專利名稱：一種反芻動物葡萄球菌分離、增菌及莢膜多糖表達培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細菌培養(yǎng)基，具體涉及一種反芻動物葡萄球菌分離、增菌及莢膜多糖表達培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
葡萄球菌廣泛分布于自然界，致病性葡萄球菌常引起人和動物各種化膿性疾患、敗血癥或膿毒敗血癥。其中金黃色葡萄球菌、模仿葡萄球菌等致病菌是常見病原。應(yīng)用活的或滅活的菌體苗、分離的肽糖、類毒素、粘附素等制備的傳統(tǒng)疫苗，對防治葡萄球菌感染的效果并不顯著。造成傳統(tǒng)疫苗效果不佳的原因是大部分致病菌株具有莢膜(粘液層/微莢膜)。莢膜多糖具有抗吞噬活性且阻止中性粒細胞識別葡萄球菌細胞壁成份的抗體，是主要毒力因子和免疫原。葡萄球菌易于分離、增菌，例如，現(xiàn)在常用營養(yǎng)肉湯/瓊脂(NutrientBroth/Agar)、高鹽甘露醇瓊脂(Manitol Salt Agar)、血瓊脂(Blood Agar)或切浦曼培養(yǎng)基(Chapman Stone Medium)作葡萄球菌的分離、增菌培養(yǎng)基。這些培養(yǎng)基的缺陷是，葡萄球菌分離后，作為主要免疫原和毒力因子的莢膜多糖低濃度表達甚至不表達，連續(xù)傳代2-4代后消失，導(dǎo)致致病菌毒力迅速下降，即使通過本動物回歸也不能恢復(fù)毒力。但是，生產(chǎn)科研過程中需要葡萄球菌分離、增菌及連續(xù)傳代后仍然能夠保持其毒力的培養(yǎng)基，能夠為菌種保存、傳代、疫苗保護力檢驗、莢膜多糖提取提供支持，因此，目前的培養(yǎng)基達不到技術(shù)要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)之不足，提供一種菌種保存、連續(xù)傳代后毒力維持能力強的反芻動物葡萄球菌分離、增菌及莢膜多糖表達培養(yǎng)基。
本發(fā)明反芻動物葡萄球菌分離、增菌及莢膜多糖表達培養(yǎng)基是由下述重量配比的原料制成(按制取1000毫升計算)水解乳蛋白1-7.5g、 蛋白胨1-7.5g、胰蛋白胨1-7.5g、大豆蛋白胨1-7.5g、乳糖5-25g、氯化鈉20-50g、磷酸氫二鉀3-7g、硫酸鎂0.05-0.2g、硫酸亞鐵0.01-0.03g、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.05-0.15g、兔腦心浸液500ml，其余為雙蒸水。其中，所述的兔腦心浸液500ml是這樣制得稱取新鮮兔腦100g、兔心50g，剪碎、研磨、勻漿，然后用溫度為4℃的雙蒸水250ml浸該組織48小時，煮沸15分鐘，濾紙過濾，補充水分至500ml。
本發(fā)明反芻動物葡萄球菌分離、增菌及莢膜多糖表達培養(yǎng)基的制備方法是首先依次將水解乳蛋白、 蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、乳糖、氯化鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵和L-半胱氨酸鹽酸鹽加入雙蒸水中，充分攪拌，加熱融化，然后再加入所述的兔腦心浸液混合，最后補足水至1000ml，分裝，115℃×15分鐘滅菌，4℃保存。
本發(fā)明在選取材料中，用多種蛋白胨組合提供菌體莢膜多糖表達所需氮源；用乳糖提供能量源；用磷酸氫二鉀提供緩沖體系；用L-半胱氨酸鹽酸鹽提供適宜的氧化-還原電勢；用硫酸亞鐵和硫酸鎂提供莢膜多糖合成酶類的配位激活劑；考慮到牛腦潛藏瘋牛病原的因素，特別添加兔腦心浸液提供莢膜多糖合成所需的不飽和脂肪酸，有利于金黃色葡萄球菌在兼性厭氧條件下毒力因子的表達。根據(jù)反芻動物葡萄球菌的營養(yǎng)需求與莢膜多糖高濃度表達之間的相互關(guān)系，通過對培養(yǎng)基中碳源、氮源、無機鹽、氨基酸和特殊營養(yǎng)因子的合理組合，簡化制備工藝，省略其他大部分營養(yǎng)要求豐富的培養(yǎng)基中需添加0.22μm濾膜超濾除菌的動物血清，既避免細菌或病毒的污染，又達到既能分離葡萄球菌，分離增菌后又能保持毒力。同時，該培養(yǎng)基所有成份均符合生物化學(xué)試劑和衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求，對人畜無致癌、致病、致畸作用。
本發(fā)明培養(yǎng)基實驗情況如下2002年至2005年，對新疆昌吉市、呼圖壁縣、瑪納斯縣、五家渠市共12家奶牛場采取集奶牛臨床型乳腺炎奶樣進行分離、增菌后，采用TH-16S系統(tǒng)鑒定。全部159份奶樣共分離172株菌，其中金黃色葡萄球菌34株(34/172)，表皮葡萄球菌35株(35/172)，腐生葡萄球菌43株(43/172)，溶血葡萄球菌12株(12/172)，模仿葡萄球菌21株(21/172)，溶血性芽胞桿菌5株(5/172)，其它葡萄球菌20株(20/172)，霉菌2株(2/172)。盡管溶血性芽胞桿菌可以在此培養(yǎng)基上生長，但菌落大而扁，表面皺褶，邊緣不整齊呈鋸齒狀，很容易根據(jù)菌落形態(tài)與葡萄球菌區(qū)分。霉菌呈疏松絮狀，菌絲明顯容易區(qū)別。葡萄球菌在該固體培養(yǎng)基上呈金黃色/橙黃色/乳白色，圓形、隆起、閃光、邊緣整齊，直徑0.5-2.0mm，但少數(shù)和也呈乳白色及其它色澤。涂片革蘭氏染液染色顯微鏡檢查，呈革蘭氏陽性、葡萄串狀、無芽孢的球菌。久儲堿性美藍染液染色呈有或無莢膜的球菌。
挑選金黃色葡萄球菌生化優(yōu)勢株733330株1株，接種本發(fā)明培養(yǎng)基，搖床37℃24h培養(yǎng)后，粗提莢膜多糖，按照二硝基苯法測定多糖含量為275μg/ml。將上述菌株37℃24h培養(yǎng)物接種18-22g小白鼠10只，0.2ml/只，24h內(nèi)全部致死，本發(fā)明培養(yǎng)基對照健活。上述菌株連續(xù)在本發(fā)明培養(yǎng)基上傳代10次，莢膜多糖含量為223μg/ml。該菌株37℃24h在本發(fā)明培養(yǎng)基上10代培養(yǎng)物腹腔接種18-22g小白鼠10只，0.2ml/只。24h內(nèi)死亡7只，48h內(nèi)致死9只，96h內(nèi)全部致死，本發(fā)明培養(yǎng)基對照健活。上述10代菌株接種本發(fā)明培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基37℃12h后封口，4℃保存6個月，移至本發(fā)明培養(yǎng)基37℃24h培養(yǎng)后，腹腔接種18-22g小白鼠10只，0.2/ml/只。24h內(nèi)致死6只，96內(nèi)全部致死，本發(fā)明培養(yǎng)基對照健活。本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)物滅活后粗提莢膜多糖含量為223μg/ml，免疫18-22g小白鼠0.2ml/只×4只，21天后攻同株菌37℃24h本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)物0.2ml/只，保護力達50％，未免疫陽性對照全部于48h內(nèi)死亡。
相比較來看，上述同株733330株金黃色葡萄球菌傳代1次營養(yǎng)肉湯37℃24h培養(yǎng)物，滅活后粗提莢膜多糖含量為33μg/ml，腹腔接種18-22g小白鼠0.2ml/只×10只，96h內(nèi)僅致死2只，營養(yǎng)肉湯對照健活。連續(xù)傳代10代后莢膜多糖消失，腹腔接種營養(yǎng)肉湯37℃24h培養(yǎng)物給18-22g小白鼠0.2ml/只×10只，96h內(nèi)無死亡，對照鼠健活。接種營養(yǎng)肉湯半固體37℃24h后封口，4℃保存6個月，移至營養(yǎng)肉湯37℃24h培養(yǎng)后，腹腔接種18-22g小白鼠0.2ml/只×10只，96h內(nèi)無死亡，對照健活(見表1)。
表1金黃色葡萄球菌733330株在本發(fā)明培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)下致病力的比較 上述結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌在本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代條件下能夠顯著表達莢膜多糖，而且至少在10代以內(nèi)連續(xù)傳代能夠維持毒力。并且證明，莢膜多糖不但是主要毒力因子，而且也是主要免疫相關(guān)成份。
本發(fā)明的優(yōu)點是菌種保存、傳代毒力維持能力強。
具體實施例方式
A稱取新鮮兔腦100g、兔心50g，剪碎、研磨、勻漿，用雙蒸水250ml 4℃浸該組織48小時后，煮沸15分鐘，濾紙過濾，補充水分至500ml。
B依次稱取水解乳蛋白5g、 蛋白胨5g、胰蛋白胨5g、大豆蛋白胨5g、乳糖10g、氯化鈉30g、磷酸氫二鉀5g、硫酸鎂0.1g、硫酸亞鐵0.01g、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.1g、按順序加入400ml雙蒸水中，充分攪拌，加熱融化。
C將上述A、B兩項混合，補足水至1000ml，分裝，115℃×15分鐘滅菌，4℃保存。
權(quán)利要求
1.一種反芻動物葡萄球菌分離、增菌及莢膜多糖表達培養(yǎng)基，其特征在于每1000ml培養(yǎng)基是由下述重量配比的原料制成的水解乳蛋白1-7.5g、蛋白胨1-7.5g、胰蛋白胨1-7.5g、大豆蛋白胨1-7.5g、乳糖5-25g、氯化鈉20-50g、磷酸氫二鉀3-7g、硫酸鎂0.05-0.2g、硫酸亞鐵0.01-0.03g、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.05-0.15g、兔腦心浸液500ml，其余為雙蒸水，其中，所述的兔腦心浸液500ml是這樣制得稱取新鮮兔腦100g、兔心50g，剪碎，研磨，勻漿，然后用溫度為4℃的雙蒸水250ml浸該組織48小時，煮沸15分鐘，濾紙過濾，補充水分至500ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反芻動物葡萄球菌分離、增菌及莢膜多糖表達培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于首先依次將水解乳蛋白、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、乳糖、氯化鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、L-半胱氨酸鹽酸鹽加入雙蒸水中，充分攪拌，加熱融化，然后再加入所述的兔腦心浸液混合，最后補足水至1000ml，分裝，115℃×15分鐘滅菌，4℃保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種反芻動物葡萄球菌分離、增菌及莢膜多糖表達培養(yǎng)基，它由水解乳蛋白、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、乳糖、氯化鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、L－半胱氨酸鹽酸鹽、兔腦心浸液和雙蒸水制成，其中，所述的兔腦心浸液是由新鮮兔腦、兔心經(jīng)剪碎、研磨、勻漿，然后用溫度為4℃的雙蒸水浸該組織，煮沸15分鐘，濾紙過濾，補充水分制得。本發(fā)明菌種保存、傳代毒力維持能力強，適用于科學(xué)研究、疫苗生產(chǎn)檢驗過程中葡萄球菌分離、增菌及連續(xù)傳代或保存條件下毒力維持。
文檔編號C12R1/44GK101063092SQ20061008006
公開日2007年10月31日 申請日期2006年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月25日
發(fā)明者馬文戈, 黃炯, 薛英, 王延 申請人:新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所