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D-半胱氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法

文檔序號:609861閱讀:620來源:國知局
專利名稱:D-半胱氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及D-半胱氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法。
背景技術(shù)
L-半胱氨酸是自然界存在的氨基酸,也是人體的非必需氨基酸之一,其鹽酸 鹽可以作為醫(yī)藥中間體、化妝品添加劑、食品添加劑、飼料添加劑等等,具有非 常廣泛的應(yīng)用。
近年來其光學(xué)異構(gòu)體D-半胱氨酸鹽酸鹽在醫(yī)藥方面的應(yīng)用也越來越得到人 們的重視,它是手性藥物第三代頭孢抗生素藥物頭孢米諾鈉的重要中間體。頭孢 米諾鈉在短時間內(nèi)就能顯示很強的殺菌力,適用于鏈球菌屬(腸球菌除外)、大 腸埃希菌(J.Biol.Chem. 2001, 276(44), 40864-40872)、肺炎克雷伯桿菌、變形 桿菌屬、流感嗜血桿菌、類桿菌屬引起呼吸系統(tǒng)感染、泌尿生殖系統(tǒng)感染、腹 腔感染、盆腔感染以及敗血癥等。
2001年,王明章(CN雨310, 2001; CN1404817, 2001)等將DL-半胱氨 酸及其鹽用于染發(fā)、燙發(fā)劑。其優(yōu)點是無刺激性、無致過敏性、無致突變性、無 異臭味、不損傷發(fā)質(zhì)等。用DL-半胱氨酸、DL-半胱氨酸及其鹽作染發(fā)劑,染發(fā) 牢度好,自然光亮;用它作燙發(fā)劑(冷燙液),頭發(fā)巻曲度好,發(fā)巻波浪持久, 發(fā)質(zhì)光亮自然,發(fā)型持久。2005年,王明彰等(CN1679502, 2005)將DL-半胱 氨酸或其鹽應(yīng)用于化妝品生產(chǎn)中。添加DL-半胱氨酸的化妝品能明顯起到潤膚、 美白、祛斑、消炎、抗痊瘡、抗皺、抗衰老、防脫發(fā)、生發(fā)、去頭屑的作用,而 且安全無副作用、見效快、制備方便。
根據(jù)目前文獻報導(dǎo),D-半胱氨酸的制備方法主要有以下四種 1、生物酶法
DL-S-節(jié)基-半胱氨酸鹽酸鹽水溶液中,加入一種從豬肝中提取的酶,37°C, 4h, L-S-節(jié)基-半胱氨酸被水解,而D-S-芐基-半胱氨酸依然留在溶液中。分離提 取,然后脫芐基得到D-半胱氨酸UP10001468, 1996)。此方法周期長,大約一 個星期;反應(yīng)底物濃度低,約0.1mol/L;提純困難,操作復(fù)雜,經(jīng)常以消耗掉一 種對映體為代價。2、 優(yōu)先結(jié)晶法
1986年,Chozo等(US 4613688, 1986)將DL-半胱氨酸鹽酸鹽一水合物
溶于35t:的水中,制成過飽和溶液,冷卻到3rc,加入D-半胱氨酸鹽酸鹽一水
合物,繼續(xù)冷卻到27.5'C,攪拌70min,過濾得到D-半胱氨酸鹽酸鹽一水合物。1987年,Tadashi等(Bulletin of the Chemical Society of Japan, 1987, 60 (9),3277-3283)將DL-半胱氨酸鹽酸鹽一水合物用濃氨水中和得到DL-半胱氨酸,然后與甲醛反應(yīng)生成DL-四氫噻唑-4-甲酸(DL-TCA),在40。C下形成150%過飽和溶液,加入晶種結(jié)晶,得到D-TCA,水解得到D-半胱氨酸,收率是2%。優(yōu)先結(jié)晶法制備D-半胱氨酸,收率低,難于操作,不適合工業(yè)化生產(chǎn)。
3、 化學(xué)拆分法
1986年,Nohira等(US 4621151, 1986)用氫氧化鈉中和DL-半胱氨酸鹽酸鹽為DL-半胱氨酸,然后與D-扁桃酸晶體形成非對映體化合物,加入D-半胱氨酸D-扁桃酸作為晶種,冷卻結(jié)晶、過濾后重結(jié)晶,用異丙醚萃取D-扁桃酸,過濾固體得到D-半胱氨酸,收率18%,光學(xué)純度80%。
Tomuro等(US 4736060, 1988)將DL-半胱氨酸和甲醛反應(yīng)得到DL-四氫噻唑-4-甲酸(DL-TCA),在其水溶液中加入光學(xué)活性的R-l-(l-萘基)-乙胺形成D-TCA和L-TCA的非對映體鹽,根據(jù)二者在溶劑中的溶解度不同,分別獲得D-TCA和L-TCA,并水解最終得到D-半胱氨酸和L-半胱氨酸。
2006年,馬云峰等(CN1876628, 2006)以DL-半胱氨酸為原料,以無機酸為溶劑,分別采用右旋二苯甲酰酒石酸(D-DBTA)和左旋二苯甲酰酒石酸(L-DBTA)為拆分劑,將DL-半胱氨酸拆分得到D-半胱氨酸和L-半胱氨酸。張濤等(精細(xì)與專用化學(xué)品,2006, 14 (6): 26-28)改進了 D-扁桃酸拆分DL-半胱氨酸制備D-半胱氨酸的方法,拆分收率達到25.6%。
4、 不對稱轉(zhuǎn)化法
不對稱轉(zhuǎn)化法是把L型氨基酸或DL型氨基酸直接轉(zhuǎn)化為D型氨基酸的技術(shù)。2007年,喻明軍等(應(yīng)用化工,2007, 36 (5): 488-490)在水楊醛存在下,使L-半胱氨酸、L-酒石酸和丙酮在乙酸中加熱,形成D-2, 2-二甲基四氫噻唑-4-羧酸-L-酒石酸鹽, 光學(xué)純度99%以上,收率65.6%。將該鹽在水溶液中水解得到D-半胱氨酸,收率(以L-半胱氨酸計)>50%,光學(xué)純度>99%。
發(fā)明內(nèi)容
D-半胱氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備過程中,反應(yīng)條件溫和,L-色氨酸酶專一性很強, 轉(zhuǎn)化率高,提取工藝簡單,且產(chǎn)生附加值高的L-色氨酸。本發(fā)明的目的在于避 免上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處而提供一種高效、低成本的D-半胱氨酸及L-色氨 酸的制備方法。
本發(fā)明可以通過以下技術(shù)方案來達到
D-半胱氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法,其步驟為
(1) 色氨酸酶基因工程菌菌株WW-4 (韋平和等,以L-半胱氨酸和吲哚酶 法合成L-色氨酸,藥物生物技術(shù),2000, 4.),在含有異丙基硫代半乳糖苷(IPTG, Sigma公司)或乳糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng),誘導(dǎo)產(chǎn)生高活力的色氨酸酶-,
(2) 采用游離細(xì)胞法,將含酶細(xì)胞或酶提取液與緩沖液配制的含有DL-半胱 氨酸的混合氨基酸或DL-半胱氨酸的轉(zhuǎn)化液混合后,再加入表面活性劑,在30 45 °C條件下進行酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
(3) 將反應(yīng)生成物進行分離,得到高純度的D-半胱氨酸,同時還得到L-色 氨酸。
上述步驟(1)中的培養(yǎng)基碳源采用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖和/或乳糖, 其濃度為1 20g/L,氮源采用有機氮源,如牛肉膏、酵母膏、玉米漿、蛋白胨、 豆餅水解液和/或蛋白質(zhì)水解物,其濃度為1 30g/L,加入IPTG或乳糖誘導(dǎo), 其濃度為0.05 10g/L。
上述步驟(2)的轉(zhuǎn)化液緩沖體系為磷酸緩沖液、硼酸緩沖液和碳酸緩沖 液,使轉(zhuǎn)化液pH7.5 9.5,最適轉(zhuǎn)化液pH8 9;在轉(zhuǎn)化液中加入表面活性劑, 如吐溫-80,十六烷三甲基溴化銨(CTAB),聚乙二醇辛基苯基醚(OP),其濃 度為0.005 5 g/L。
上述歩驟(3)中分離反應(yīng)體系中D-半胱氨酸和L-色氨酸的方法是采用等電 點結(jié)晶法或等電點結(jié)晶與離子交換樹脂分離相結(jié)合的方法。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點 (1)本發(fā)明采用色氨酸酶基因工程菌WW-4在優(yōu)選的培養(yǎng)基中培養(yǎng)可以高 產(chǎn)率的生成色氮酸酶,使反應(yīng)有非常高的轉(zhuǎn)化率和反應(yīng)速率,D-半胱氨酸及L-色氨酸的光學(xué)純度達到99%以上。
(2) 本發(fā)明采用游離細(xì)胞法轉(zhuǎn)化DL-半胱氨酸,同時制備得到D-半胱氨酸及L-色氨酸,原料價格低廉,操作簡便,大大提高反應(yīng)速率,簡化工藝流程。
(3) D-半胱氨酸和L-色氨酸的理化性質(zhì)差異很大,利用溶解度的差異就可以分離制備,成本低,工藝流程簡單,適合工業(yè)化生產(chǎn)。
(4) 具有原料來源豐富,價格低廉,轉(zhuǎn)化時間短,操作簡便,生產(chǎn)成本低等優(yōu)點。
具體實施方式
實施例一
1. 將1000mL發(fā)酵液離心得到的色氨酸酶基因工程菌22 g加入到0.1mol/L碳酸鈉緩沖液(pH9.5)配制的600mL轉(zhuǎn)化液中,轉(zhuǎn)化液為含15% DL-半胱氨酸鹽酸鹽(g/mL)、 33.5g吲哚和0.05。/。OP溶液(g/mL) 6mL, 37"C酶促反應(yīng)31h。反應(yīng)期間氮氣保護,反應(yīng)液中析出白色固體物,反應(yīng)體系中L-色氨酸濃度為8.8%,對L-半胱氨酸鹽酸鹽摩爾轉(zhuǎn)化率為91%。
2. 將反應(yīng)液4000rpm離心10min,收集濕細(xì)胞和白色固體混合物70 g,用350mL純水溶解固體混合物,滴加6mol/L NaOH調(diào)pH12~13 ,攪拌升溫到60-8CTC將固體L-色氨酸溶解完全,加活性炭脫色除菌體,濾液用6mol/L HC1調(diào)pH至5.9,酸化液冷卻至室溫,析出的結(jié)晶真空過濾,用少量純水洗滌,烘干得43.5gL-色氨酸。
3. 將550mL離心上清液與390mL L-色氨酸結(jié)晶母液合并,混合液用6mol/LHC1調(diào)pH至3.5,加純水稀釋到1600mL上氫型陽離子樹脂柱,吸附飽和后,4%氨水洗脫,分別收集洗脫液濃縮結(jié)晶、精制得L-色氨酸7.3g和D-半胱氨酸鹽酸鹽41.2g,結(jié)晶母液循環(huán)使用。
實施例二
1.將1000mL發(fā)酵液離心得到的色氨酸酶基因工程菌27g加入到0.1mol/L硼酸緩沖液(pH9.0)配制的600mL轉(zhuǎn)化液中,轉(zhuǎn)化液為含20% DL-半胱氨酸鹽酸鹽(g/mL)、 45g卩引哚和0.05%CTAB (g/mL) 6mL, 37。C酶促反應(yīng)33h。反應(yīng)期間氮氣保護,反應(yīng)液中析出白色固體物,反應(yīng)體系中L-色氨酸濃度為11.9%,對L-半胱氨酸鹽酸鹽摩爾轉(zhuǎn)化率為92%。2. 將反應(yīng)液4000rpm離心10min,收集濕細(xì)胞和白色固體混合物92 g,用 400mL純水溶解固體混合物,滴加6mol/L NaOH調(diào)pH12~l 3 ,攪拌升溫到60-80 °C 將固體L-色氨酸溶解完全,加活性炭脫色除菌體,濾液用6mol/L HC1調(diào)pH至 5.9,酸化液冷卻至室溫,析出的結(jié)晶真空過濾,用少量純水洗滌,烘干得60.2g L-色氨酸。
3. 將545mL離心上清液與460mL L-色氨酸結(jié)晶母液合并,混合液用6mol/L HCl調(diào)pH至3.5,加純水稀釋到1800mL上氫型陽離子樹脂柱,吸附飽和后,4% 氨水洗脫,分別收集洗脫液濃縮結(jié)晶、精制得L-色氨酸8.2g和D-半胱氨酸鹽酸 鹽56.2g,結(jié)晶母液循環(huán)使用。
實施例三
1. 將1000mL發(fā)酵液離心得到的色氨酸酶基因工程菌24g加入到0.1mol/L 醋酸鈉緩沖液(pH8.8)配制的600mL轉(zhuǎn)化液中,轉(zhuǎn)化液為含25% DL-半胱氨酸 鹽酸鹽(g/mL)、 56g吲哚和0.5%吐溫-80 (g/mL)溶液6mL, 37。C酶促反應(yīng)36h。 反應(yīng)期間氮氣保護,反應(yīng)液中析出白色固體物,反應(yīng)體系中L-色氨酸濃度為 13.8%,對L-半胱氨酸鹽酸鹽摩爾轉(zhuǎn)化率為85%。
2. 將反應(yīng)液4000rpm離心10min,收集濕細(xì)胞和白色固體混合物99 g,用 430mL純水溶解固體混合物,滴加6mol/L NaOH調(diào)pH12~l 3 ,攪拌升溫到60~80°C 將固體L-色氨酸溶解完全,加活性炭脫色除菌體,濾液用6mol/L HC1調(diào)pH至 5.9,酸化液冷卻至室溫,析出的結(jié)晶真空過濾,用少量純水洗滌,烘干得67.6g L-色氨酸。
3. 將540mL離心上清液與485mL L-色氨酸結(jié)晶母液合并,混合液用6mol/L HCl調(diào)pH至3.5,加純水稀釋到2000mL上氫型陽離子樹脂柱,吸附飽和后,4% 氨水洗脫,分別收集洗脫液濃縮結(jié)晶、精制得L-色氨酸10.2g和D-半胱氨酸鹽 酸鹽70.5g,結(jié)晶母液循環(huán)使用。
實施例四
1.將lOOOmL發(fā)酵液離心破壁得到的色氨酸酶提取液37 g加入到O.lmol/L 碳酸鈉緩沖液(pH9.5)配制的600mL轉(zhuǎn)化液中,轉(zhuǎn)化液為含10。/。DL-半胱氨酸 (g/mL)的毛發(fā)酸水解提取液(氨基酸總含量15%)、 29g吲哚和0.05% OP溶 液(g/mL) 6mL, 37"酶促反應(yīng)30h,反應(yīng)期間氮氣保護,反應(yīng)液中析出白色固體物,反應(yīng)體系中L-色氨酸濃度為7.6%,對L-半胱氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為91%。
2. 將反應(yīng)液4000rpm離心10min,收集濕細(xì)胞和白色固體混合物67 g,用350mL純水溶解固體混合物,滴加6mol/L NaOH調(diào)pH12~l 3 ,攪拌升溫到60~80°C將固體L-色氨酸溶解完全,加活性炭脫色除菌體,濾液用6mol/L HC1調(diào)pH至5.9,酸化液冷卻至室溫,析出的結(jié)晶真空過濾,用少量純水洗滌,烘干得332gL-色氨酸。
3. 將560mL離心上清液與395mL L-色氨酸結(jié)晶母液合并,混合液用6mol/LHCl調(diào)pH至3.5,加純水稀釋到1900mL上氫型陽離子樹脂柱,吸附飽和后,4%氨水洗脫,分別收集洗脫液濃縮結(jié)晶、精制得L-色氨酸10.2g和D-半胱氨酸鹽酸鹽35.7g,結(jié)晶母液循環(huán)使用。
實施例五
1. 將1000mL發(fā)酵液離心破壁得到的色氨酸酶提取液32g加入到0.1mol/L碳酸鈉緩沖液(pH9.5)配制的600mL轉(zhuǎn)化液中,轉(zhuǎn)化液為含7。/。DL-半胱氨酸
(g/mL)的羽毛酸水解提取液(氨基酸總含量10%)、 20.5g吲哚和0.5。/。吐溫-80(g/mL)溶液6mL, 37'C酶促反應(yīng)28h,反應(yīng)期間氮氣保護,反應(yīng)液中析出白色固體物,反應(yīng)體系中L-色氨酸濃度為5.2%,對L-半胱氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為88%。
2. 將反應(yīng)液4000rpm離心10min,收集濕細(xì)胞和白色固體混合物50 g,用300mL純水溶解固體混合物,滴加6mol/L NaOH調(diào)pH12~l 3 ,攪拌升溫到60~80°C將固體L-色氨酸溶解完全,加活性炭脫色除菌體,濾液用6mol/L HC1調(diào)pH至5.9,酸化液冷卻至室溫,析出的結(jié)晶真空過濾,用少量純水洗滌,烘干得22.2gL-色氨酸。
3. 將570mL離心上清液與345mL L-色氨酸結(jié)晶母液合并,混合液用6mol/LHC1調(diào)pH至3.5,加純水稀釋到1600mL上氫型陽離子樹脂柱,吸附飽和后,4%氨水洗脫,分別收集洗脫液濃縮結(jié)晶、精制得L-色氨酸6.2g和D-半胱氨酸鹽酸鹽25.7g,結(jié)晶母液循環(huán)使用。
權(quán)利要求
1、一種D-半胱氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法,其特征是由以下步驟構(gòu)成(1)具有高活力L-色氨酸酶的基因工程菌,在含有IPTG或乳糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng),產(chǎn)生高活力的L-色氨酸酶;(2)用游離細(xì)胞法,將含酶細(xì)胞或酶提取液與緩沖液配制的含有DL-半胱氨酸的混合氨基酸或DL-半胱氨酸鹽酸鹽的轉(zhuǎn)化液混合,再加入適量的吲哚、表面活性劑和磷酸吡哆醛,在30~45℃條件下進行酶促反應(yīng),將反應(yīng)生成物進行分離,得到高純度的D-半胱氨酸,同時還得到L-色氨酸。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述D-半胱氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法,其特征在于步驟(2) 的轉(zhuǎn)化液中含有DL-半胱氨酸的混合氨基酸來源于經(jīng)過分離提取的動物角蛋 白酸水解液,DL-半胱氨酸在總氨基酸中含量(w/w)為10% 90%,最適含量 范圍為40% 70%。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述D-半胱氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法,其特征在于步驟(2) 所用的DL-半胱氨酸或DL-半胱氨酸鹽酸鹽濃度為10g/L 500g/L,最適濃度 為50g/L 300g/L,緩沖液包括磷酸緩沖液、醋酸緩沖液、硼酸緩沖液或碳酸 緩沖液,使轉(zhuǎn)化液pH7.5 9.5,最適轉(zhuǎn)化液pH8 9。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的D-半胱氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法,其特征在于步驟(2) 所述的表面活性劑包括吐溫一80、十六垸基三甲基溴化銨和聚乙二醇辛基苯 基醚,其濃度(g/L)為0.005 5.0。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的D-半胱氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法,其特征在于步驟(2) 分離D-半胱氨酸和L-色氨酸的方法為等電點結(jié)晶法或等電點結(jié)晶與離子交 換樹脂分離相結(jié)合的方法。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域的D-半胱氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法。該制備方法采用DL-半胱氨酸作為原料,將具有高活力L-色氨酸酶的基因工程菌與含有DL-半胱氨酸的混合氨基酸或DL-半胱氨酸鹽酸鹽的轉(zhuǎn)化液混合,30~45℃下進行酶促反應(yīng),然后用等電點結(jié)晶法或等電點結(jié)晶與離子交換樹脂相結(jié)合的方法分離轉(zhuǎn)化產(chǎn)物,得到高純度D-半胱氨酸和L-色氨酸。該方法實現(xiàn)了D-半胱氨酸和L-色氨酸的同時生產(chǎn),具有原料價格低廉,操作簡便,轉(zhuǎn)化時間短,生產(chǎn)成本低優(yōu)點。
文檔編號C12P41/00GK101591693SQ200910032018
公開日2009年12月2日 申請日期2009年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月7日
發(fā)明者茜 劉, 劉均忠, 飛 張, 焦慶才, 凱 董, 趙根海 申請人:南京大學(xué)
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