本發(fā)明涉及白藜蘆醇衍生物的制備領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種白藜蘆醇-二十碳五烯酸酯的制備方法。
背景技術(shù)：
白藜蘆醇(3,5,4’-三羥基二苯乙烯)是一種天然非黃酮類多酚化合物，主要來源于虎杖和葡萄。相關(guān)研究表明，白藜蘆醇是一種重要的生物活性物質(zhì)，具有抗氧化損傷、抗腫瘤、保護(hù)心腦血管、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)等廣泛的生理作用和藥理活性，因此受到世界各地科學(xué)家們的深入關(guān)注，被大量應(yīng)用于醫(yī)藥和保健品等各個行業(yè)領(lǐng)域。
盡管白藜蘆醇對人體有許多健康有益作用，但其經(jīng)口服進(jìn)入機(jī)體后，快速進(jìn)入肝臟發(fā)生Ⅱ相代謝，生物利用度低，這影響了白藜蘆醇本身的活性效應(yīng)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于合成一種白藜蘆醇衍生物——白藜蘆醇-二十碳五烯酸酯，該物質(zhì)可以減弱白藜蘆醇在機(jī)體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化和氧化降解速率，進(jìn)而增強(qiáng)生物利用度；同時，保證合成方法反應(yīng)條件溫和、制備及純化過程簡單、終產(chǎn)物純度高。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種白藜蘆醇-二十碳五烯酸酯的制備方法，包括如下步驟：
S1、向白藜蘆醇中加入甲基叔丁基醚，充分混勻，得到白藜蘆醇溶液；所述甲基叔丁基醚與白藜蘆醇體積摩爾比為1:0.026～0.044(L/mol)；
S2、取二十碳五烯酸(EPA)加入到步驟S1所得的白藜蘆醇溶液中，充分混勻，得到醇酸混合溶液；所述二十碳五烯酸與白藜蘆醇摩爾比為6～12:1；
S3、取脂肪酶EC 3.1.1.3加入到步驟S2所得的醇酸混合溶液中，充氮?dú)?、密封，得到脂肪酶溶液；所述脂肪酶EC 3.1.1.3≥5000U/g，所述脂肪酶EC3.1.1.3與白藜蘆醇質(zhì)量摩爾比為100～150:1(g/mol)；
優(yōu)選方式下，所述脂肪酶EC 3.1.1.3為Novozyme 435，來自南極假絲酵母。
S4、將步驟S3所得的脂肪酶溶液置于35～50℃、150～200rpm環(huán)境下振蕩反應(yīng)48～96h后，置于冰水浴中冷卻，終止酶解，得酶反應(yīng)溶液；
S5、將步驟S4所得的酶反應(yīng)溶液過濾，除去脂肪酶，再于35～45℃、相對真空度-0.05～-0.08Mpa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去甲基叔丁基醚，得到粗產(chǎn)物；
S6、將體積濃度為95％的乙醇加入到步驟S5所得的粗產(chǎn)物中，加入碳酸鈉和水，氮?dú)獗Ｗo(hù)，40～50℃回流皂化20～30min，得皂化溶液；所述體積濃度為95％的乙醇與粗產(chǎn)物的體積質(zhì)量比為10～20:1(mL/g)，所述碳酸鈉與粗產(chǎn)物質(zhì)量比為0.8～1.2:1，所述水與粗產(chǎn)物體積質(zhì)量比為4～6:1(mL/g)；
S7、將步驟S6所得的皂化溶液用正己烷萃取1～3次，萃取所得正己烷層用無水硫酸鈉除水后，于35～45℃、相對真空度-0.05～-0.08Mpa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去正己烷，得到白藜蘆醇-二十碳五烯酸酯；每次萃取所用正己烷的體積與步驟S5中所用體積濃度為95％的乙醇的體積的比為2～6:1。
本發(fā)明的技術(shù)創(chuàng)新在于：
1、本發(fā)明反應(yīng)條件溫和，耗時較短，產(chǎn)物酯化率高，制備的白藜蘆醇-EPA酯不需要采用柱層析等方法純化，終產(chǎn)物的純度高。
2、本發(fā)明方法合成白藜蘆醇衍生物，在酶的催化下，將白藜蘆醇與二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)反應(yīng)制備白藜蘆醇酯，可以減弱白藜蘆醇在機(jī)體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化和氧化降解速率，進(jìn)而增強(qiáng)生物利用度；同時，白藜蘆醇可以抗氧化損傷等，而EPA也具有減緩冠狀動脈心臟病、高血壓和炎癥等功能，通過合成的白藜蘆醇-EPA酯，可同時發(fā)揮白藜蘆醇和EPA在健康有益方面的作用。
具體實(shí)施方式
下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1
S1、取0.1mol白藜蘆醇于可密封的玻璃容器中，緩慢加入甲基叔丁基醚，甲基叔丁基醚:白藜蘆醇控制在1:0.026(L/mol)，充分混勻；
S2、取0.6mol EPA加入S1所得溶液中，充分混勻；
S3、取脂肪酶(Novozyme 435，≥5000U/g，EC 3.1.1.3，來自南極假絲酵母)加入S2所得溶液中，酶:白藜蘆醇控制在100:1(g/mol)，然后向玻璃容器充氮?dú)饷芊猓?/p>
S4、將玻璃容器置于恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)溫度為40℃，振蕩速度為150rpm，反應(yīng)時間為48h，反應(yīng)完成后，取出置于冰水浴中冷卻，終止酶解；
S5、將S4所得的溶液經(jīng)0.22μm有機(jī)濾膜過濾，除去脂肪酶，再于溫度35℃、相對真空度-0.08Mpa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去甲基叔丁基醚，得到粗產(chǎn)物；
S6、在S5所得粗產(chǎn)物中加入體積濃度為95％乙醇，體積濃度為95％乙醇：粗產(chǎn)物控制在10:1(mL/g)；加入碳酸鈉，碳酸鈉：粗產(chǎn)物控制在0.8:1(g/g)；加入水，水：粗產(chǎn)物控制在4:1(mL/g)，將上述反應(yīng)混合物在氮?dú)饬鞅Ｗo(hù)下回流皂化30min，反應(yīng)溫度控制在40℃；
S7、將S6所得混合物，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用正己烷萃取2次，每次萃取用正己烷:S5中95％乙醇控制在2:1(mL/mL)，萃取所得正己烷層用無水硫酸鈉除水，然后于35℃、相對真空度-0.08Mpa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去正己烷，得到白藜蘆醇-EPA酯，其質(zhì)量為19.2771g。通過上述步驟，白藜蘆醇的酯化率為37.6％。采用高效液相-紫外檢測器(HPLC-UV)的檢測，白藜蘆醇-EPA酯其的純度為80.3％。
實(shí)施例2
S1、取0.1mol白藜蘆醇于可密封的玻璃容器中，緩慢加入甲基叔丁基醚，甲基叔丁基醚:白藜蘆醇控制在1:0.044(L/mol)，充分混勻；
S2、取1.2mol EPA加入S1所得溶液中，充分混勻；
S3、取脂肪酶(Novozyme 435，≥5000U/g，EC 3.1.1.3，來自南極假絲酵母)加入S2所得溶液中，酶:白藜蘆醇控制在150:1(g/mol)，然后向玻璃容器充氮?dú)饷芊猓?/p>
S4、將玻璃容器置于恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)溫度為40℃，振蕩速度為150rpm，反應(yīng)時間為48h，反應(yīng)完成后，取出置于冰水浴中冷卻，終止酶解；
S5、將S4所得的溶液經(jīng)0.22μm有機(jī)濾膜過濾，除去脂肪酶，再于溫度35℃、相對真空度-0.08Mpa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去甲基叔丁基醚，得到粗產(chǎn)物；
S6、在S5所得粗產(chǎn)物中加入95％乙醇，95％乙醇：粗產(chǎn)物控制在20:1(mL/g)；加入碳酸鈉，碳酸鈉：粗產(chǎn)物控制在1.2:1(g/g)；加入水，水：粗產(chǎn)物控制在6:1(mL/g)，將上述反應(yīng)混合物在氮?dú)饬鞅Ｗo(hù)下回流皂化30min，反應(yīng)溫度控制在40℃；
S7、將S6所得混合物，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用正己烷萃取3次，每次萃取用正己烷:S5中95％乙醇控制在6:1(mL/mL)。萃取所得正己烷層用無水硫酸鈉除水，然后于溫度35℃、相對真空度-0.08Mpa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去正己烷，得到白藜蘆醇-EPA酯，其質(zhì)量為20.2000g。通過上述步驟，白藜蘆醇的酯化率為39.4％。采用高效液相-紫外檢測器(HPLC-UV)的檢測，白藜蘆醇-EPA酯的純度為84.7％。
實(shí)施例3
S1、取0.1mol白藜蘆醇于可密封的玻璃容器中，緩慢加入甲基叔丁基醚，甲基叔丁基醚:白藜蘆醇控制在1:0.03(L/mol)，充分混勻；
S2、取1.0mol EPA加入S1所得溶液中，充分混勻；
S3、取脂肪酶(Novozyme 435，≥5000U/g，EC 3.1.1.3，來自南極假絲酵母)加入S2所得溶液中，酶:白藜蘆醇控制在110:1(g/mol)，然后向玻璃容器充氮?dú)饷芊猓?/p>
S4、將玻璃容器置于恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)溫度為45℃，振蕩速度為180rpm，反應(yīng)時間為60h，反應(yīng)完成后，取出置于冰水浴中冷卻，終止酶解；
S5、將S4所得的溶液經(jīng)0.22μm有機(jī)濾膜過濾，除去脂肪酶，再于溫度40℃、相對真空度-0.06Mpa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去甲基叔丁基醚，得到粗產(chǎn)物；
S6、在S5所得粗產(chǎn)物中加入95％乙醇，95％乙醇：粗產(chǎn)物控制在12:1(mL/g)；加入碳酸鈉，碳酸鈉：粗產(chǎn)物控制在1.0:1(g/g)；加入水，水：粗產(chǎn)物控制在5:1(mL/g)。將上述反應(yīng)混合物在氮?dú)饬鞅Ｗo(hù)下回流皂化25min，反應(yīng)溫度控制在45℃；
S7、將S6所得混合物，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用正己烷萃取3次，每次萃取用正己烷:S5中95％乙醇控制在3:1(mL/mL)。萃取所得正己烷層用無水硫酸鈉除水，然后于溫度40℃、相對真空度-0.06Mpa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去正己烷，得到白藜蘆醇-EPA酯，其質(zhì)量為19.5335g。通過上述步驟，白藜蘆醇的酯化率為38.1％。采用高效液相-紫外檢測器(HPLC-UV)的檢測，白藜蘆醇-EPA酯的純度為82.6％。
實(shí)施例4
S1、取0.1mol白藜蘆醇于可密封的玻璃容器中，緩慢加入甲基叔丁基醚，甲基叔丁基醚:白藜蘆醇控制在1:0.035(L/mol)，充分混勻；
S2、取1.2mol EPA加入S1所得溶液中；
S3、取脂肪酶(Novozyme 435，≥5000U/g，EC 3.1.1.3，來自南極假絲酵母)加入S2所得溶液中，酶:白藜蘆醇控制在120:1(g/mol)，然后向玻璃容器充氮?dú)饷芊猓?/p>
S4、將玻璃容器置于恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)溫度為45℃，振蕩速度為180rpm，反應(yīng)時間為60h，反應(yīng)完成后，取出置于冰水浴中冷卻，終止酶解；
S5、將S4所得的溶液經(jīng)0.22μm有機(jī)濾膜過濾，除去脂肪酶，再于溫度40℃、相對真空度-0.07Mpa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去甲基叔丁基醚，得到粗產(chǎn)物；
S6、在S5所得粗產(chǎn)物中加入95％乙醇，95％乙醇：粗產(chǎn)物控制在14:1(mL/g)；加入碳酸鈉，碳酸鈉：粗產(chǎn)物控制在1.1:1(g/g)；加入水，水：粗產(chǎn)物控制在5:1(mL/g)，將上述反應(yīng)混合物在氮?dú)饬鞅Ｗo(hù)下回流皂化30min，反應(yīng)溫度控制在40℃；
S7、將S6所得混合物，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用正己烷萃取2次，每次萃取用正己烷:S5中95％乙醇控制在4:1(mL/mL)。萃取所得正己烷層用無水硫酸鈉除水，然后于溫度40℃、相對真空度-0.07Mpa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去正己烷，得到白藜蘆醇-EPA酯，其質(zhì)量為20.5590g。通過上述步驟，白藜蘆醇的酯化率為40.1％。采用高效液相-紫外檢測器(HPLC-UV)的檢測，白藜蘆醇-EPA酯的純度為85.4％。
實(shí)施例5
S1、取0.1mol白藜蘆醇于可密封的玻璃容器中，緩慢加入甲基叔丁基醚，甲基叔丁基醚:白藜蘆醇控制在1:0.039(L/mol)，充分混勻；
S2、取1.1mol EPA加入S1所得溶液中，充分混勻；
S3、取脂肪酶(Novozyme 435，≥5000U/g，EC 3.1.1.3，來自南極假絲酵母)加入S2所得溶液中，酶:白藜蘆醇控制在130:1(g/mol)，然后向玻璃容器充氮?dú)饷芊猓?/p>
S4、將玻璃容器置于恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)溫度為50℃，振蕩速度為180rpm，反應(yīng)時間為72h，反應(yīng)完成后，取出置于冰水浴中冷卻，終止酶解；
S5、將S4所得的溶液經(jīng)0.22μm有機(jī)濾膜過濾，除去脂肪酶，再于溫度40℃、相對真空度-0.07Mpa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去甲基叔丁基醚，得到粗產(chǎn)物；
S6、在S5所得粗產(chǎn)物中加入95％乙醇，95％乙醇：粗產(chǎn)物控制在16:1(mL/g)；加入碳酸鈉，碳酸鈉的質(zhì)量：粗產(chǎn)物控制在1.1:1(g/g)；加入水，水：粗產(chǎn)物控制在5:1(mL/g)，將上述反應(yīng)混合物在氮?dú)饬鞅Ｗo(hù)下回流皂化30min，反應(yīng)溫度控制在40℃；
S7、將S6所得混合物，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用正己烷萃取3次，每次萃取用正己烷:S5中95％乙醇控制在5:1(mL/mL)，萃取所得正己烷層用無水硫酸鈉除水，然后于溫度40℃、相對真空度-0.07Mpa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去正己烷，得到白藜蘆醇-EPA酯，其質(zhì)量為19.7386g。通過上述步驟，白藜蘆醇的酯化率為38.5％。采用高效液相-紫外檢測器(HPLC-UV)的檢測，白藜蘆醇-EPA酯的純度為82.8％。
實(shí)施例6
S1、取0.1mol白藜蘆醇于可密封的玻璃容器中，緩慢加入甲基叔丁基醚，甲基叔丁基醚:白藜蘆醇控制在1:0.03(L/mol)，充分混勻；
S2、取1.0mol EPA加入S1所得溶液中，充分混勻；
S3、取脂肪酶(Novozyme 435，≥5000U/g，EC 3.1.1.3，來自南極假絲酵母)加入S2所得溶液中，酶:白藜蘆醇控制在140:1(g/mol)，然后向玻璃容器充氮?dú)饷芊猓?/p>
S4、將玻璃容器置于恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)溫度為45℃，振蕩速度為180rpm，反應(yīng)時間為96h，反應(yīng)完成后，取出置于冰水浴中冷卻，終止酶解；
S5、將S4所得的溶液經(jīng)0.22μm有機(jī)濾膜過濾，除去脂肪酶，再于溫度40℃、相對真空度-0.08Mpa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去甲基叔丁基醚，得到粗產(chǎn)物；
S6、在S5所得粗產(chǎn)物中加入95％乙醇，95％乙醇：粗產(chǎn)物控制在18:1(mL/g)；加入碳酸鈉，碳酸鈉：粗產(chǎn)物控制在1.2:1(g/g)；加入水，水：粗產(chǎn)物控制在6:1(mL/g)，將上述反應(yīng)混合物在氮?dú)饬鞅Ｗo(hù)下回流皂化30min，反應(yīng)溫度控制在40℃；
S7、將S6所得混合物，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用正己烷萃取2次，每次萃取用正己烷:S5中95％乙醇控制在5:1(mL/mL)，萃取所得正己烷層用無水硫酸鈉除水，然后于溫度40℃、相對真空度-0.08Mpa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去正己烷，得到白藜蘆醇-EPA酯，其其質(zhì)量為21.3792g。通過上述步驟，白藜蘆醇的酯化率為41.7％。采用高效液相-紫外檢測器(HPLC-UV)的檢測，白藜蘆醇-EPA酯的純度為87.8％。
以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。