3和4得到擴增，但是對外顯子2沒有成功。圖4顯示降落PCR產(chǎn)物的凝膠電泳。圖4顯示，對于外顯子3和4而言，PCR已經(jīng)成功，但是對于外顯子2沒有成功。檢查條帶可以發(fā)現(xiàn)，條帶解析得很差，并且在條帶本身以下顯示出彌散現(xiàn)象。這是由PCR反應(yīng)得到大于目標產(chǎn)物的非特異性產(chǎn)物引起的。該結(jié)果表明，應(yīng)該向PCR反應(yīng)中加入添加劑二甲亞砜(DMSO)。圖5顯示使用DMSO添加劑進行的首次PCR的結(jié)果；該結(jié)果顯示，外顯子2、3和4已經(jīng)得到擴增。條帶強度顯示溴乙錠和(隱含)該凝膠區(qū)域的DNA量的相對濃度。最亮的條帶是外顯子3的條帶，因此可以假定目前PCR對于外顯子3最為有效。圖11顯示來自擴增外顯子1時的PCR產(chǎn)物。氯化鎂濃度通過進行"鎂梯度"電泳，確定PCR混合物中的氯化鎂(MgCl2)溶液的最佳濃度。在此設(shè)立了眾多反應(yīng)，其中采用不同體積的MgCl2，并通過在瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物來評價其結(jié)果。通常，PCR反應(yīng)中的MgCl2體積范圍為1pl5^。圖6顯示使用對照DNA模板進行的首次鎂梯度電泳。由該初始結(jié)果可以看出，該反應(yīng)中擴增的DNA條帶在邊上較亮(表明DNA濃度較高)，其中鎂濃度為4^d或2^d。然而，差異非常小。并且大部分條帶發(fā)生彌散，表明沒有有效地進行反應(yīng)而獲得一系列的不同長度的產(chǎn)物。引物在本研究的整個過程中設(shè)計了數(shù)對引物，以鑒定出獲得最好的PCR結(jié)果的那套。這些引物都是采用Primer3(Primer3互聯(lián)網(wǎng)引物設(shè)計工具，http:〃frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3—www.cgi，為MassachusettsInstituteofTechnology(http:〃web.mit.edu/index.html主辦))互聯(lián)網(wǎng)工具來設(shè)計的。所有5套引物都進行了試驗。在優(yōu)化試驗的整個過程中，可以優(yōu)化外顯子3和4的擴增而無需設(shè)計新的引物，因為所進行的PCR具有足夠的一致性，因此不需要新的引物。但是PCR反應(yīng)的其他組分確實需要廣泛改變。外顯子2證明是最難擴增的外顯子。在整個PCR試驗中，外顯子3和4在其擴增中顯示出(一定程度)的一致性，雖然成功的水平不一樣。然而外顯子2通常難以預(yù)計反應(yīng)的效果如何，有時得到具有很高分辨率的緊密條帶，而有時卻得到較差的條帶，并且常常是根本沒有條帶。為了嘗試找到具有一貫性成功的PCR，設(shè)計了另外的兩套引物。在設(shè)計引物時，著眼于嘗試獲得具有與外顯子3和4引物相同的解鏈溫度的引物，如此可以使用相同的PCR程序?qū)λ?種外顯子進行擴增。使用如SEQIDNo.9和IO所示的PCR引物，按如前所述使用不同PCR程序擴增外顯子1。模板濃度以與氯化鎂和引物濃度完全相同的方式檢測模板DNA的濃度。使用不同濃度的模板DNA，采用眾多的反應(yīng)進行模板DNA梯度電泳。已經(jīng)明確的是，PCR是一種非常靈敏的技術(shù)(見前文部分)，因此理論上模板濃度不應(yīng)該是一種主要因素。模板DNA樣品以水性"母液"小體積獲得，從所述"母液"中獲取等分試樣并稀釋到所需要的量。還使用分光光度計對母液溶液的DNA含量進行定量。由這些溶液得到的稀釋液為1/2、1/10和1/20稀釋液。所進行的一個試驗是確定溶液中模板DNA的最佳濃度將模板DNA稀釋并使用這些不同的稀釋液進行PCR反應(yīng)。前期預(yù)測表明，由于PCR技術(shù)的靈敏性，模板濃度不應(yīng)該對PCR成功具有重大影響。表1未稀釋的模板DNA樣品的DNA含量。DNA含量值以ng/ml表示。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>降落PCR如上所述，研究早期采用降落PCR來進行擴增試驗以獲得一些前期的成功(見圖7)。由于這些前期成功，所以再次研究降落PCR作為在同一PCR程序中擴增外顯子2、3和4的可能手段。使用優(yōu)化的PCR組分(見表l)設(shè)計兩個降落PCR程序一個程序從55。C開始，每組循環(huán)降落1°C;另一個程序從54。C開始，每個循環(huán)降落2°C。這些反應(yīng)得到"混合"的結(jié)果，一組反應(yīng)非常有效有效地擴增了所有3個外顯子；而另一組反應(yīng)根本無效。認為最好是專注于針對每一個外顯子優(yōu)化不同的反應(yīng)，而不是試圖針對所有3個外顯子定制一個程序。圖7顯示了一個成功的降落PCR結(jié)果。這是最有希望的技術(shù)。優(yōu)化聚合酶鏈式反應(yīng)條件的總結(jié)由該研究中進行的所有試驗設(shè)計出了用于擴增智人(Z/omos"p/em)半胱氨酸雙加氧酶外顯子2、3和4的優(yōu)化方案。這些細節(jié)如表2所示。為了驗證這些成果，使用優(yōu)化條件建立PCR反應(yīng)，以擴增來自大量的對照和RA患者DNA樣品的所有外顯子。在大部分情況中，PCR是成功的。然后純化來自這些反應(yīng)的產(chǎn)物并提交測序。表2用于擴增智人CDO外顯子2、3和4的優(yōu)化條件的匯表模板外顯子引物<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>外顯子1使用外顯子-1特異性引物擴增，不同的反應(yīng)混合物和參數(shù)如前所述。PCR產(chǎn)物純化如前所述，使用QiagenPCR純化試劑盒分離和純化PCR產(chǎn)物。提交3.2pM的純化產(chǎn)物進行"質(zhì)粒到曲線"觀U序。采用該技術(shù)進行初始試驗之后，變得很顯然的是純化步驟可能己獲得分離的所有來自PCR反應(yīng)的DNA，但是所收集的DNA異源性太大，無法獲得準確的測序結(jié)果。采用這種方式通過提交純化的DNA所獲得的所有測序結(jié)果極差，無法得到準確的測序結(jié)果。序列分辨率差，導(dǎo)致通過BLAST檢索沒有找到優(yōu)異的匹配。這些結(jié)果促使采用更為周全的體系來分離和純化通過PCR擴增到的正確的DNA寡核苷酸。選擇來自瓊脂糖凝膠塊的凝膠提取來代替PCR產(chǎn)物純化。這獲得了顯著改善的測序結(jié)果。凝膠提取凝膠提取獲得了具有良好純度的DNA(如經(jīng)提取和純化的DNA的凝膠電泳所示)以及改善的測序結(jié)果。一個小的不足是由于DNA濃度降低的原因，來自凝膠提取樣品的條帶常常較淺，難以在紫外線下觀測(由于圖像差，沒有包括數(shù)據(jù))，最重要的是，由凝膠提取DNA獲得的測序結(jié)果的質(zhì)量要遠遠好于通過PCR產(chǎn)物純化獲得的質(zhì)量。由所述兩種方法獲得的序列的實例如圖8所示。測序和多態(tài)性分析初始測序嘗試由于諸多原因，主要是模板DNA(擴增自患者樣品)和引物的污染和不純等原因，成功極為有限。用于純化PCR產(chǎn)物的基本技術(shù)是采用使用離心柱的QiagenPCR純化試劑盒。使用該技術(shù)的測序結(jié)果的質(zhì)量差，幾乎沒有可用的序列。采用凝膠提取方法獲得明顯要好的結(jié)果，并且在稍微進一步優(yōu)化PCR條件后，得到了具有允許進行序列比較的適合質(zhì)量的測序結(jié)果。將序列數(shù)據(jù)與參考序列比較，以鑒定出單核苷酸多態(tài)性(SNP)，即序列中的單堿基對差異，從中構(gòu)建到可能的SNP記錄。在對照和RA序列之間存在大量的多態(tài)性。為了以更形象的形式提供數(shù)據(jù)，已經(jīng)將外顯子2、3和4的多態(tài)性突出顯示在圖9中的序列上。表3A、3B和3C在每個外顯子2、3和4中發(fā)現(xiàn)的SNP的匯表表3A外顯子SNP頻率CRA類型評述外顯子2+18N-T2V取代潛在假陽性外顯子2+19N-G2V取代潛在假陽性外顯子2+20N-G1V取代潛在假陽性外顯子2+21A-NBP1V添加潛在SNP外顯子2+31A-NBP1V添加潛在SNP外顯子2+35T-NBP1V添加潛在SNP外顯子2+40N-T1V取代潛在假陽性外顯子2+52C-NBP1添加潛在SNP外顯子2+61C-NBP1V添加潛在SNP外顯子2+66C-G1V取代潛在SNP外顯子2+68G曙T1V取代潛在SNP外顯子2+69C-NBP1V添加潛在SNP外顯子2+70T-NBP1V添加潛在SNP外顯子2+71G-NBP1V添加潛在SNP外顯子2+77N-NBP1V添加潛在假陽性外顯子2+84T-NBP1添加不處在外顯子中表3B<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>表3C外顯子SNP頻率CRA類型評述外顯子4+33C-A1V取代潛在SNP外顯子4+33T-A4V取代潛在SNP外顯子4+33N-A1VV取代潛在假陽性外顯子4+34C-G5V取代潛在SNP外顯子4+34T-G1VV取代潛在SNP外顯子4+34N-G2VV取代潛在假陽性外顯子4+34C-NBP1添加潛在SNP外顯子4+35N-G1V取代潛在假陽性外顯子4+37C-NBP1V添加潛在SNP外顯子4+42G掘P1V添加潛在SNP外顯子4+43N-NBP2V添加潛在假陽性外顯子4+43G-NBP1V添加潛在SNP外顯子4+43A-NBP4V添加潛在SNP外顯子4+44N-NBP1V添加潛在假陽性外顯子4+46A-C2V取代潛在SNP外顯子4+47A-C1V取代潛在SNP外顯子4+47N-C2取代潛在假陽性外顯子4+47A-NBP1V添加潛在SNP外顯子4+48N-T1V取代潛在假陽性外顯子4+76C-NBP1V添加潛在SNP外顯子4+102A-NBP1V添加潛在SNP同樣，對于外顯子l,本發(fā)明人鑒定到55個突變。通過進一步分析，他們將其中的3個鑒定為SNP。應(yīng)當注意的是，對于如以上表3中的表3A、3B和3C所示的取代，該術(shù)語與以前所使用的相反。例如，在表3B中，在外顯子3的位置15的取代被描述為+15T-A。使用標準術(shù)語(包括本申請先前使用的術(shù)語)，這應(yīng)當讀為15A-T。表3中的表3A、3B和3C內(nèi)部是一致的并且相互間也是一致的。為清楚目的，本申請整個主體部分已經(jīng)使用了標準術(shù)語，即使用標準術(shù)語描述所述優(yōu)選的多態(tài)性。所述結(jié)果表明，在所述外顯子遍布有大量SNP。外顯子2顯示出SNP基因座的廣泛分布，而在外顯子4中，它們局限于明顯要少的位點。然而，由測序收集到的數(shù)據(jù)必須經(jīng)過濾，因為那些潛在SNP中的一部分可能只是測序設(shè)備不能確認某個特定位置的核苷酸所發(fā)生的事件。除了潛在假陽性之外，鑒定出的其他潛在SNP可能是位于錯讀位置中，原因在于DNA序列中該錯讀位置上游的多態(tài)性。為了試圖對所述結(jié)果進行過濾，以得到高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，含有"N"的所有潛在SNP都被記為"潛在假陽性"，而其余的多態(tài)性應(yīng)被推定為真實的結(jié)果。已經(jīng)在3個所述外顯子的所記載DNA序列上對這些"潛在SNP"(見表3)進行作圖，并經(jīng)過翻譯以研究衍生自這些多態(tài)外顯子的蛋白所帶來的后果。圖9顯示，所述潛在SNP將對氨基酸序列造成巨大而(幾乎可以確定是)有害的變化。在大多數(shù)情況下，幾乎有一半的氨基酸序列不同于原始的氨基酸序列。在體內(nèi)，個體在其CDO外顯子中帶有所有這些多態(tài)性將幾乎可以確定會存在具有缺陷或障礙的CDO酶。應(yīng)當注意的是，術(shù)語"潛在假陽性"并不意味著本發(fā)明人已經(jīng)認為這些結(jié)果與RA檢測無關(guān)而放棄掉。相反，該術(shù)語的意思是強調(diào)那些標記為"潛在SNP"的結(jié)果更有可能指示RA的存在。過濾結(jié)果在經(jīng)過測序的每一個樣品中，沒有一個包含在此鑒定出的所有SNP。特定SNP出現(xiàn)的頻率非常重要，因為這可以指示CDO外顯子中的高度多態(tài)性基因座。表4中給出了SNP的頻率。為了得到與體內(nèi)情況更為相關(guān)的表征，在圖10中只單獨檢測并提供了最常出現(xiàn)的SNP(即，在本研究中出現(xiàn)超過一次)。表4在數(shù)據(jù)組中出現(xiàn)超過1次的潛在RASNP的簡表。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>討論本發(fā)明人已能夠成功地優(yōu)化用于對智人半胱氨酸雙加氧酶外顯子2、3和4進行擴增和測序的PCR程序。這是通過能夠顯示哪些條件讓各種外顯子可以在相對較短的時間內(nèi)得到擴增和測序的一系列PCR試驗來實現(xiàn)的。本發(fā)明人還建立了適合用于對智人半胱氨酸雙加氧酶外顯子1進行擴增和測序的PCR程序。在外顯子l、3和4中鑒定到各種多態(tài)性。化合物對CDO活性的影響本發(fā)明人認識到，CDO可能是參與類風濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵酶。本發(fā)明人也已經(jīng)確定TNF-a和TGF-P影響CDO活性(WilkinsonL丄禾卩WaringR.H.2002,見上文)。使用WilkinsonL丄禾bWaringR.H.(Toxicolinvitro(2002)，第481-483頁)所述的方法測定了IFN-y和TNF-a的效果分析。干擾素-y對CDO表達的效果如表5中所示。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>這表明可以用干擾素-y來提高CDO的表達，并因此增加可利用的硫酸鹽的量，從而減少類風濕性關(guān)節(jié)炎癥狀。而且，可以一起使用干擾素-y與已知能夠增加硫酸鹽生成的化合物來進一步改善類風濕性關(guān)節(jié)炎的治療，所述已知能夠增加硫酸鹽生成的化合物例如為半胱氨酸、甲硫氨酸、D-青霉胺、N-乙?；腚装彼?、S-谷酰基半胱氨酸、白介素-4和白介素-10、S-羧甲基半胱氨酸、S-甲基半胱氨酸。權(quán)利要求1.CDO介導(dǎo)的病況的診斷方法，所述方法包括(i)從個體獲取樣品；(ii)檢測是否存在變異性CDO或編碼CDO變體和/或CDO調(diào)節(jié)區(qū)變體的核酸；(iii)參考CDO基因和/或CDO基因的調(diào)節(jié)區(qū)中的多態(tài)性來確定所述個體的狀況。2.人中的CDO基因或CDO基因的調(diào)節(jié)序列中一個或多個多態(tài)性的鑒別方法，所述方法包括確定編碼至少一部分CDO基因和/或CDO調(diào)節(jié)區(qū)的核酸分子序列和參考CDO基因和/或CDO基因的調(diào)節(jié)區(qū)中的多態(tài)性來確定該人的狀況。3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述多態(tài)性選自<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>4.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述方法提供以下指示該人具有降低的CDO濃度和/或具有酶活性降低的CDO。5.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，所述方法用于鑒定個體或人患上類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和/或產(chǎn)生選自D-青霉胺和硫代蘋果酸金中的一種或多種藥物的副作用的傾向。6.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中含有多態(tài)性的所述核酸區(qū)域在鑒定該多態(tài)性之前通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)進行擴增。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述PCR是實時PCR(RT-PCR)。8.如權(quán)利要求15任一項所述的方法，其中通過選自以下的方法確定核酸序列ARMS-等位基因特異性擴增、等位基因特異性雜交、寡核苷酸連接測定和限制片段長度多態(tài)性(RFLP)。9.等位基因特異性探針或引物，所述等位基因特異性探針或引物能夠檢測出CDO基因或CDO調(diào)節(jié)序列多態(tài)性。10.如權(quán)利要求9所述的等位基因特異性探針或引物，所述等位基因特異性探針或引物能夠檢測出以下一個或多個處的多態(tài)性外顯子位置SNP類型外顯子1:+673A插入外顯子1:+697G插入外顯子1:+1103C-A取代外顯子3:+15A-T取代外顯子3:+16T-C取代外顯子3:+17A畫C取代外顯子3:+29T匿A取代外顯子3:+30G添加外顯子4:+33A-T取代外顯子4:+34G畫C取代外顯子4:+43A添加外顯子4:+46C-A取代11.一種診斷試劑盒，該診斷試劑盒包含一個或多個如權(quán)利要求8、9或10所述的探針或引物。12.長度至少為5個堿基的分離的核酸，所述核酸編碼選自以下多態(tài)性的CDO多態(tài)性或CDO調(diào)節(jié)區(qū)多態(tài)性①外顯子位置SNP類型外顯子l:+673A插入外顯子1:+697G插入外顯子h+1103C-A取代外顯子3:+15A響T取代外顯子3:+16T-C取代外顯子3:+17A隱C取代外顯子3:+29T畫A取代外顯子3:+30G添加外顯子4:+33A-T取代外顯子4:+34G-C取代外顯子4:+43A添加外顯子4:+46C畫A取代和(ii)與所述序列互補的序列。13.如權(quán)利要求11所述的分離的核酸分子，所述核酸分子編碼CDO或CDO片段。14.分離的CDO蛋白，所述分離的CDO蛋白能夠由權(quán)利要求11或12所述的核酸分子獲得。15.抗體，所述抗體能夠特異性地與權(quán)利要求13所述的蛋白結(jié)合，但是不與不含有CDO多態(tài)性的CDO蛋白結(jié)合。16.確定個體對CDO介導(dǎo)病況的傾向的方法，所述方法包括(i)從所述個體獲取樣品；和(ii)使用權(quán)利要求14所述的抗體檢測含有所述多態(tài)性的CDO的存在。17.確定化合物對CDO活性的影響的方法，所述方法包括(i)提供白細胞樣品；(ii)使所述白細胞與CDO底物和所述化合物接觸；和(iii)確定所述化合物對所述白細胞中的CDO使所述底物向可檢測產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的影響。18.鑒定用于治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的藥物候選物的方法，所述方法包括使用權(quán)利要求17所述的方法。19.治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的方法，所述方法包括施用藥學(xué)有效量的干擾素-y(IFN-力。20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述類風濕性關(guān)節(jié)炎為非HTLV-1相關(guān)的類風濕性關(guān)節(jié)炎。21.如權(quán)利要求19或19所述的方法，其中所述IFN-y與選自以下化合物中的至少一種化合物聯(lián)合施用半胱氨酸、甲硫氨酸、D-青霉胺、N-乙?；腚装彼帷?-谷?；腚装彼?、白介素-4和白介素-10。22.IFN-y，用于制造治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的藥物。23.IFN-Y與以下至少一種化合物的聯(lián)合，所述化合物選自半胱氨酸、甲硫氨酸、D-青霉胺、N-乙?；腚装彼帷-谷?；腚装彼?、白介素-4和白介素-10，用于制造治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的藥物。24.藥物組合物，所述藥物組合物包含IFN-Y與以下化合物的聯(lián)合，所述化合物選自半胱氨酸、甲硫氨酸、D-青霉胺、n-乙?；腚装彼帷-谷?；腚装彼?、S-羧甲基半胱氨酸、S-甲基半胱氨酸、白介素-4和白介素-10。全文摘要本發(fā)明涉及半胱氨酸雙加氧酶(CDO)中多態(tài)性的檢測和鑒定，該鑒別用于鑒定患者患上類風濕性關(guān)節(jié)炎和/或產(chǎn)生眾多藥物副作用的傾向；編碼所述多態(tài)性的核酸和分離的蛋白；用于CDO活性和用于影響CDO活性的化合物的鑒定的測定；另外，本發(fā)明還涉及干擾素γ任選聯(lián)合不同化合物在治療類風濕性關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用。文檔編號A61K38/20GK101243193SQ200680030364公開日2008年8月13日申請日期2006年7月20日優(yōu)先權(quán)日2005年7月20日發(fā)明者休·基孔齊,大衛(wèi)·鮑耶·拉姆斯登,羅斯瑪麗·霍普·韋林,露西·簡·威爾金森申請人:伯明翰大學(xué)