本發(fā)明涉及病毒基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備包裹鯉皰疹病毒II型抗原的多角體的方法。

背景技術(shù)：

異育銀鯽鰓出血病由鯉皰疹病毒II型（Cyprinid herpesvirus II，CyHV-2）感染引起，目前有關(guān)該病的防治主要從增強(qiáng)魚的免疫能力、減少應(yīng)激反應(yīng)、混養(yǎng)、減少養(yǎng)殖密度、加強(qiáng)疾病的檢測(cè)、及時(shí)去除患病魚等方面進(jìn)行控制。一般認(rèn)為免疫預(yù)防是魚類病毒性疾病防治最有效的方法之一。目前，魚類的疫苗主要有滅活疫苗（死疫苗）、減毒疫苗、亞單位疫苗、DNA疫苗以及蛋白亞單位/DNA聯(lián)合疫苗。滅活疫苗制備相對(duì)較容易，但免疫原性差，需含足夠量的滅活病毒才能引起有效免疫應(yīng)答，且該類疫苗不能進(jìn)入主要組織相容性復(fù)合體I(MHC I)類抗原呈遞途徑,不能有效誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）反應(yīng),因此，免疫效果相對(duì)不理想、免疫力持久性差。減毒疫苗免疫力強(qiáng)、作用時(shí)間長，但減毒疫苗生產(chǎn)成本高，有毒力返祖現(xiàn)象，安全性較差，有回復(fù)致病性的潛在危險(xiǎn)。亞單位疫苗具有抗原性強(qiáng)、保護(hù)時(shí)間長、安全性好、制備和運(yùn)輸方便等優(yōu)點(diǎn)，但是存在抗原表位丟失的不足，因此，新一代疫苗的研發(fā)方向是DNA疫苗；但至今沒有有效的CyHV-2的DNA疫苗。

通過基因工程生產(chǎn)的多抗原蛋白亞單位聯(lián)合疫苗可以防治因病毒突變而導(dǎo)致的免疫逃逸，免疫保護(hù)效果好。目前基因工程疫苗絕大多數(shù)是通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)，盡管大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白技術(shù)相對(duì)較成熟，但獲取大量的純重組蛋白仍存在缺陷。另外由于大腸桿菌不具有翻譯后的修飾系統(tǒng)，往往導(dǎo)致重組蛋白的免疫原性較差、且細(xì)胞周質(zhì)中含有種類繁多的內(nèi)毒素。因此，有必要尋找新的表達(dá)系統(tǒng)。

免疫的劑型不僅影響免疫效果，也影響免疫保護(hù)期。已有研究表明，海藻酸鈉載藥微球作為新型緩控釋制劑，可增強(qiáng)抗原的免疫活性。但海藻酸鈉抗原微球的制備工藝較復(fù)雜，影響因素較多；質(zhì)型多角體是昆蟲質(zhì)型多角體病毒在感染細(xì)胞內(nèi)形成的一種包埋有病毒粒子的蛋白質(zhì)多面體結(jié)晶。

因此，通過桿狀表達(dá)系統(tǒng)制備包裹鯉皰疹病毒II型抗原的多角體有可能作為良好的疫苗，但到目前為止，還沒有相關(guān)研究報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的發(fā)明目的是提供一種基于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備包裹鯉皰疹病毒II型抗原的多角體的方法；用質(zhì)型多角體蛋白包裹的抗原穩(wěn)定性好，不易被降解；純化包裹在質(zhì)型多角體內(nèi)的抗原蛋白的方法簡便；無核酸污染，生物安全性較高。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種基于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備包裹鯉皰疹病毒II型抗原的多角體的方法，包括下列步驟：

（1）將家蠶質(zhì)型多角體病毒多角體蛋白基因克隆進(jìn)pFastBacDual質(zhì)粒的EcoRI 和 XbaI之間，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移pFastBacDual-polh質(zhì)粒；

（2）合成融合DNA序列；所述融合DNA序列如SEQ ID NO:3所示；

（3）將步驟（2）的融合DNA序列克隆進(jìn)步驟（1）的pFastBacDual-polh質(zhì)粒的XhoI和KpnI位點(diǎn)，獲得pFast-VP3-cyHV-polh質(zhì)粒；

（4）將步驟（3）的pFast-VP3-cyHV-polh質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含培養(yǎng)基的瓊脂平板上，于37℃培養(yǎng)，挑取白色菌落，提取重組Bacmid-VP3-cyHV-polh DNA；

（5）將步驟（4）的重組Bacmid-VP3-cyHV-polh DNA轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，26～27℃培養(yǎng)，細(xì)胞發(fā)病后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，獲重組病毒BmNPV- VP3-cyHV-polh；

（6）將步驟（5）的重組病毒BmNPV-VP3-cyHV-polh接種家蠶或家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，發(fā)病后，收集家蠶血淋巴或家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，純化多角體，獲包裹鯉皰疹病毒II型抗原的多角體。

上述技術(shù)方案中，步驟（1）中，優(yōu)選以家蠶質(zhì)型多角體病毒的基因組RNA或家蠶質(zhì)型多角體病毒感染的中腸組織的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，通過PCR擴(kuò)增獲得家蠶質(zhì)型多角體病毒多角體蛋白基因。也可以通過化學(xué)方法合成，其中的pFastBacDual質(zhì)粒是美國Invitrogen公司的產(chǎn)品，屬于Bac-to-Bac（Bacteria to Baculovirus）表達(dá)系統(tǒng)載體。

上述技術(shù)方案中，步驟（4）中，所述感受態(tài)細(xì)胞為DH10/Bac感受態(tài)細(xì)胞；所述培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基添加四環(huán)素、卡那霉素、慶大霉素、X-gal、IPTG得到；四環(huán)素、卡那霉素、慶大霉素、IPTG 和X-gal在LB 瓊脂平板上的含量分別為10 μg/ml、50 μg/ml、7 μg/ml、40μg/ml和100 μg/ml。利于重組Bacmid的篩選。

步驟（4）中，轉(zhuǎn)染具體可以為將Bacmid-VP3-cyHV-polh DNA加入到無胎牛血清的昆蟲培養(yǎng)基中，混勻；另取轉(zhuǎn)染試劑加入到無胎牛血清的昆蟲培養(yǎng)基中，混勻；再將前者滴加到后者中，混勻放置30分鐘后，滴加到無胎牛血清的昆蟲培養(yǎng)基，爾后轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞BmN。

上述技術(shù)方案中，步驟（6）中，首先將步驟（5）的重組病毒BmNPV-VP3-cyHV-polh再次轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，26～27℃培養(yǎng)，細(xì)胞發(fā)病后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，獲二代重組病毒BmNPV-VP3-cyHV-polh；然后將二代重組病毒BmNPV-VP3-cyHV-polh接種家蠶或家蠶培養(yǎng)細(xì)胞；所述家蠶為4～5齡幼蟲或蠶蛹，可節(jié)約成本。步驟（5）獲取的重組病毒BmNPV- VP3-cyHV-polh可以通過再次接種家蠶培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，獲取高滴度的二代重組病毒BmNPV- VP3-cyHV-polh。用二代重組病毒接種家蠶幼蟲或蠶蛹可提高接種成功率、提高蠶的發(fā)病率。

純化多角體具體可以為，取感染發(fā)病的家蠶的血淋巴，通過1000轉(zhuǎn)/分和3000轉(zhuǎn)/分的反復(fù)差速離心，可得到純化的質(zhì)型多角體，該多角體即為包裹鯉皰疹病毒II型抗原的多角體；或者用二代重組病毒接種家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，26℃培養(yǎng)至細(xì)胞發(fā)病，收集家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，凍融交替3～5次，通過1000轉(zhuǎn)/分和3000轉(zhuǎn)/分的反復(fù)差速離心，也可純化到質(zhì)型多角體。

本發(fā)明的包裹鯉皰疹病毒II型抗原的質(zhì)型多角體在37℃用碳酸鈉－碳酸氫鈉溶液裂解，然后用鹽酸溶液調(diào)pH至7.12左右，出現(xiàn)大量的絮狀沉淀后，用12000轉(zhuǎn)/分離心，所獲上清為鯉皰疹病毒II型抗原。

本發(fā)明還公開了上述基于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備包裹鯉皰疹病毒II型抗原的多角體的方法制備的包裹鯉皰疹病毒II型抗原的多角體以及包裹鯉皰疹病毒II型抗原的多角體在制備異育銀鯽鰓出血病免疫預(yù)防藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，本發(fā)明公開了一種異育銀鯽鰓出血病免疫預(yù)防藥物，包括上述包裹鯉皰疹病毒II型抗原的多角體。

本發(fā)明還公開了一種融合DNA序列，DNA序列如SEQ ID NO:3所示。所述融合DNA序列可以表示為ORF72-ORF66-ORF81-ORF82-VP3融合DNA序列，其中，鯉皰疹病毒II型ORF72、ORF66、ORF81 和ORF82 的1-186、993-1197、603-783、85-186區(qū)域的DNA序列按ORF72、ORF66、ORF81、ORF82的次序串聯(lián)，其表達(dá)蛋白具多亞單位抗原蛋白特征；該DNA序列的密碼子與家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)匹配，從而提高抗原蛋白的表達(dá)水平；尤其是該融合序列中ORF72、ORF66、ORF81、ORF82串聯(lián)后與家蠶質(zhì)型多角體病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP3基因 5’端的1-279區(qū)域的編碼序列融合，并在5’端加XhoI位點(diǎn)，3’端加終止密碼子TAA和KpnI位點(diǎn)，從而使表達(dá)的抗原蛋白包裹進(jìn)質(zhì)型多角體內(nèi)。根據(jù)說明書附圖4，可檢測(cè)到35kDa的特異性條帶，與理論值相符，說明表達(dá)的重組抗原蛋白被包裹進(jìn)多角體內(nèi)。

進(jìn)一步的，本發(fā)明公開了家蠶質(zhì)型多角體或者合成融合DNA序列在制備包裹鯉皰疹病毒II型抗原的多角體中的應(yīng)用；所述融合DNA序列如SEQ ID NO:3所示。

本發(fā)明將ORF72-ORF66-ORF81-ORF82-VP3的融合DNA序列克隆進(jìn)步驟（1）的pFastBacDual-polh質(zhì)粒的XhoI和KpnI位點(diǎn)，獲pFast-VP3-cyHV-polh。在pFast-VP3-cyHV-polh中，質(zhì)型多角體蛋白基因的編碼序列由桿狀病毒多角體蛋白基因啟動(dòng)子控制，ORF72-ORF66-ORF81-ORF82-VP3的融合DNA序列由桿狀病毒的p10啟動(dòng)子控制。

通過上述技術(shù)方案獲得的包裹鯉皰疹病毒II型抗原的多角體，經(jīng)SDS-PAGE和Western blotting檢測(cè)，可檢測(cè)到鯉皰疹病毒II型的抗原，說明表達(dá)的重組抗原已被多角體蛋白微晶包裹。

由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)：

1. 本發(fā)明公開的通過桿狀病毒系統(tǒng)制備包裹鯉皰疹病毒II型抗原的多角體沒有見報(bào)道；本發(fā)明的桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)是一種真核表達(dá)系統(tǒng)，在家蠶中表達(dá)外源基因，表達(dá)水平高、產(chǎn)物生物活性好、生產(chǎn)成本低，而且桿狀病毒的天然宿主嚴(yán)格限制在昆蟲，對(duì)脊椎動(dòng)物無致病性，且本發(fā)明制備的多角體不包埋病毒粒子，也無病毒DNA污染，生物安全性高，從而可用于疫苗的研發(fā)。

2. 本發(fā)明基于桿狀病毒系統(tǒng)，避免了常規(guī)的大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)的抗原蛋白多以包涵體的形式存在，抗原蛋白的純化工藝復(fù)雜、分離純化難度大的缺陷；而且避免了由于大腸桿菌不具有翻譯后的修飾系統(tǒng)，往往導(dǎo)致重組蛋白的免疫原性較差、且細(xì)胞周質(zhì)中含有種類繁多的內(nèi)毒素的問題。

3. 本發(fā)明將抗原蛋白包裹在多角體內(nèi)；多角體不溶于水，可以通過簡單的差速離心實(shí)現(xiàn)純化；純化的多角體在堿性條件下裂解后，用鹽酸溶液調(diào)pH至多角體蛋白等電點(diǎn)，可以通過離心使多角體蛋白沉淀，而鯉皰疹病毒II型抗原留存在上清中，從而可以快速、方便地獲得鯉皰疹病毒II型抗原，取得了意想不到的技術(shù)效果。

4. 本發(fā)明的包裹鯉皰疹病毒II型抗原的多角體中，多角體對(duì)包裹的抗原蛋白有保護(hù)作用，因此本發(fā)明獲得的包裹鯉皰疹病毒II型抗原的多角體無需特殊處理，在常溫下就可以長期保存，解決了現(xiàn)有獲得的抗原蛋白因易發(fā)生降解，往往需凍干后在低溫下保存的缺陷。

5、本發(fā)明中，質(zhì)型多角體可作為一種良好的載藥體，多角體為2-3微米左右的蛋白微晶，不僅對(duì)包裹的蛋白有穩(wěn)定作用，而且有緩控釋作用，因此用質(zhì)型多角體蛋白微晶包裹蛋白類藥物不僅可穩(wěn)定藥物，而且有緩控釋作用，從而本發(fā)明用質(zhì)型多角體包裹抗原蛋白制備微顆粒緩釋疫苗有可能提高疫苗免疫的保護(hù)水平。

附圖說明

圖1為實(shí)施例一化學(xué)合成的ORF72-ORF66-ORF81-ORF82-VP3融合序列的測(cè)序結(jié)果圖；

圖2為實(shí)施例一重組病毒BmNPV-VP3-cyHV-polh感染家蠶血淋巴的電泳檢測(cè)圖；

圖3為實(shí)施例一獲得的包裹鯉皰疹病毒II型抗原的多角體的顯微圖；

圖4為實(shí)施例一中純化的多角體裂解后，上清的電泳檢測(cè)圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述：

實(shí)施例一 包裹鯉皰疹病毒II型抗原的多角體的制備方法

（1）用QIAGEN Viral RNA Mini Kit (Qiagen公司)提取家蠶質(zhì)型多角體毒基因組RNA，用RNA PCR KitVer.3.0 (Qiagen公司) 按產(chǎn)品錄說明書將病毒RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，以SEQ ID NO:1為正向引物CPV-PH-EI （EcoRⅠ酶切位點(diǎn)）、以SEQ ID NO:2為反向引物（XbaI酶切位點(diǎn)），通過PCR合成5’端和3’端分別帶EcoRI和XbaI位點(diǎn)的質(zhì)型多角體蛋白基因的編碼序列，克隆進(jìn)T-載體，獲pMD19T-PH質(zhì)粒。該質(zhì)粒通過測(cè)序驗(yàn)證后，用EcoRI和XbaI酶切pMD19T-PH質(zhì)粒，回收質(zhì)型多角體蛋白基因片段，克隆進(jìn)pFastBac Dual的EcoRI 和 XbaI位點(diǎn)，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac Dual-polh。

（2）合成ORF72-ORF66-ORF81-ORF82-VP3的融合DNA序列，序列信息見SEQ ID NO:3；ORF72-ORF66-ORF81-ORF82-VP3的融合DNA序列中，鯉皰疹病毒II型（GenBank登錄號(hào)：KT387800）ORF72、ORF66、ORF81 和ORF82 的1-186、993-1197、603-783、85-186區(qū)域的DNA序列，經(jīng)密碼子優(yōu)化后，與家蠶質(zhì)型多角體病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP3基因 （GenBank 登錄號(hào)：GU323606 ）5’端的1-279區(qū)域的編碼序列融合，并在5’端加XhoI位點(diǎn)，3’端加終止密碼子TAA和KpnI位點(diǎn)；化學(xué)合成的ORF72-ORF66-ORF81-ORF82-VP3的融合DNA序列經(jīng)過測(cè)序鑒定，結(jié)果參見圖1，所合成的序列與理論一致，為了附圖簡潔，附圖只給出部分可準(zhǔn)確證實(shí)所合成的序列與理論一致的測(cè)序鑒定結(jié)果。

（3）ORF72-ORF66-ORF81-ORF82-VP3的融合DNA序列克隆進(jìn)步驟（1）的pFastBac Dual-polh質(zhì)粒的XhoI和KpnI位點(diǎn)，獲pFast-VP3-cyHV –polh。

（4）pFast-VP3-cyHV-polh轉(zhuǎn)化DH10/Bac感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含四環(huán)素（10 μg/ml）、卡那霉素（50 μg/ml）、慶大霉素（7 μg/ml）、IPTG（40μg/ml）、X-gal（100 μg/ml）的LB 瓊脂培養(yǎng)平板上；于37℃培養(yǎng)48小時(shí)，挑取白色菌落培養(yǎng)，提取重組Bacmid 基因組DNA，命名為Bacmid-VP3-cyHV-polh，用M13正向引物(SEQ ID NO:4) 和 M13 反向引物 (SEQ ID NO:5) 對(duì)重組Bacmid 進(jìn)行PCR，可從重組Bacmid DNA中擴(kuò)增出與理論分子量一致的目的條帶，說明已按要求正確構(gòu)建了重組Bacmid。

（5）Bacmid-VP3-cyHV-polh DNA(3μg）加入到98μL TC-100培養(yǎng)基（無胎牛血清，GIBCO BRL 公司）中混勻，另取10μL FuGENE HD 轉(zhuǎn)染試劑 (Roche公司)加入到90μL TC-100培養(yǎng)基（無胎牛血清）中混勻，再將前者滴加到后者中，混勻放置30分鐘后，滴加到800μL的TC-100培養(yǎng)基（無胎牛血清）中混勻，轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞BmN。4小后，移除細(xì)胞培養(yǎng)液，用含10%胎牛血清的TC-100培養(yǎng)基在27℃培養(yǎng)3天，收轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞上清，獲P1代重組病毒BmNPV-VP3-cyHV-polh。取P1代病毒感染單層BmN細(xì)胞，培養(yǎng)5天后，收取病毒感染的培養(yǎng)細(xì)胞上清，獲P2代重組病毒BmNPV- VP3-cyHV-polh，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

（6）用昆蟲針醮取P2代重組病毒，從節(jié)間膜處穿刺接種5齡起蠶，25℃左右正常飼養(yǎng)，每隔24小時(shí)收集家蠶血淋巴，用鯉皰疹病毒II型的ORF72的抗體進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，可觀察到35kDa的特異性條帶，見圖2，說明重組抗原蛋白已正確表達(dá)，其中泳道1：野生型家蠶核型多角體病毒感染家蠶的血淋巴；泳道2-4：分別為重組病毒BmNPV-VP3-cyHV-polh感染24、48、72小時(shí)的血淋巴;泳道5：蛋白Marker；泳道6-9： 96、120、144、168小時(shí)的血淋巴，Western blotting 用的一抗為鼠抗鯉皰疹病毒II型ORF72抗體；二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠 IgG。

顯微鏡鏡檢可觀察到感染發(fā)病的蠶的血淋巴中存在多角體，感染發(fā)病的蠶的血淋巴通過1000轉(zhuǎn)/分和3000轉(zhuǎn)/分的反復(fù)差速離心，可純化到質(zhì)型多角體，見圖3，說明質(zhì)型多角體蛋白基因已正確表達(dá)，多角體為2-3微米左右的蛋白微晶；從每毫升感染發(fā)病的蠶的血淋巴中可獲得約10⁸個(gè)多角體。多角體在37℃用pH10.8的碳酸鈉－碳酸氫鈉溶液裂解30分鐘，用1M的鹽酸溶液調(diào)pH至7.12左右，出現(xiàn)大量的絮狀沉淀后，用12000轉(zhuǎn)/分離心，取上清，用鯉皰疹病毒II型的ORF72的抗體進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，可檢測(cè)到35kDa的特異性條帶，見圖4，說明表達(dá)的重組抗原蛋白被包裹進(jìn)多角體內(nèi)；泳道1：DNA Marker；泳道2-7：分別為重組病毒感染家蠶72、96、120、144、168小時(shí)血淋巴中純化的多角體，泳道7：野生型家蠶核型多角體。Western blotting 用的一抗為鼠抗鯉皰疹病毒II型的ORF72的抗體；二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠 IgG。

實(shí)施例二 包裹鯉皰疹病毒II型抗原的多角體的制備方法

與實(shí)施例一相比，其中步驟（5）中，26℃培養(yǎng)4天，收取病毒感染的培養(yǎng)細(xì)胞上清，獲P1代重組病毒BmNPV-VP3-cyHV-polh。P1代重組病毒接種家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，26℃培養(yǎng)至細(xì)胞發(fā)病，收集細(xì)胞上清獲P2代病毒；其中步驟（6）中，用昆蟲針醮取P2代重組病毒接種蠶蛹，在25℃經(jīng)5天左右，蠶蛹發(fā)病。其余步驟一致，通過1000轉(zhuǎn)/分和3000轉(zhuǎn)/分的反復(fù)差速離心，可從發(fā)病蠶蛹的血淋巴中純化到質(zhì)型多角體，為2-3微米左右的蛋白微晶。從每毫升感染發(fā)病的蠶蛹的血淋巴中可獲得約1.5×10⁸個(gè)多角體。顯微鏡結(jié)果以及電泳結(jié)果顯示，本發(fā)明明確得到了包裹鯉皰疹病毒II型抗原的多角體。

實(shí)施例三 包裹鯉皰疹病毒II型抗原的多角體的制備方法

與實(shí)施例一相比，其中步驟（6）中，P2代重組病毒接種4齡家蠶幼蟲，其余步驟一致，通過1000轉(zhuǎn)/分和3000轉(zhuǎn)/分的反復(fù)差速離心，可純化到質(zhì)型多角體，為2-3微米左右的蛋白微晶；從每毫升感染發(fā)病的蠶的血淋巴中可獲得約10⁸個(gè)多角體。顯微鏡結(jié)果以及電泳結(jié)果顯示，本發(fā)明明確得到了包裹鯉皰疹病毒II型抗原的多角體。

實(shí)施例四 包裹鯉皰疹病毒II型抗原的多角體的制備方法

與實(shí)施例一相比，其中步驟（6）中，P2代重組病毒接種家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，26℃培養(yǎng)至細(xì)胞發(fā)?。?天），收集細(xì)胞，凍融交替3次，然后通過1000轉(zhuǎn)/分和3000轉(zhuǎn)/分的反復(fù)差速離心，可純化到質(zhì)型多角體，從10⁵個(gè)感染培養(yǎng)細(xì)胞中可獲得約10⁶個(gè)多角體，為2-3微米左右的蛋白微晶。顯微鏡結(jié)果以及電泳結(jié)果顯示，本發(fā)明明確得到了包裹鯉皰疹病毒II型抗原的多角體。

本發(fā)明中，DNA序列為：

SEQ ID NO:1：

GAATTCATGGCAGACGTAGCAGGAACA

SEQ ID NO:2：

TCTAGATCACTGACGGTTACTCAGAGC

SEQ ID NO:3：

CTCGAGATGTACGGTCTGAACAACGCTCAGGGTTTCATCGATACCGAGTGGATCGACAGACAGTCAATCGCTATGACCGCTCAGGAAACAAGCAGACTGTTGAACCCGTACCTGGCTACAAAAGGTCAGAGAGTGGACCCTTCAAACCTGTACATCCCAGACGGTATCTTCGTGACATACACACCTACCGGTTCAAGACACCCTATGGTGGAATACGAACGCATCGAATCACAACTGGAACCAGACACAGGAGCTTCAAGCTTCGTGGACAAACTGGTGGAAAAGTCAGACCTGTCAGCTTGCTTGTCACACACAGACGGTACAATCGAACTGCCTTCATCTTGGGTGGACCCTAGAGCTAAACAGTTCCACGATCTGGACGACCTGATGATCTACGGTTCAGCAGATTACATGGACTCAGACGACGAAGATTACGATTCATACGCCGGAGCAGCAGAAACACTGCAAAGAAGCATGCGCGACTACGCTGACGAAGAAGATAGCGACATGGACGATAGCACATCACTGCTGAACAGCGTGAGAAAGATGAGCAGCAAGTTCAAGAGCACCGTGTACGAAGACGACCAAACACAGAGCAGCAACACAACAGCTACAAGCGACCGCTACAAGTACTACACAAGCAGAGGTACAATCCAACGCGCTAACAGACCGGGTTTGATGTGGCACTATACGAGTATCAACAATGACACGAGAGTAGCACTTGACCCCAAACCAAACCAAATTAGAACGATAACAAAACCAAACACAGTACCTCAACTCGGCACAGACTACTTGTACACTTTCAACTCACAACGACGATCACACACGTTACGACTATTAGGACCTTTTCAGTACTTCAACTCTTCCGAGACAGATAGAGGACATCCACTATTTCGCTTACCCCTTAAGTATCCGTCAAAAGCAATACCAGCGGATGAGTTAATTGATAACTTGCATTAAGGTACC

SEQ ID NO:4：

CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG

SEQ ID NO:5：

AGCGGATAACAATTTCACACAGG

SEQUENCE LISTING

<110> 蘇州大學(xué)

<120>基于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備包裹鯉皰疹病毒II型抗原的多角體的方法

<160>5

<210> 1

<211>27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

GAATTCATGGCAGACGTAGCAGGAACA 27

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

TCTAGATCACTGACGGTTACTCAGAGC 27

<210> 3

<211> 966

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

CTCGAGATGTACGGTCTGAACAACGCTCAGGGTTTCATCG 40

ATACCGAGTGGATCGACAGACAGTCAATCGCTATGACCGC 80

TCAGGAAACAAGCAGACTGTTGAACCCGTACCTGGCTACA 120

AAAGGTCAGAGAGTGGACCCTTCAAACCTGTACATCCCAG 160

ACGGTATCTTCGTGACATACACACCTACCGGTTCAAGACA 200

CCCTATGGTGGAATACGAACGCATCGAATCACAACTGGAA 240

CCAGACACAGGAGCTTCAAGCTTCGTGGACAAACTGGTGG 280

AAAAGTCAGACCTGTCAGCTTGCTTGTCACACACAGACGG 320

TACAATCGAACTGCCTTCATCTTGGGTGGACCCTAGAGCT 360

AAACAGTTCCACGATCTGGACGACCTGATGATCTACGGTT 400

CAGCAGATTACATGGACTCAGACGACGAAGATTACGATTC 440

ATACGCCGGAGCAGCAGAAACACTGCAAAGAAGCATGCGC 480

GACTACGCTGACGAAGAAGATAGCGACATGGACGATAGCA 520

CATCACTGCTGAACAGCGTGAGAAAGATGAGCAGCAAGTT 560

CAAGAGCACCGTGTACGAAGACGACCAAACACAGAGCAGC 600

AACACAACAGCTACAAGCGACCGCTACAAGTACTACACAA 640

GCAGAGGTACAATCCAACGCGCTAACAGACCGGGTTTGAT 680

GTGGCACTATACGAGTATCAACAATGACACGAGAGTAGCA 720

CTTGACCCCAAACCAAACCAAATTAGAACGATAACAAAAC 760

CAAACACAGTACCTCAACTCGGCACAGACTACTTGTACAC 800

TTTCAACTCACAACGACGATCACACACGTTACGACTATTA 840

GGACCTTTTCAGTACTTCAACTCTTCCGAGACAGATAGAG 880

GACATCCACTATTTCGCTTACCCCTTAAGTATCCGTCAAA 920

AGCAATACCAGCGGATGAGTTAATTGATAACTTGCATTAA 960

GGTACC 966

<210> 4

<211>23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

AGCGGATAACAATTTCACACAGG 23