本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體是涉及一種提高玉米籽粒大小的方法。

背景技術(shù)：

玉米是全世界最主要的禾谷類糧食和飼料作物之一，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)及食品行業(yè)。由于胚乳占玉米籽粒重量80％-85％左右，胚乳細(xì)胞的分裂和發(fā)育狀況決定著籽粒的重量和品質(zhì)。而植物的胚乳發(fā)育是一個(gè)高度程序化的過程，在多個(gè)層面上受到精確調(diào)控，其發(fā)育及調(diào)控機(jī)制是生殖與發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域的前沿科學(xué)問題。

由于胚乳發(fā)育對玉米籽粒形成的重要性，近些年來，玉米胚乳發(fā)育的分子機(jī)理研究逐漸得到國內(nèi)外研究者的關(guān)注。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)賴錦盛教授以及中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院張春義教授課題組分別研究發(fā)現(xiàn)，玉米胚乳的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中存在大量的新轉(zhuǎn)錄區(qū)域，且多為胚乳組織特異性表達(dá)，除貯藏蛋白基因外，仍有大量差異基因的表達(dá)(Lai et al.2004；Lu et al.2013)。除從全基因組水平的研究外，細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)逐漸成為人們探討玉米胚乳發(fā)育分子機(jī)理的研究熱點(diǎn)。Leiva-Neto等研究發(fā)現(xiàn)，在玉米胚乳中特異性表達(dá)CDKA1-DN顯性負(fù)相關(guān)等位基因，可使玉米胚乳胞內(nèi)復(fù)制水平降至50％左右(Leiva-Neto et al.2004)。Sabelli等發(fā)現(xiàn)CYCA1；3在玉米胚乳發(fā)育游離核期大量表達(dá)，而CYCB1；3，D5；1和D2；1在胚乳發(fā)育中期高表達(dá)，說明不同亞族CYCs在玉米胚乳發(fā)育的不同階段可能發(fā)揮不同的調(diào)控作用(Sabelli 2012)。同一課題組最近在PNAS雜志發(fā)表文章表明，在玉米胚乳發(fā)育的過程中，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白(RBR)可負(fù)向調(diào)節(jié)CDKA；1活性，通過RNAi手段下調(diào)RBR1基因的表達(dá)，可以促進(jìn)胚乳的細(xì)胞分裂和胞內(nèi)復(fù)制(Sabelli et al.2013)。通過以上研究分析可知，玉米胚乳存在大量組織特異性表達(dá)基因，玉米胚乳發(fā)育各個(gè)時(shí)期，細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)控蛋白的表達(dá)量及功能不盡相同。

細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)控制細(xì)胞的分裂，從而維持有機(jī)體的正常代謝和增殖，其核心成分是CDKs，這些激酶活性的周期性變化，控制著細(xì)胞周期進(jìn)程。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CDK inhibitors,CKIs)通過結(jié)合并抑制CDKs的活性來調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，在阻止細(xì)胞分裂、響應(yīng)環(huán)境信號等方面起著非常重要的作用(Morgan 1997)。植物CKIs與哺乳動(dòng)物Kip/Cip家族具有較高的同源性，因此植物CKIs命名為Kip-related protein，簡稱為KRPs。KRPs對植物胚乳發(fā)育過程的調(diào)控作用已得到初步研究。如等人研究發(fā)現(xiàn)，過量表達(dá)Orysa；KRP1基因促使胚乳細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制水平下降，水稻種子內(nèi)含物減少，胚乳細(xì)胞數(shù)量減少( et al.2006)。原位雜交分析表明Orysa；KRP3基因在水稻開花后第2天胚乳游離核期表達(dá)，但在開花后第5天胚乳細(xì)胞化期表達(dá)急劇下降，酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)Orysa；KRP3與Orysa；CKA1；1、Orysa；CKA2、以及Orysa；CYCD2；2互作，表明Orysa；KRP3可能參與調(diào)控水稻胚乳游離核期的細(xì)胞周期進(jìn)程(Mizutani et al.2010)。

綜合本領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀，KRPs在植物的不同組織及植物發(fā)育的不同階段發(fā)揮著極其重要的作用，在調(diào)控植物胚乳發(fā)育過程中所發(fā)揮的重要功能也越來越凸顯，但玉米胚乳游離核發(fā)育細(xì)胞周期進(jìn)程的分子調(diào)控機(jī)制尚不明朗，通過抑制玉米KRP家族基因提高玉米籽粒大小的方法未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種特異性抑制玉米KRP基因在玉米胚乳中表達(dá)的KRP-RNAi表達(dá)盒。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種含有特異性抑制玉米KRP基因在玉米胚乳中表達(dá)的KRP-RNAi表達(dá)盒的質(zhì)粒。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種含有特異性抑制玉米KRP基因在玉米胚乳中表達(dá)的KRP-RNAi表達(dá)盒的質(zhì)粒的細(xì)胞株系。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供含有特異性抑制玉米KRP基因在玉米胚乳中表達(dá)的KRP-RNAi表達(dá)盒的質(zhì)粒的細(xì)胞株系在提高玉米籽粒大小的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

特異性抑制玉米KRP基因在玉米胚乳中表達(dá)的KRP-RNAi表達(dá)盒，是由胚乳特異性啟動(dòng)子、SEQ ID No:1所示的核苷酸序列、SEQ ID No:3所示的核苷酸序列和SEQ ID No:1的反向序列組成，所述SEQ ID No:1所示的核苷酸序列、SEQ ID No:3所示的核苷酸序列和SEQ ID No:1的反向序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

胚乳特異性啟動(dòng)子的核苷酸序列優(yōu)選SEQ ID No:2所示。

含有上述特異性抑制玉米KRP基因在玉米胚乳中表達(dá)的KRP-RNAi表達(dá)盒的質(zhì)粒。

含有特異性抑制玉米KRP基因在玉米胚乳中表達(dá)的KRP-RNAi表達(dá)盒的質(zhì)粒的宿主菌。

含有特異性抑制玉米KRP基因在玉米胚乳中表達(dá)的KRP-RNAi表達(dá)盒的質(zhì)粒的宿主菌在提高玉米籽粒大小的應(yīng)用，包括如下步驟：利用權(quán)利要求4所述宿主菌對玉米進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化操作，遺傳篩選得到基因組含有所述KRP-RNAi表達(dá)盒的、提高玉米籽粒大小的轉(zhuǎn)基因玉米株系。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明利用RNAi技術(shù)，構(gòu)建了含有特異性抑制玉米KRP基因在玉米胚乳中表達(dá)的KRP-RNAi表達(dá)盒的植物雙元表達(dá)質(zhì)粒,將此質(zhì)粒通過宿主菌轉(zhuǎn)化玉米，成功抑制了KRP基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)基因株系顯著提高了玉米籽粒大小，提高了玉米植株的豐產(chǎn)性，且對植株形態(tài)特征和生育期無影響，在玉米育種中具有重要意義和有良好的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1為從玉米葉片中克隆SEQ ID No:1所示的KRP基因片段。1：空白對照，2：PCR產(chǎn)物，M：DNA marker III。

圖2為重組質(zhì)粒用PstI酶切結(jié)果。1-5為質(zhì)粒，M：DNA marker III。

圖3為農(nóng)桿菌菌落PCR檢測結(jié)果。M：DNA marker III，1:C58陰性對照，2：質(zhì)粒陽性對照，3-10：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌落。

圖4為轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA的PCR檢測，M：DNA marker III，1:野生型陰性對照，2：質(zhì)粒陽性對照，3-8：轉(zhuǎn)基因陽性植株L1-L6。

圖5為轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA的KRP基因表達(dá)水平檢測，M：DNA marker III，1:野生型對照，2-7：轉(zhuǎn)基因陽性植株L1-L6。

圖6為轉(zhuǎn)基因玉米籽粒大小與非轉(zhuǎn)基因玉米籽粒對比圖，A為玉米轉(zhuǎn)基因株系L2籽粒，B為非轉(zhuǎn)基因玉米籽粒。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

B73玉米為商品化玉米自交系。

實(shí)施例1

玉米總RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄。

所用儀器，玻璃器皿用180℃烘烤4h，塑料器皿，如槍頭，離心管等可用0.1％DEPC浸泡過夜，再高壓滅菌(121℃，20min)，烘干備用。

以試劑盒RNAeasy kit(Qiagen)從100mg新鮮B73玉米葉片中提取總RNA。以1μg RNA為模板，用iScript^TM cDNA Synthesis Kit(Bio-Rad)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA第一鏈，反應(yīng)體系如下：

5X iScript Reaction Mix：4μl

Transcriptase：1μl

RNA：15μl

實(shí)施例2

KRP基因CDS部分片段的克隆。

根據(jù)玉米KRP基因序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(GenBank accession number NM_001112308)，擴(kuò)增其CDS中340bp片段為KRP-RNAi表達(dá)盒中的正向序列即SEQ ID No:1核苷酸序列。

引物序列：

SEQ ID NO.4所示上游引物為：5'-GGGCCCCTCGAGTGCAAGGCGTCGTCTCCCTG-3'

SEQ ID NO.5所示下游引物為：5'-GGGCCCAGATCTTCTCGAGCCTCCGGTTCCTT-3'。

PCR反應(yīng)體系：

10X Buffer：5μl

2.5mM dNTP(超純)：4μl

引物(Forward)：1μmol/L

引物(Reverse)：1μmol/L

模板(cDNA第一鏈)：1μl

Pfu DNA聚合酶：1U

加水補(bǔ)至50μl

PCR程序：

94℃預(yù)變性 5min

94℃變性 30s

58℃退火 30s

72℃延伸 1min

30個(gè)循環(huán)

72℃延伸 8min

取4μL產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測，序列測定由Invitrogen公司完成，PCR產(chǎn)物檢測結(jié)果如圖1所示。

實(shí)施例3

KRP基因CDS部分片段(SEQ ID No:1所示的核苷酸序列)與載體連接

將實(shí)施例2獲得的PCR產(chǎn)物按以下步驟進(jìn)行純化：

1.加與產(chǎn)物等體積的氯仿，劇烈混勻，13000r/min，離心10min。

2.取上清，加1/10體積的NaAc(3M)，混勻。

3.加總體積10/3體積的無水乙醇，-20℃沉淀3h，然后12000r/min離心10min。

4.加30μl去離子H₂O溶解沉淀。

用XhoI和BglII兩個(gè)限制性內(nèi)切酶將純化的PCR產(chǎn)物和載體pUCCRNAi分別進(jìn)行酶切過夜(37℃)，反應(yīng)體系如下：

DNA：15μl

H-Buffer：2μl

H₂O：2μl

XhoI：0.5μl

BglII：0.5μl

將以上酶切好的產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)：

兩個(gè)酶切產(chǎn)物65℃加熱30min終止反應(yīng)。瓊脂糖凝膠電泳檢測，定量分析，使PCR產(chǎn)物量與質(zhì)粒載體量比例為10:1，進(jìn)行連接反應(yīng)(16℃，6h)。

反應(yīng)體系如下：

PCR產(chǎn)物：13μl

質(zhì)粒：3.5μl

T4DNA ligase Buffer：2.5μl

T4DNA ligase：1μl

ATP：2.5μl

H₂O：2.5μl

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli：

1.取出制備好的感受態(tài)細(xì)胞于冰上化凍后，加入連接產(chǎn)物，輕輕搖勻后在

冰上放置30min。

2.移至42℃水浴中熱激90s，再迅速放回冰上冷卻1min。

3.加入200μl不含抗生素的液體培養(yǎng)基于37℃振蕩培養(yǎng)45min。

4.取100μl菌液涂布于含氨芐青霉素(Amp)的篩選平板上，置37℃下培養(yǎng)12h。

5.從平板上挑取抗性菌落進(jìn)行鑒定和保存。

連接產(chǎn)物鑒定：

挑取抗性菌落，放在含Amp 100mg/L LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，在進(jìn)行酶切驗(yàn)證。得到連接KRP基因CDS部分片段(340bp)的pUCCRNAi命名為pUCCRNAi-sense。

實(shí)施例4

反向KRP 340bp片段(SEQ ID No:1的反向序列)與pUCCRNAi-sense連接

將pUCCRNAi-sense，再進(jìn)行KRP 340bp片段的反向連接。

用BamHI和SalI兩個(gè)限制性內(nèi)切酶將純化的反向KRP 340bp片段的PCR產(chǎn)物和載體pUCCRNAi-sense分別進(jìn)行酶切過夜(37℃)，反應(yīng)體系如下：

質(zhì)粒載體：

DNA：15μl

H-Buffer：2μl

H₂O：2μl

BamHI：0.5μl

SalI：0.5μ

PCR產(chǎn)物：

DNA：15μl

H-Buffer：2μl

H₂O：2μl

BamHI：0.5μl

SalI：0.5μl

連接、轉(zhuǎn)化和鑒定過程與實(shí)施例3一致。

將連有正、反KRP片段的質(zhì)粒命名為pUCCRNAi-sense-antisense。

實(shí)施例5

將中間序列SEQ ID No:3與pUCCRNAi-sense-antisense連接

根據(jù)SEQ ID No:3所示的核苷酸序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，擴(kuò)增出兩端含有BglII和BamHI酶切位點(diǎn)核苷酸序列。

引物序列：

SEQ ID NO.6所示上游引物為：5'-GGGCCCAGATCTGCGCCTTGTGAGCACGTTT-3'

SEQ ID NO.7所示下游引物為：5'-GGGCCCGGATCCTCTCGAGCCTCCGGTTCCTT-3'。

用BglII和BamHI兩個(gè)限制性內(nèi)切酶將純化的PCR產(chǎn)物和載體pUCCRNAi-sense-antisense分別進(jìn)行酶切過夜(37℃)，反應(yīng)體系如下：

質(zhì)粒載體：

DNA：15μl

H-Buffer：2μl

H₂O：2μl

BamHI：0.5μl

BglII：0.5μ

PCR產(chǎn)物：

DNA：15μl

H-Buffer：2μl

H₂O：2μl

BamHI：0.5μl

BglII：0.5μl

連接、轉(zhuǎn)化和鑒定過程與實(shí)施例3一致。

將連有正、反KRP片段以及中間序列的質(zhì)粒命名為pUCCRNAi-sense-intron-antisense。實(shí)施例6

將pCAMBIA2300載體與胚乳特異性啟動(dòng)子的核苷酸序列SEQ ID No:2連接

根據(jù)SEQ ID No:2所示的核苷酸序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，擴(kuò)增出兩端含有BglII和BamHI酶切位點(diǎn)核苷酸序列。

引物序列：

SEQ ID NO.8所示上游引物為：5'-GGGCCCAGATCTGTTAACAGACCCGCCTCATT-3'

SEQ ID NO.9所示下游引物為：5'-GGGCCCGGATCCCATTGTTGGTACACTATTGT-3'。

用BglII和BamHI兩個(gè)限制性內(nèi)切酶將純化的PCR產(chǎn)物和載體pCAMBIA2300分別進(jìn)行酶切過夜(37℃)，反應(yīng)體系與實(shí)施例5一致，連接、轉(zhuǎn)化和鑒定過程與實(shí)施例3一致。

將連有胚乳特異性啟動(dòng)子核苷酸序列SEQ ID No:2的pCAMBIA2300質(zhì)粒命名為pCAMBIA2300-Pzein。

實(shí)施例7

將sense-intron-antisense連接到表達(dá)載體pCAMBIA2300-Pzein中。

將質(zhì)粒pUCCRNAi-sense-intron-antisense和pCAMBIA2300-Pzein分別用PstI酶切(37℃，過夜)。

DNA：50μl(兩個(gè)質(zhì)粒，各取25μl)

H-Buffer：20μl

H2O：128μl

PstI：2μl

兩個(gè)酶切產(chǎn)物65℃加熱30min終止反應(yīng)。

將質(zhì)粒pUCCRNAi-sense-intron-antisense切下的約900bp片段切膠回收，根據(jù)試劑盒說明書操作(Takara膠回收試劑盒)。

1.在紫外光源凝膠成像系統(tǒng)保護(hù)罩下，切取含DNA片段的瓊脂糖，按切取重量：溶膠液體積為1:3(100mg：300μL)的比例加入Extraction Buffer。

2. 65℃水浴8min，至膠完全溶化。

3.將溶液置于離心柱中，靜置1min，6000r/min離心30s。

4.棄去液體，在離心柱中加入500μL Washing Buffer，12000r/min離心30s，棄去液體。

5.在離心柱中加入650μL Washing Buffer，12000r/min離心30s，棄去液體。

6.重復(fù)步驟5。

7.12000r/min離心1min，甩干剩余液體。

8.加入20μL TE，靜置2min，12000r/min離心1min即為回收的DNA。

將酶切后的質(zhì)粒pCAMBIA2300-Pzein去磷酸化，37℃，1h，反應(yīng)體系如下：

10X CIAP Buffer：10μl

CIAP：2μl

質(zhì)粒：50μl

H₂O：38μl

去磷酸化產(chǎn)物75℃加熱10min終止反應(yīng)，和切膠回收的900bp片段進(jìn)行連接，16℃，6h，體系如下：

900bp片段：10μl

去磷酸化質(zhì)粒：9μl

T4DNA ligase Buffer：2.5μl

T4DNA ligase：1μl

ATP：2.5μl

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)菌，提取質(zhì)粒進(jìn)行PstI酶切鑒定，結(jié)果如圖2所示，1-5號為含有目基因的陽性質(zhì)粒，將得到的新質(zhì)粒命名為pCAMBIA2300-Pzein-sense-intron-antisense，其中Pzein-sense-intron-antisense的即為KRP-RNAi表達(dá)盒。

sense-intron-antisense為發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

實(shí)施例8

工程菌的制備，將含有KRP-RNAi表達(dá)盒的pCAMBIA2300-Pzein-sense-intron-antisense轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌C58中。

1.從–80℃取出C58感受態(tài)，置于冰上，緩慢融化。

2.將2μl植物表達(dá)載體質(zhì)粒DNA加入到200μl農(nóng)桿菌C58感受態(tài)細(xì)胞中，用移液器混勻。

3.轉(zhuǎn)移至電擊杯中，置冰上放置。

4.設(shè)置好電擊轉(zhuǎn)化儀參數(shù)，25μF，400olm，1500V，時(shí)間為5ms，電擊轉(zhuǎn)化。

5.室溫靜置2min后加入1mL YEB培養(yǎng)液，28℃，200r/min培養(yǎng)3h。

6.離心收集菌液，沉淀用200μL dd H₂O懸浮，將菌體涂布于含100mg/L Ka YEB平板上，28℃培養(yǎng)48h，直至長出清晰可見的單菌落。

7.挑取單克隆菌落，并做好標(biāo)記，將菌落分別溶于30μL無菌水中，煮沸10min，取上述菌液1μL作為模板，用克隆KRP片段的引物，進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如圖3所示，3-10號農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌落為陽性菌株，得到含有pCAMBIA2300-Pzein-sense-intron-antisense質(zhì)粒的C58農(nóng)桿菌，即得到含有KRP-RNAi表達(dá)盒的宿主菌。

實(shí)施例9

玉米遺傳轉(zhuǎn)化。

將B73玉米未成熟胚愈傷組織浸入制備好的農(nóng)桿菌液(OD600約為0.8)中，浸6-8min，使愈傷組織充分接觸菌液，取出，用無菌的濾紙吸凈多余的菌液后，正面朝下放入MS培養(yǎng)基中，25℃暗培養(yǎng)3d，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到新配制MS培養(yǎng)基中，兩周換一次培養(yǎng)基，等小芽從愈傷上長出來到1cm左右，切出小芽移到1/2MS培養(yǎng)基中。

實(shí)施例10

轉(zhuǎn)基因玉米移栽。

將在生根培養(yǎng)基中生長良好的轉(zhuǎn)化植株去除封口膜，人工氣候箱內(nèi)煉苗3～5天，洗凈培養(yǎng)基，種植在經(jīng)過滅菌處理的蛭石中，人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)，控制適當(dāng)?shù)臐穸?70％)、溫度25℃和光照條件(16h光照/8h黑暗)，至健壯苗種植到溫室中。

實(shí)施例11

轉(zhuǎn)基因植物檢測。

1.取植物新鮮葉片約1g放入研缽中，加300μL CTAB提取液，充分研磨。

2.混勻，于65℃溫育1h。

3.加等體積的氯仿/異戊醇(24:1)，輕輕地顛倒混勻，室溫下12000r/min離心10min。

4.取上清，加等體積異丙醇，會出現(xiàn)絮狀沉淀，室溫下12000r/min離心10Min。

5.棄上清，75％乙醇清洗2次。

6.烘干沉淀，溶于50μL dd H₂O中備用。

7.將基因組DNA進(jìn)行PCR檢測，通過選用npt II為目的片段設(shè)計(jì)引物。

SEQ ID NO.10所示上游引物為：5'-TATTCGGCTATGACTGGGCAC-3'

SEQ ID NO.11所示下游引物為：5'-GTCGATGAATCCAGAAAAGCG-3'。

結(jié)果如圖4所示，轉(zhuǎn)基因L1-L6株系玉米基因組DNA的PCR檢測為陽性，基因組含有KRP-RNAi表達(dá)盒。

實(shí)施例12

半定量PCR檢測KRP基因表達(dá)水平。

1.轉(zhuǎn)基因玉米總RNA提取

提取方法同上述，嚴(yán)格按照說明書，所需槍頭和離心管均從公司購買進(jìn)口RNase-free產(chǎn)品，確保提取RNA無降解。提取RNA進(jìn)行電泳檢測，測定OD260、280，初步定量。

2.cDNA第一鏈合成

取相同濃度的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，cDNA進(jìn)行電泳檢測，定量。

3.半定量PCR

取相同濃度的cDNA第一鏈進(jìn)行PCR，引物：同實(shí)施例2引物，即SEQ ID NO.4所示上游引物和SEQ ID NO.5所示下游引物。

PCR反應(yīng)體系為：

10X Buffer 2.5μl

2.5mM dNTP 2μl

引物(Forward) 1μmol/L

引物(Reverse) 1μmol/L

cDNA第一鏈 1μl

普通Taq酶 0.5U

總體積 25μl

PCR程序：

94℃預(yù)變性 5min

94℃變性 30s

58℃退火 30s

72℃延伸 45s

72℃延伸 8min

循環(huán)數(shù)為25、27和30個(gè)梯度。結(jié)果如圖5所示，轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA的KRP基因表達(dá)水平明顯降低。說明本發(fā)明KRP-RNAi表達(dá)盒可以發(fā)揮抑制KRP基因表達(dá)的作用。

實(shí)施例13

轉(zhuǎn)基因玉米T1代植株的栽培及籽粒收獲

將經(jīng)過驗(yàn)證的轉(zhuǎn)基因玉米L2株系的種子在天津大學(xué)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)基地于5月份進(jìn)行播種，7-8月份進(jìn)行套袋授粉，11月份進(jìn)行籽粒的收獲，如圖6所示，轉(zhuǎn)基因玉米株系的籽粒大小要大于對照非轉(zhuǎn)基因玉米株系的籽粒大小。提高了玉米植株的豐產(chǎn)性，且對植株形態(tài)特征和生育期無影響，在玉米育種中具有重要意義和有良好的應(yīng)用價(jià)值。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津大學(xué)

<120> 特異性抑制玉米KRP基因在玉米胚乳中表達(dá)的KRP-RNAi表達(dá)盒及應(yīng)用

<130>

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 340

<212> DNA

<213> zea mays

<400> 1

atgggcaagt acatgcgcaa ggccaaggct tccagcgagg ttgtcatcat ggatgtcgcc 60

gccgctccgc tcggagtccg cacccgagcg cgcgccctcg cgctgcagcg tctgcaggag 120

cagcagacgc agtgggagga aggtgctggc ggcgagtacc tggagctaag gaaccggagg 180

ctcgagaagc tgccgccgcc gccggcgacc acgaggaggt cgggcgggag gaaagcggca 240

gccgaggccg ccgcaactaa ggaggctgag gcgtcgtacg gggagaacat gctcgagttg 300

gaggccatgg agaggattac cagggagacg acgccttgca 340

<210> 2

<211> 1452

<212> DNA

<213> zea mays

<400> 2

gttaacagac ccgcctcatt tttgtcaagc aaacaagaac cccttatata tcaaagagta 60

gtggtttgaa tttgtctaat atgaagttta acgggcttgg ctcatttaaa gtatttaata 120

attctgaaag acaagattaa actaactatg tatgatcctt tagcacgtta cagatggtcg 180

atgggcaagt tacatggttt atatagatgg acctatctat attccttcag tggttgagaa 240

aaaggtaaag gtgtgtccac actcacgtgc tcggctgcct ccgccgagac gaggcatggc 300

gttgcaaggt gaggcatggc atggtgtagc acgatagcag tcatggtcgt ggcacagtgt 360

agcattgctg tggatagata gataaactat tgttgtagtt agagtgcatg agtttttgaa 420

tgcaacacta gaattttcac aatttaactt aattaagaag ttatatcttg atgacataga 480

gttacctgac cattgatctc gcatgccctt ttagctctct cgttctctag actcaccctg 540

actatttaag tctcttgact cgccaatata aacaccatcc tatcatttgc tctcgaatac 600

ttctgtgtca caactcaact gtcagatgag tactccatta cagcacttac gtacacgagt 660

tctatgagag caggcctcca aaatgaatat ctacttagat gaaggacgac aatcgtgttc 720

tagggaaata tcagcgacac aactccttac ttccttcgct tcttcctagt gttttttgtt 780

gtgattgagt cgacacagca acaacactgc actattacaa ccagtacgac tatatcaact 840

agcaatgtct tccttatatg ttactattta ttttgcacat attcattatg tttaaatcac 900

ataggcacct ttctattggc atcaaaaaat tagtatcaac tttctagatt aaaatgaaac 960

taaaagtaca taaatttcta tcggtgggga tcgagtgatt ctttaaaccg attattacac 1020

aagttaacca cactaaaatt aacattggtg aatcgtgcca tgattttttt tctagtggaa 1080

aatagccaaa ccaagcaaca catatgtggc tatcgttaca catgtgtaaa ggtattgcat 1140

cacactattg tcacccatgt atttggacaa taccgagagg aaaaaccact tatttattgt 1200

attttatcaa gtttgtcttg cttacgtata aattataacc caacaaagta atcactaaat 1260

gtcaaaacca actagatacc atgtcatctc taccttatct tactaatatt ctttttgcaa 1320

aatccaaaat taatcttgca caagcacaag gactgagatg tgtataaata tctcttaaat 1380

tagtagctaa tatatcgcac atattattta gaccaactag caacatagaa gcacaatagt 1440

gtaccaacaa tg 1452

<210> 3

<211> 199

<212> DNA

<213> zea mays

<400> 3

tgcgccttgt gagcacgttt ggatccgcga aggcaatcgc tcggatcttc ccctaaccca 60

acccgggaac ggaccggagg gaaccgcagc atgaggaatg tccgcgtctc gtcgcaaggc 120

tcgttttgag ttttgggtca tagggcgggc agtccggggc acaagggtcc tggtactacc 180

caggtgcgaa gaaccccgg 199

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gggcccctcg agtgcaaggc gtcgtctccc tg 32

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gggcccagat cttctcgagc ctccggttcc tt 32

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

gggcccagat ctgcgccttg tgagcacgtt t 31

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

gggcccagat cttctcgagc ctccggttcc tt 32

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

gggcccagat ctgttaacag acccgcctca tt 32

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

gggcccggat cccattgttg gtacactatt gt 32

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

tattcggcta tgactgggca c 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

gtcgatgaat ccagaaaagc g 21