技術領域：
：本發(fā)明涉及一種用于1,3-丙二醇生產(chǎn)的新方法，包括在具有高甘油含量的培養(yǎng)基上培養(yǎng)微生物。本發(fā)明還涉及新的微生物，或微生物的菌株，其經(jīng)適應用于從包含高甘油含量的培養(yǎng)基產(chǎn)生1,3-丙二醇。本發(fā)明還涉及“適應性微生物”，其丙三醇代謝定向于1,3-丙二醇產(chǎn)生，并且允許其在高濃度的工業(yè)甘油存在下生長。本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的生物來源的1,3-丙二醇。最后，本發(fā)明涉及上述生物來源的1,3-丙二醇作為熱塑性聚氨酯中的延伸鏈(extenderchain)，作為聚對苯二甲酸丙二酯中的單體和作為化妝品配制劑中的組分的用途。
背景技術：
：：1,3-丙二醇(PDO)是知曉時間最久的發(fā)酵產(chǎn)物之一。其早在1881年就由AugustFreund在明顯含有巴氏梭菌(Clostridiumpasteurianum)作為活性生物的丙三醇發(fā)酵混合培養(yǎng)中可靠地得到了鑒定。對產(chǎn)生PDO(亞丙基二醇，丙二醇)的不同腸細菌的發(fā)酵的定量分析早在1928年就在代爾夫特微生物學院(microbiologyschoolofDelft)開始，并且在20世紀40年代在Ames,Iowa成功地繼續(xù)。在20世紀60年代，興趣轉移到攻擊丙三醇的酶，特別是丙三醇和二醇脫水酶，因為這些酶在需求輔酶B12方面很特殊。形成PDO的梭菌首次記載于1983年，作為從分泌丙三醇的藻類獲得特別產(chǎn)物的方法的一部分(Nakas等,1983)。PDO是丙三醇發(fā)酵的典型產(chǎn)物，并且尚未在其他有機底物的厭氧轉化中發(fā)現(xiàn)。只有非常少數(shù)的生物(其均為細菌)能夠形成PDO。它們包括克雷伯氏菌屬(Klebsiella)(肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae))、腸桿菌屬(Enterobacter)(成團腸桿菌(E.agglomerans))和檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)(弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii))的腸細菌，乳桿菌(lactobacilli)(短乳桿菌和布氏乳桿菌(L.buchneri))，和丁酸梭菌和巴氏梭菌類的梭菌。對發(fā)酵產(chǎn)物的分析顯示，部分丙三醇轉化成與這種不同類型的糖發(fā)酵中相同的產(chǎn)物，即乙酸、2,3-丁二醇、丁酸、乳酸、乙醇和琥珀酸。這種轉化為生長提供了必需的能量，但是對于許多產(chǎn)物而言，在丙三醇向PDO的還原性轉化中所用的還原當量也被釋放。降低梭菌中PDO產(chǎn)量的丁酸形成在某種程度上與克雷伯氏菌屬中的乙醇形成相當，但是其似乎更依賴于生長速率。丁酸隨著稀釋率迅速減少，即使是在不存在底物過量的情況下。在任何情況下，乙酸/丁酸比的改變對PDO產(chǎn)量(yield)沒有很大影響。PDO作為雙官能有機化合物，能夠潛在地用于許多合成反應，特別是作為產(chǎn)生聚酯、聚醚和聚氨酯的縮聚中的單體。PDO能夠通過不同的化學途徑產(chǎn)生，但是它們生成含有極具污染性的物質的廢料流，因而生產(chǎn)成本高并且化學產(chǎn)生的PDO無法與能夠通過石油化學獲得的二醇如1,2-乙二醇、1,2-丙二醇和1,4-丁二醇競爭。因此，在過去PDO只能找到市場交易量可以忽略的特殊領域應用(nicheapplication)。這是為何在1995年杜邦(Dupont)起動了葡萄糖生物轉化為PDO的研究項目。盡管這種過程是環(huán)境友好的，但是其具有如下缺點：i)使用維生素B12，一種非常昂貴的輔因子和ii)因為生產(chǎn)菌株的不穩(wěn)定性而是一種不連續(xù)的過程。由于從生物柴油工業(yè)流出的大量丙三醇的可用性，連續(xù)的過程、不用維生素B12以及較高碳得率會是有利的。本領域已知PDO能夠從甘油(glycerine)產(chǎn)生，甘油(glycerine)是生物柴油生產(chǎn)的一種不想要副產(chǎn)物，其含有混有鹽和水的大約80-85％的丙三醇。先前描述了丁酸梭菌能夠在分批和兩階段連續(xù)發(fā)酵中生長并從工業(yè)丙三醇產(chǎn)生PDO(Papanikolaou等，2000)。然而，在最高丙三醇濃度下，以0.02h-1的稀釋率獲得的最大PDO效價為48.1g/L，意味著0.9g/L/H的生產(chǎn)率。所述培養(yǎng)以補料培養(yǎng)基中最大丙三醇濃度為90g/L并在酵母提取物(本領域技術人員已知用于幫助增加細菌生物量產(chǎn)生的一種昂貴的含有有機氮的化合物)存在下進行。WO2006/128381公開了這種甘油用于以使用天然PDO生產(chǎn)生物如肺炎克雷伯氏菌、丁酸梭菌或巴氏梭菌的分批和補料分批培養(yǎng)產(chǎn)生PDO的用途。另外，WO2006/128381中使用的培養(yǎng)基也含有酵母提取物。如該專利申請中所述，達到的最大生產(chǎn)率為0.8-1.1g.l.h-1(含端值)(comprisedbetween)。經(jīng)修飾而含有來自丁酸梭菌(C.butyricum)的維生素B12-非依賴性丙三醇脫水酶和PDO-脫氫酶的丙酮丁醇梭菌菌株(稱為丙酮丁醇梭菌DG1pSPD5)的性能已經(jīng)在Gonzalez-Pajuelo等,2005中描述。這種菌株在原始狀態(tài)下(originally)使用含有多至120g.l-1的純丙三醇的補料培養(yǎng)基生長并產(chǎn)生PDO。此外，使用含有最多60g.l-1的純的或工業(yè)丙三醇的補料培養(yǎng)基的分析沒有鑒別出任何差異。當比較丁酸梭菌與丙酮丁醇梭菌DG1pSPD5時，作者Gonzalez-Pajuelo等,2006觀察到了全局性的相似行為。然而，在不含有機氮的合成補料培養(yǎng)基中使用105g.l-1的工業(yè)丙三醇測試的相同丙酮丁醇梭菌DG1pSPD5菌株不能給出與使用相同濃度的純丙三醇相同的性能(參見實施例1)。本發(fā)明提供使用高濃度工業(yè)甘油產(chǎn)生1,3-丙二醇的方法(means)，并且其中能夠達到較高的PDO效價和生產(chǎn)率。發(fā)明簡述本發(fā)明涉及一種用于在甘油的連續(xù)發(fā)酵過程中產(chǎn)生1,3-丙二醇的方法，包括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)生產(chǎn)微生物，所述生產(chǎn)微生物允許將丙三醇轉化為1,3-丙二醇，和回收1,3-丙二醇，其特征在于所述培養(yǎng)基包含高濃度的工業(yè)甘油，所述工業(yè)甘油包含丙三醇，并且其中所述生產(chǎn)微生物是預先適應于在高濃度工業(yè)甘油存在下生長的微生物。在優(yōu)選的實施方案中，丙三醇以90-120g/L，優(yōu)選約105g/L的濃度存在于所述培養(yǎng)基中。所述培養(yǎng)基優(yōu)選為合成培養(yǎng)基，不添加任何有機氮源，并且特別是沒有酵母提取物。所述工業(yè)甘油具體而言是來自生物柴油生產(chǎn)的副產(chǎn)物。所述生產(chǎn)微生物優(yōu)選為細菌，更優(yōu)選選自梭菌屬的成員，特別是丙酮丁醇梭菌。有利地，所述生產(chǎn)微生物是經(jīng)遺傳修飾而改進1,3-丙二醇從丙三醇的產(chǎn)生的微生物。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述生產(chǎn)微生物中的丙三醇脫水酶活性不依賴于輔酶B12或其多種前體中的一種的存在，并且源自丁酸梭菌。優(yōu)選地，所述生產(chǎn)微生物是之前通過將微生物以低稀釋率在包含高濃度工業(yè)甘油的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇適應性微生物而適應于在具有高濃度工業(yè)甘油的培養(yǎng)基上生長的微生物。最后，1,3-丙二醇經(jīng)進一步純化。本發(fā)明還涉及一種用于將微生物修飾成適應于在高濃度工業(yè)甘油存在下生長的微生物的方法，包括將所述微生物以低稀釋率在包含高濃度工業(yè)甘油的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并選擇能夠在具有高濃度工業(yè)甘油的培養(yǎng)基上生長的適應性微生物。有利地，將所述微生物以低稀釋率培養(yǎng)歷時24小時至10天，優(yōu)選多于2天，更優(yōu)選約8天的時間。所述稀釋率通常為0.005-0.1h-1，優(yōu)選0.005-0.02h-1。所述稀釋率在所述適應方法的過程中可以變化，最終具有稀釋率為0.005-0.02h-1的第一步和其中稀釋率增長至0.1h-1，優(yōu)選0.06h-1的第二步。本發(fā)明還涉及適應性微生物，即可以通過上文和下文公開的方法獲得的適應于在高濃度工業(yè)甘油存在下生長的生產(chǎn)微生物。本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明的方法獲得的生物來源的1,3-丙二醇。本發(fā)明還涉及生物來源的1,3-丙二醇，其特征在于13C和18O同位素值的組合選自δ13C低于-34‰且δ18O為21.5‰-0.5‰，優(yōu)選δ13C低于-35‰且δ18O為21.9‰-0.5‰，更優(yōu)選δ13C為-35.05‰～-36.09‰且δ18O為21.9‰-17.34‰。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述生物來源的1,3-丙二醇的特征在于δ13C/δ18O同位素比值為-2～0，優(yōu)選-1～-0.2，且更優(yōu)選-0.65～-0.4。本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明方法獲得的或如上限定的生物來源的1,3-丙二醇作為熱塑性聚氨酯中的延伸鏈，作為聚對苯二甲酸丙二酯中的單體或作為化妝品配制物中的組分的用途。具體地，本發(fā)明涉及如下各項：1.一種用于在甘油的連續(xù)發(fā)酵過程中產(chǎn)生1,3-丙二醇的方法，包括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)生產(chǎn)微生物，所述生產(chǎn)微生物允許將丙三醇轉化為1,3-丙二醇，和回收1,3-丙二醇，其特征在于所述培養(yǎng)基包含高濃度的工業(yè)甘油，所述工業(yè)甘油(glycerine)包含丙三醇(glycerol)，并且其中所述生產(chǎn)微生物是預先適應于在高濃度工業(yè)甘油存在下生長的微生物。2.根據(jù)項1的方法，其特征在于在所述培養(yǎng)基中丙三醇以90-120g/L，優(yōu)選約105g/L的濃度存在。3.根據(jù)項1或2的方法，其特征在于所述工業(yè)甘油是來自生物柴油生產(chǎn)的副產(chǎn)物。4.根據(jù)項1-3中任一項的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基是未添加有機氮源，特別是未添加酵母提取物的合成培養(yǎng)基。5.根據(jù)項1-4中任一項的方法，其特征在于所述生產(chǎn)微生物選自梭菌屬(genusClostridium)的成員。6.根據(jù)項5的方法，其特征在于所述生產(chǎn)微生物是丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。7.根據(jù)項1-6中任一項的方法，其特征在于所述生產(chǎn)微生物是經(jīng)遺傳修飾的細菌。8.根據(jù)項1-7中任一項的方法，其特征在于所述生產(chǎn)微生物中的丙三醇脫水酶活性不依賴于輔酶B12或其多種前體中的一種的存在并且源自丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)。9.根據(jù)項1-8中任一項的方法，其特征在于所述生產(chǎn)微生物通過將該微生物以低稀釋率在包含高濃度工業(yè)甘油的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇能夠在具有高濃度工業(yè)甘油的培養(yǎng)基上生長的適應性微生物而適應成為生產(chǎn)微生物。10.根據(jù)項1-9中任一項的方法，其特征在于1,3-丙二醇經(jīng)進一步純化。11.一種用于將微生物修飾成適應于在高濃度工業(yè)甘油存在下生長的微生物的方法，包括將所述微生物以低稀釋率在包含高濃度工業(yè)甘油的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并選擇能夠在具有高濃度工業(yè)甘油的培養(yǎng)基上生長的適應性微生物。12.項11的方法，其特征在于將所述微生物以低稀釋率培養(yǎng)歷時范圍從24小時至10天的時間。13.項11或12的方法，其特征在于所述稀釋率為0.005-0.1h-1。14.一種適應于在高濃度工業(yè)甘油存在下生長的微生物，其容許(susceptibletobeobtainedby)通過如項11-13中之一所述的方法獲得。15.根據(jù)項1-10中任一項所述的方法獲得的生物來源的1,3-丙二醇。16.容許根據(jù)項1-10中任一項的方法獲得的生物來源的1,3-丙二醇，其特征在于δ13C同位素值低于-34‰，優(yōu)選低于-35‰，并且更優(yōu)選為-35.05‰～-36.09‰。17.容許根據(jù)項1-10中任一項的方法獲得的生物來源的1,3-丙二醇，其特征在于δ18O同位素值為21.5‰-0.5‰，優(yōu)選21.9‰-15‰，并且更優(yōu)選為21.9‰-17.34‰。18.容許根據(jù)項1-10中任一項的方法獲得的生物來源的1,3-丙二醇，其特征在于δ13C和δ18O同位素值選自以下值：a)δ13C值低于-34‰且δ18O為21.5‰-0.5‰；b)δ13C值低于-35‰且δ18O為21.9‰-15‰；或c)δ13C值為-35.05‰至-36.09‰且δ18O為21.9‰-17.34‰。19.容許根據(jù)項1-10中任一項的方法獲得的生物來源的1,3-丙二醇，其特征在于18O/13C同位素比值為-2～0，優(yōu)選-1～-0.2，更優(yōu)選-0.65～-0.4。20.根據(jù)項15-19中任一項的1,3-丙二醇作為熱塑性聚氨酯合成中延伸鏈的用途。21.根據(jù)項15-19中任一項的1,3-丙二醇作為化妝品配制物中的組分的用途。22.根據(jù)項15-19中任一項的1,3-丙二醇作為聚對苯二甲酸丙二酯合成中的單體的用途。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種用于在甘油的連續(xù)發(fā)酵過程中產(chǎn)生1,3-丙二醇的方法，包括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)生產(chǎn)微生物，所述生產(chǎn)微生物允許將丙三醇轉化為1,3-丙二醇，和回收1,3-丙二醇，其特征在于所述培養(yǎng)基包含高濃度的工業(yè)甘油，所述工業(yè)甘油包含丙三醇，并且其中所述生產(chǎn)微生物是預先適應于在高濃度工業(yè)甘油存在下生長的微生物。術語“微生物”意指選自由細菌、酵母和真菌組成的組的微生物。優(yōu)選地，所述微生物是優(yōu)選選自下組的細菌：腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、芽孢桿菌科(Bacillaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、鏈霉菌科(Streptomycetaceae)和棒桿菌科(Corynebacteriaceae)。更優(yōu)選地，所述細菌選自下組：埃希氏菌屬菌種(Escherichiasp.)(優(yōu)選大腸桿菌)、克雷伯氏菌屬菌種(Klebsiellasp)(優(yōu)選肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae))、芽孢桿菌屬菌種(Bacillussp.)(優(yōu)選枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis))、梭菌屬菌種(優(yōu)選丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)和丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum))和棒桿菌屬菌種(Corynebacteriumsp)(優(yōu)選谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum))。術語“埃希氏菌屬”、“克雷伯氏菌屬”、“芽孢桿菌屬”、“梭菌屬”("Clostridium"and"Clostridia")和“棒桿菌屬”是指屬于這些科或屬的全部細菌種類。術語“生產(chǎn)微生物”或“微生物的生產(chǎn)菌株”是指其中該微生物的丙三醇代謝定向于1,3-丙二醇生產(chǎn)的微生物或微生物菌株。“經(jīng)適應的微生物”是指經(jīng)修飾而能夠在高濃度工業(yè)甘油上生長的微生物。“適當?shù)呐囵B(yǎng)基”或“培養(yǎng)基”是指對于所述生產(chǎn)菌株的生長和二醇生產(chǎn)進行優(yōu)化的培養(yǎng)基。術語“高甘油含量”或“高濃度甘油”意指培養(yǎng)基中超過90g/l的丙三醇。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述培養(yǎng)基以90-120g/L，優(yōu)選約105g/L的濃度包含丙三醇。“工業(yè)甘油”意指從不進行實質性純化的工業(yè)過程獲得的甘油產(chǎn)物。工業(yè)甘油也可稱作“粗甘油”、“粗丙三醇”或“工業(yè)丙三醇”。工業(yè)甘油含有超過約70％，優(yōu)選超過約80％的丙三醇，少于15％的水和雜質如無機鹽和脂肪酸。無機鹽的濃度小于10％，優(yōu)選小于5％。脂肪酸的濃度小于20％，優(yōu)選小于5％。工業(yè)甘油中最具代表性的脂肪酸為棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞麻酸、亞油酸和花生酸。獲得工業(yè)甘油的工業(yè)過程為，但不限于，其中將脂肪和油，特別是植物來源的脂肪和油加工成工業(yè)產(chǎn)品如洗滌劑或潤滑劑的制造方法。在這樣的制造方法中，認為工業(yè)甘油是副產(chǎn)物。在一個具體的實施方案中，工業(yè)甘油是來自生物柴油生產(chǎn)的副產(chǎn)物并且包括從生物柴油生產(chǎn)獲得的甘油的已知雜質，包含約80-85％的丙三醇以及鹽、水和一些其他有機化合物如脂肪酸。從生物柴油生產(chǎn)獲得的工業(yè)甘油未進行進一步的純化步驟。術語“合成培養(yǎng)基”意指生物在其上生長的包含化學上確定的底物的培養(yǎng)基。在本發(fā)明的培養(yǎng)基中，有利地，丙三醇是碳的單一來源。優(yōu)選地，這種培養(yǎng)基不含任何有機氮源。氮是對于植物和動物二者的生長和繁殖關鍵的天然存在的元素。其存在于氨基酸中和許多其他有機和無機化合物中。根據(jù)本發(fā)明，“有機氮”意指包含從活的生物獲得的包含氮的有機化合物。用于細菌培養(yǎng)的有機氮的常用來源包含酵母提取物。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述生產(chǎn)微生物是梭菌屬菌株，更優(yōu)選丙酮丁醇梭菌。在本發(fā)明的另一實施方案中，所述生產(chǎn)微生物是經(jīng)遺傳修飾的細菌。短語“經(jīng)遺傳修飾的細菌”意指該菌株經(jīng)過以改變其遺傳特征為目的的轉化?？梢詫仍椿蛳魅?、缺失、或過表達?？蓪⑼庠椿蛞?、通過質粒攜帶、或整合入所述菌株的基因組中，以在細胞中表達。術語“質粒”或“載體”如用于本文是指通常攜帶不屬于細胞中央代謝的一部分的基因，并且通常為環(huán)狀雙鏈DNA分子的形式的額外染色體元件。在本發(fā)明的另一實施方案中，所述方法的特征在于所述生產(chǎn)微生物具有丙三醇脫水酶活性，該活性不依賴于輔酶B12或其多種前體之一的存在，并且該活性源自丁酸梭菌。具體而言，所述生產(chǎn)微生物通過或者由質粒過表達或者整合至所述微生物的染色體中來引入額外拷貝的來自丁酸梭菌的1,3-丙二醇操縱子(編碼維生素B12-非依賴性1,3-丙二醇途徑中涉及的酶)而呈現(xiàn)增加的1,3-丙二醇產(chǎn)生流(flux)。例如，pSPD5質粒可以用于1,3-丙二醇操縱子的過表達。用于將丙三醇代謝定向于1,3-丙二醇的產(chǎn)生的方法是本領域已知的(參見例如WO2006/128381，González-Pajuelo等,2006)。在本發(fā)明的另一實施方案中，所述生產(chǎn)微生物是預先適應于在高濃度工業(yè)甘油存在下生長的微生物。生產(chǎn)微生物的所述“適應”是通過將該微生物以低稀釋率在包含高濃度工業(yè)甘油的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并選擇能夠在具有高濃度工業(yè)甘油的培養(yǎng)基上生長的適應性微生物來獲得的。本發(fā)明還涉及用于將微生物修飾成適應于在高濃度工業(yè)甘油存在下生長的微生物的方法。幾種“適應方法”可以由本領域技術人員選擇以將生產(chǎn)微生物轉化成允許在高濃度工業(yè)甘油存在下生長的生產(chǎn)微生物。根據(jù)本發(fā)明，將微生物轉化成適應于在高濃度工業(yè)甘油存在下生長的微生物的修飾包括將所述微生物以低稀釋率在包含高濃度工業(yè)甘油的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇能夠在具有高濃度工業(yè)甘油的培養(yǎng)基上生長的適應性微生物。有利地，將所述微生物以低稀釋率培養(yǎng)歷時24小時至10天，優(yōu)選多于2天，更優(yōu)選約8天的時間。所述稀釋率通常為0.005-0.1h-1，優(yōu)選0.005-0.02h-1。所述稀釋率在所述適應方法的過程中可以變化，最終具有稀釋率為0.005-0.02h-1的第一步和其中稀釋率增長至0.1h-1，優(yōu)選0.06h-1的第二步。當在適應方法的過程中改變稀釋率時，0.005-0.02h-1的稀釋率稱為“低稀釋率”，而0.02-0.1h-1的稀釋率為普通稀釋率。本發(fā)明還涉及適應于在高濃度工業(yè)甘油存在下生長的微生物，其容許通過如上所述的方法獲得。使用本發(fā)明的方法適應的微生物優(yōu)選是進一步適應于在高濃度工業(yè)甘油存在下生長的生產(chǎn)微生物。所述適應性微生物也可以是首先適應于在高濃度工業(yè)甘油存在下生長，再修飾為具有其定向于1,3-丙二醇生產(chǎn)的丙三醇代謝的微生物。根據(jù)本發(fā)明的“適應性微生物”是適應于在高濃度工業(yè)甘油存在下生長并且具有以下兩種關鍵特征的生產(chǎn)微生物：-其丙三醇代謝定向于1,3-丙二醇產(chǎn)生，和-允許其在高濃度工業(yè)甘油存在下生長。在本發(fā)明的一個特定實施方案中，將丙酮丁醇梭菌DG1pSPD5菌株使用含有105g.l-1來自生物柴油生產(chǎn)的粗丙三醇的補料培養(yǎng)基在連續(xù)培養(yǎng)中以0.005-0.02h-1，優(yōu)選0.02h-1的稀釋率培養(yǎng)。歷時最多10天，優(yōu)選5-8天的時間，使所述菌株適應于補料培養(yǎng)基中存在的高甘油濃度，并且可以將稀釋率增長至0.1h-1，優(yōu)選增長至0.06h-1(參見實施例2)。稀釋率的逐漸增加可以在分批階段(batchphase)結束-10天，優(yōu)選在5天之后，5-8天，約7天進行，導致連續(xù)培養(yǎng)的生產(chǎn)率改進(參見實施例3)。有利地，在適應階段之后，補料培養(yǎng)基中的丙三醇濃度可以增加至120g.l-1。然而，直接嘗試使菌株適應于120g.l-1的工業(yè)丙三醇不可行，即使對于105g.l-1的丙三醇濃度以0.02h-1的稀釋率，再次說明了所述菌株不能在不進行在先適應的情況下在補料培養(yǎng)基中在高甘油濃度存在下生長。本發(fā)明的方法，在其不同的實施例中(使用經(jīng)遺傳修飾的微生物和/或使用不含額外有機氮源的培養(yǎng)基)，導致對于0.05-0.6g.h-1的稀釋率而言1,3-丙二醇以0.4-0.6g.g-1的得率和1.8-3.5g.l-1.h-1的生產(chǎn)率產(chǎn)生。優(yōu)選地，所述得率為0.5-0.56g.g-1，并且所述生產(chǎn)率為2-2.9g.l-1.h-1。在本發(fā)明的一個特定方面，產(chǎn)生的1,3-丙二醇經(jīng)進一步純化。連續(xù)發(fā)酵方法是本領域技術人員已知的。發(fā)酵方法通常在反應器中進行，所述反應器具有適應于所用細菌的具有已知確定的組成的無機培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基至少含有甘油，一種含有丙三醇的來自生物柴油生產(chǎn)的副產(chǎn)物，并且視需要含有用于代謝物產(chǎn)生的共底物。本發(fā)明的這種方法優(yōu)選在連續(xù)工藝中實現(xiàn)。本領域技術人員知曉如何掌控這些實驗條件中的每一種，和如何限定用于本發(fā)明的微生物的培養(yǎng)條件。具體而言，梭菌在20℃-60℃，優(yōu)選25℃-40℃(對于丙酮丁醇梭菌而言)的溫度發(fā)酵。用于從發(fā)酵培養(yǎng)基回收并最終純化1,3-丙二醇的方法是技術人員已知的。1,3-丙二醇可以通過蒸餾分離。在大多數(shù)實施方案中，1,3-丙二醇與副產(chǎn)物如乙酸一起從發(fā)酵培養(yǎng)基中蒸餾，然后通過已知方法進一步純化。本發(fā)明還涉及根據(jù)上述方法獲得的生物來源的1,3-丙二醇。本發(fā)明還涉及以其同位素比為特征的生物來源的1,3-丙二醇。對氫(D/H)和碳(13C/12C)的同位素比分析為特定產(chǎn)品如蜂蜜(Grenier-Loustalot等,2006)或葡萄酒(Guillou等,2001)提供可靠的指標(indicator)。13C/12C同位素比為來源的區(qū)分提供指示并反映特定產(chǎn)物的生物合成代謝途徑和使用的原料。使用Calvin-Benson光合循環(huán)的C3植物和使用Hatch-Slack光合循環(huán)的C4植物之間確實可以產(chǎn)生差異。專利申請WO01/11070描述了產(chǎn)生自葡萄糖的生物來源的1,3-丙二醇的13C/12C同位素比為-10.9～-15.4；產(chǎn)生自丙三醇的生物來源的1,3-丙二醇的13C/12C同位素比為-22.41～-22.60，而化學產(chǎn)生的1,3-丙二醇的13C/12C同位素比為-17.95至-18.33。根據(jù)本發(fā)明，1,3-丙二醇D/H比(記錄為δD)、13C/12C比(記錄為δ13C)、18O/16O比(記錄為δ18O)在燃燒之后通過質譜測定。同位素13C/12C比參照國際標準品(PDB＝PeeDeeBelemite(PeeDee箭石))作為δ按千分比(permill)計算。同位素18O/16O比參照國際標準平均海洋水(SMOW)作為δ按千分比計算。同位素D/H比與國際標準平均海洋水(SMOW)比較按ppm計算。盡管D/H比和13C/12C比公知用于給定產(chǎn)品的表征，18O/16O比卻主要用于水分析作為古氣候指標(paleoclimaticindicator)。不同類型的1,3-丙二醇之間的比較顯示δD沒有差別。來自丙三醇的生物來源的1,3-丙二醇(本發(fā)明的目的)的δD為147.38ppm-145.84ppm，而來自葡萄糖的生物來源的1,3-丙二醇為145ppm，且對于化學1,3-丙二醇為150.19ppm-139.37ppm。本發(fā)明涉及容許根據(jù)上述方法獲得的生物來源的1,3-丙二醇，其特征在于δ13C同位素值低于-34‰，優(yōu)選低于-35‰，并且更優(yōu)選為-35.05‰～-36.09‰。本發(fā)明還涉及容許根據(jù)上述方法獲得的生物來源的1,3-丙二醇，其特征在于δ18O同位素值為21.5‰-0.5‰，優(yōu)選21.9‰-15‰，并且更優(yōu)選21.9‰-17.34‰。本發(fā)明還涉及生物來源的1,3-丙二醇，其特征在于以下特征之一或其組合：-13C和18O同位素值選自低于-34‰的δ13C和21.9‰-0.5‰的δ18O，-優(yōu)選δ13C低于-35‰且δ18O為21.9‰-0.5‰，-更優(yōu)選δ13C為-35.05‰～-36.09‰且δ18O為21.9‰-17.34‰(參見實施例4)。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述生物來源的1,3-丙二醇的特征在于18O/13C同位素比值為-2～0；優(yōu)選-1～-0.2，并且更優(yōu)選-0.65～-0.4。優(yōu)選地，以前述同位素比為特征的生物來源的1,3-丙二醇是通過以作為原料的丙三醇為基礎的發(fā)酵獲得的。更優(yōu)選地，以前述同位素比為特征的生物來源的1,3-丙二醇是從用于產(chǎn)生1,3-丙二醇的本發(fā)明的方法獲得的。本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明的方法獲得的或如上限定的生物來源的1,3-丙二醇作為熱塑性聚氨酯中的延伸鏈，作為聚對苯二甲酸丙二酯中的單體或作為化妝品配制物中的組分的用途。生物來源的1,3-丙二醇可以用于化學1,3-丙二醇的所有已知應用。本領域技術人員知曉如何從1,3-丙二醇獲得這些終產(chǎn)物。本發(fā)明涉及使用根據(jù)本發(fā)明的生物來源的1,3-丙二醇作為延伸鏈制備熱塑性聚氨酯的方法。其還涉及制備含有根據(jù)本發(fā)明的生物來源的1,3-丙二醇的化妝品組合物的方法。其還涉及使用根據(jù)本發(fā)明的生物來源的1,3-丙二醇作為單體合成聚對苯二甲酸丙二酯的方法。附圖說明圖1：以國際標準的‰表示的PDOδ13C和δ18O：PDO1：根據(jù)描述的方法產(chǎn)生的PDO；PDO2：從作為底物的葡萄糖產(chǎn)生的PDO；PDO3：通過化學方法產(chǎn)生的PDO。圖2：PDO的δ18O/δ13C比：PDO1：根據(jù)描述的方法產(chǎn)生的PDO；PDO2：從作為底物的葡萄糖產(chǎn)生的PDO；PDO3：通過化學方法產(chǎn)生的PDO。實施例實施例1用于梭菌屬分批培養(yǎng)的合成培養(yǎng)基每升去離子水含有：丙三醇，30g；KH2PO4，0.5；K2HPO4，0.5g；MgSO4,7H2O，0.2g；CoCl26H2O，0.01g，H2SO4，0.1ml；NH4Cl，1.5g，生物素，0.16mg；對氨基苯甲酸，32mg和FeSO4,7H2O，0.028g。將該培養(yǎng)基的pH使用NH4OH3N調節(jié)至6.3。對于分批培養(yǎng)，使用購自Sigma(純度99.5％)的商業(yè)丙三醇。用于連續(xù)培養(yǎng)的補料培養(yǎng)基每升自來水(tapwater)含有：粗丙三醇，105g；KH2PO4，0.5；K2HPO4，0.5g；MgSO4,7H2O，0.2g；CoCl26H2O，0.026g；NH4Cl，1.5g，生物素，0.16mg；對氨基苯甲酸，32mg；FeSO4,7H2O，0.04g，消泡劑，0.05ml；ZnSO4,7H2O，8mg；CuCl2,2H2O，4mg；MnSO4,H2O，40mg，H3BO3，2mg；Na2MoO4,2H2O，0.8mg。在此情況下不調節(jié)培養(yǎng)基pH。產(chǎn)生自生物柴油生產(chǎn)的酯交換過程的粗丙三醇由SAIPOL(LeMeriot,France)供應并且含有83％丙三醇(w/w)。連續(xù)培養(yǎng)在2L生物反應器Tryton(PierreGuerin,France)中進行，工作容積為1000ml。通過自動調整培養(yǎng)水平將培養(yǎng)容積保持恒定在1000ml。在35℃的溫度以200RPM攪拌培養(yǎng)物，并且通過自動添加NH4OH3N將pH維持在6.5。在實驗期間控制并記錄以mV表示的培養(yǎng)基的氧化-還原力(Oxido-ReductivePower)。為了創(chuàng)造厭氧條件，將容器中經(jīng)滅菌的培養(yǎng)基用不含O2的無菌氮氣在60℃沖洗1小時，并再次沖洗直至達到35℃。所述生物反應器的氣體出口通過連苯三酚(pyrogallol)的布置保護其免于氧氣(Vasconcelos等,1994)。在滅菌之后，將補料培養(yǎng)基也用不含O2的無菌氮氣沖洗直至達到室溫，并維持在200mbar的氮氣壓下以避免O2進入。以濁度計在620nm測量細胞濃度并與直接評估的細胞干重相關聯(lián)。丙三醇、1,3-丙二醇、乙醇、丁醇、乙酸和丁酸以及其他痕量水平的酸的濃度通過HPLC分析來測量。在BioradAminexHPX087H柱上進行分離，并通過折射率實現(xiàn)檢測。操作條件如下：流動相硫酸0.5mM；流速0.5ml/min，溫度，25℃。使用于指數(shù)生長期結束時取得的100ml燒瓶中合成培養(yǎng)基(與上述分批培養(yǎng)基相同，但是不添加乙酸，2.2g.l-1和MOPS，23.03g.l-1)上的生長中的培養(yǎng)物作為接種物(5％v/v)。首先將培養(yǎng)物分批(batch-wise)培養(yǎng)。在指數(shù)生長早期，加入商業(yè)丙三醇的脈沖(pulse)：將脈沖定義為在3小時期間以50ml.h-1的流速添加含商業(yè)丙三醇120g.l-1的合成培養(yǎng)基(與對分批培養(yǎng)描述的相同)(即添加18g丙三醇)。然后生長繼續(xù)分批進行，并且在指數(shù)生長期結束之前，以0.06h-1的稀釋率和含105g.l-1的粗丙三醇的補料培養(yǎng)基開始連續(xù)補料。表1：丙酮丁醇梭菌DG1(pSPD5)在105g.l-1的粗丙三醇上的連續(xù)培養(yǎng)(D＝0.06h-1,pH6.5且T℃＝35℃)。給出的值代表在3次容積變化之后獲得的穩(wěn)態(tài)條件下7個點的平均值。Y1,3-PDO:PDO產(chǎn)率(g/g的消耗的丙三醇)Q1,3PDO:PDO容積生產(chǎn)率(volumetricproductivity)對于碳回收率的計算，從終產(chǎn)物濃度估計二氧化碳濃度。實施例2使用的合成培養(yǎng)基與實施例1中描述的相同。預培養(yǎng)、接種和分批生長在與上文所述相同的條件下進行。以0.02h-1的稀釋率和含有105g.l-1的粗丙三醇的補料培養(yǎng)基開始連續(xù)補料。在這些條件下數(shù)天之后(即在相當于至少3次容積變化的生物反應器接種之后8-10天)將稀釋率根據(jù)以下方案從0.02h-1增加至0.05h-1：i)在48小時內增加0.01h-1單位并且ii)24-48小時的靜止步驟，重復3次。培養(yǎng)物的穩(wěn)定性通過使用先前描述的HPLC方案的產(chǎn)物分析來追蹤。值得注意的是，我們等到殘余丙三醇盡可能低時將稀釋率在48小時內最終增加至0.06h-1。表2：丙酮丁醇梭菌DG1(pSPD5)在105g.l-1的粗丙三醇上的連續(xù)培養(yǎng)(D＝0.05h-1和0.06h-1,pH6.5且T℃＝35℃)。給出的值代表在穩(wěn)態(tài)條件下3或4個點的平均值。Y1,3-PDO:PDO產(chǎn)率(g/g的消耗的丙三醇)Q1,3PDO:PDO容積生產(chǎn)率對于碳回收率的計算，從終產(chǎn)物濃度估計二氧化碳濃度。在相同條件下進行的另一培養(yǎng)產(chǎn)生了相同的結果。實施例3使用與實施例1中描述的相同的合成培養(yǎng)基，只是補料培養(yǎng)基含有120g.l-1的粗丙三醇。預培養(yǎng)、接種和分批生長在與上文所述相同的條件下進行。A)以0.02h-1的稀釋率和直接含有120g.l-1的粗丙三醇的補料培養(yǎng)基開始連續(xù)補料。表3：丙酮丁醇梭菌DG1(pSPD5)在120g.l-1的粗丙三醇上的連續(xù)培養(yǎng)(D＝0.02h-1,pH6.5且T℃＝35℃)。給出的值代表在3次容積變化之后獲得的穩(wěn)態(tài)條件下7個點的平均值。Y1,3-PDO:PDO產(chǎn)率(g/g的消耗的丙三醇)Q1,3PDO:PDO容積生產(chǎn)率對于碳回收率的計算，從終產(chǎn)物濃度估計二氧化碳濃度。B)以0.02h-1的稀釋率和最初含有105g.l-1的粗丙三醇的補料培養(yǎng)基開始連續(xù)補料。在這些條件下數(shù)天之后(對應于至少3次容積變化)，將稀釋率根據(jù)之前描述的方案從0.02h-1增加至0.06h-1。然后將補料轉換至0.05h-1的稀釋率和含有120g.l-1的粗丙三醇的補料培養(yǎng)基。表4：丙酮丁醇梭菌DG1(pSPD5)在以D＝0.06h-1、105g.l-1的粗丙三醇補料之后在120g.l-1的粗丙三醇上的連續(xù)培養(yǎng)(D＝0.05h-1,pH6.5且T℃＝35℃)。給出的值代表在至少20次容積變化之后獲得的3個點的平均值。Y1,3-PDO:PDO產(chǎn)率(g/g消耗的丙三醇)Q1,3PDO:PDO容積生產(chǎn)率對于碳回收率的計算，從終產(chǎn)物濃度估計二氧化碳濃度。實施例4用于δ13C和δ18O值計算的方法按照慣例將13C和18O水平表示為相對值。通常當與兩種國際參照比較時將它們以百分比的形式(δ)表示。對于13C，參照為“Vienna.PD箭石”，其為從中知曉13C值的化石碳酸鹽。用于計算δ的公式如下：對于18O，參照為具有已知的18O值的“標準平均海洋水”(SMOW)。公式與13C的公式相同，使用18O參照值。使用的材料和樣品制備13CPDO的13C/12C同位素比基于實驗測量的二氧化碳樣本計算。為此目的，將樣品在元素分析儀中燃燒，并將獲得的二氧化碳注入與元素分析儀(CARLOERBANA2100)偶聯(lián)的質譜儀(FinniganMATDELTA)以供測定同位素比。以這種方式將44、45和46質量的二氧化碳分開并定量。然后通過將結果與事先相對于國際標準校準的工作參照(谷氨酸)之一相比，按δ千分數(shù)計數(shù)法(deltaperthousandscale)計算。18O18O/16O同位素比的測量在有機化合物的連續(xù)流中進行。為此目的，將樣品在微量分析烘箱的水平通過熱解燃燒并將產(chǎn)生的一氧化碳輸送至質譜儀(與元素分析儀FisonsNA15002型偶聯(lián)的OPTIMA，或，來自Thermoelectron的與元素分析儀TC/EA偶聯(lián)的質譜儀DeltaV)。測定通過熱解產(chǎn)生的一氧化碳中的28、29、30的不同同位素。然后將18O/16O同位素比通過將結果與SMOW比較按δ千分數(shù)計數(shù)法計算。結果對于產(chǎn)生自粗丙三醇的PDO，我們獲得了-35.57±0.52‰的平均δ13C值，產(chǎn)生自葡萄糖的PDO具有-12.6‰的平均δ13C值，而化學產(chǎn)生的PDO具有-30.05±5.02‰的平均δ13C值。產(chǎn)生自粗丙三醇的PDO具有19.76±2.42‰的平均δ18O值，產(chǎn)生自葡萄糖的PDO具有22.0‰的平均δ18O值，而化學產(chǎn)生的PDO具有–0.80±1.27‰的平均δ18O值。如此，δ13C的測量允許區(qū)分通過發(fā)酵方法從不同原料產(chǎn)生的PDO。化學產(chǎn)生的PDO的δ13C顯示高度可變性(-30.05±5.02)并且僅僅稍高于產(chǎn)生自丙三醇的PDO的δ13C?；瘜W產(chǎn)生的PDO的δ18O具有非常低的值(-0.8±1.27)，其使得區(qū)分化學產(chǎn)生的PDO和來自生物來源(基于葡萄糖或丙三醇)的PDO成為可能(圖1)。顯然δ18O/δ13C值允許鑒別不同的PDO(圖2)，其中對于基于丙三醇的PDO的δ18O/δ13C比為-0.56，對于基于葡萄糖的PDO為-1.75，而對于化學產(chǎn)生的PDO為0.03。結論是產(chǎn)生自丙三醇的PDO能夠通過測量δ13C和δ18O然后確定δ18O/δ13C來鑒定。參考文獻1.CotteJF,CasabiancaH,LhéritierJ,PerrucchiettiC,SanglarC,WatonH和Grenier-LoustalotMF.2007.Studyandvalidityof13Cstablecarbonisotopicratioanalysisbymassspectrometryand2Hsitespecificnaturalisotopicfractionationbynuclearmagneticresonanceisotopicmeasurementstocharacterizeandcontroltheauthenticityofhoney.AnalyticaChimicaActa582:125-136.2.González-PajueloM,Meynial-SallesI,MendesF,AndradeJC,VasconcelosI和SoucailleP.2005.MetabolicengineeringofClostridiumacetobutylicumfortheindustrialproductionof1,3-propanediolfromglycerol.MetabolicEngineering7:329-336.3.González-PajueloM,Meynial-SallesI,MendesF,SoucailleP.和VasconcelosI.2006.Microbialconversionofanaturalproducer,ClostridiumbutyricumVPI3266,andanengineeredstrain,ClostridiumacetobutylicumDG(pSPD5).AppliedandEnvironmentalMicrobiology,72:96-101.4.GuillouC,JaminE,MartinGJ,RenieroF,WittkowskiR和WoodR.2001.Analysesisotopiquesduvinetdesproduitsdérivésduraisin.Bulletindel’O.I.V:839-840.5.NakasJP,SchaedleM,ParkinsonCM,CoonleyCE和TanenbaumSW.1983.Systemdevelopmentforlinked-fermentationproductsofsolventsfromalgalbiomass.AppliedandEnvironmentalMicrobiology46:1017-1023.6.PapanikolaouS,Ruiz-SanchezP,ParisetB,BlanchardF和FickM.2000.Highproductionof1,3-propanediolfromindustrialglycerolbyanewlyisolatedClostridiumbutyricumstrain.JournalofBiotechnology.77:191-2008.7.WO2006/128381.Methodforpreparing1,3-propanediolbyusingglycerineastheby-productofthebiologicaldieseloil.8.WO01/11070.1,3-propanediolandpolymerderivativesfromafermentablecarbonsource.當前第1頁1 2 3 當前第1頁1 2 3