本發(fā)明涉及一種提高裂殖壺菌DHA和類胡蘿卜素產(chǎn)率的方法。

背景技術(shù)：

二十二碳六烯酸(DHA)屬于ω-3不飽和脂肪酸，人體內(nèi)的DHA主要分布于大腦灰質(zhì)、視網(wǎng)膜細(xì)胞外節(jié)、神經(jīng)系統(tǒng)、母乳、心肌、嗜酸性白細(xì)胞、精子等處，是人體自身不能大量合成但又不可缺少的重要營養(yǎng)素。其具有獨(dú)特的生理作用，主要包括預(yù)防及治療心血管疾病、降血脂、抗炎、健腦益智、提高學(xué)習(xí)記憶能力、改善視網(wǎng)膜功能保護(hù)視力等作用，目前主要應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飼料等行業(yè)。

類胡蘿卜素是一類廣泛存在于自然界中的呈黃色、橙紅色或紅色的脂類化合物，人體自身不能合成類胡蘿卜素，主要通過食物獲取。類胡蘿卜素中最重要的代表是β-胡蘿卜素、番茄紅素、葉黃素、玉米黃質(zhì)、蝦青素和斑蝥黃素。類胡蘿卜素還是重要維生素A原，具有維持視功能、促進(jìn)細(xì)胞分裂、提高免疫力，促進(jìn)胚胎發(fā)育的功能。

裂殖壺菌，又稱裂壺藻，是屬于真菌門(Eumycota)、卵菌綱(Oomycetes)、水霉目(Saprolegniales)、破囊壺菌科(Thraustochytriaceae)的一類海洋真菌，單細(xì)胞、球形。胞內(nèi)不飽和脂肪酸含量極為豐富，主要為ω-3和ω-6系列不飽和脂肪酸，其中DHA占總脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)35％～45％。裂殖壺菌細(xì)胞在生長過程中由于吸收和轉(zhuǎn)化光能自身會合成一些色素，質(zhì)譜分析表明，裂殖壺菌油脂中主要含有β-胡蘿卜素、番茄紅素、蝦青素和角黃素。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提出一種提高裂殖壺菌DHA和類胡蘿卜素產(chǎn)率的方法，通過前期利用甘油為碳源使生物量增加，后期更換碳源為葡萄糖，誘導(dǎo)裂殖壺菌產(chǎn)脂類代謝物(包括DHA和類胡蘿卜素)，在保證DHA產(chǎn)量的前提下，通過優(yōu)化發(fā)酵工藝，降低碳源的使用量，提高DHA和類胡蘿卜素的產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本。

本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種提高裂殖壺菌DHA和類胡蘿卜素產(chǎn)率的方法，具體包括以下步驟：

(1)將裂殖壺菌種利用種子培養(yǎng)基培養(yǎng)裂殖壺菌種子液；

(2)將裂殖壺菌種子液接種到甘油為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中；

(3)在步驟(2)的發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)補(bǔ)加葡萄糖。

優(yōu)選地，所述種子培養(yǎng)基包括葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、海水晶。

優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括葡萄糖、酵母粉、硫酸銨、磷酸氫二鉀、無水硫酸鈉、無水硫酸鎂、硫酸鉀、氯化鉀、氯化鈣、氯化亞錳、硫酸鋅、硫酸銅、鉬酸鈉、硫酸鎳、硫酸亞鐵、氯化鈷、維生素B1、維生素B12、泛酸鈣。

優(yōu)選地，步驟(1)是將在固體培養(yǎng)基上活化長出的裂殖壺菌刮入100ml培養(yǎng)基(500ml三角瓶)中，培養(yǎng)溫度為20-30℃，pH值為5-7，轉(zhuǎn)速為180-220rpm，振蕩培養(yǎng)時(shí)間為1-2天。

優(yōu)選地，步驟(2)是將搖好的裂殖壺菌種子液按6-10％的體積比接種到發(fā)酵罐中培養(yǎng)溫度為20-30℃，pH值為5-7，通氣1-8vvm，攪拌轉(zhuǎn)速300-700rpm，發(fā)酵時(shí)間96h，同時(shí)流加甘油，維持甘油濃度在10-20g/L以上。

優(yōu)選地，步驟(3)是待甘油濃度降至10-20g/L以下，開始流加600g/L葡萄糖補(bǔ)料發(fā)酵，維持pH在7.5-9，待發(fā)酵液中碳源濃度不再降低結(jié)束發(fā)酵。

本發(fā)明產(chǎn)生的有益效果為：本發(fā)明發(fā)酵前期利用甘油為碳源，使菌體生物量增加，發(fā)酵后期切換碳源為葡萄糖，促進(jìn)菌體脂類物質(zhì)積累，包括積累DHA和類胡蘿卜素，最大限度提高DHA和類胡蘿卜素的產(chǎn)率，節(jié)約生產(chǎn)成本，符合工業(yè)生產(chǎn)。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中裂殖壺菌生長情況示意圖。

圖2為實(shí)施例1中裂殖壺菌總脂積累情況示意圖。

圖3為實(shí)施例1中裂殖壺菌DHA占總脂情況示意圖。

圖4為實(shí)施例1、2、3、4消耗碳源情況示意圖。

圖5為實(shí)施例1、2、3、4DHA產(chǎn)量、類胡蘿卜素及碳得率情況示意圖。

其中：圖4、圖5中A為實(shí)施例1純葡萄糖發(fā)酵，B為實(shí)施例1純甘油發(fā)酵，C為實(shí)施例2，D為實(shí)施例3，E為實(shí)施例4。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1：利用葡萄糖或甘油為單一碳源發(fā)酵生產(chǎn)DHA

裂殖壺菌種子培養(yǎng)基：海水晶40g/L，葡萄糖或甘油5g/L，酵母粉1g/L，蛋白胨1g/L。裂殖壺菌發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖或甘油80g/L，酵母粉14.2g/L，硫酸銨1g/L，磷酸氫二鉀3g/L，無水硫酸鈉12g/L，無水硫酸鎂5g/L，硫酸鉀7g/L，氯化鉀2g/L，微量元素10ml/L。

微量元素配方：氯化鈣50mg/L、氯化亞錳5.2mg/L、硫酸鋅5.2mg/L、硫酸銅0.8mg/L、鉬酸鈉0.016mg/L、硫酸鎳0.8mg/L、硫酸亞鐵0.01mg/L、氯化鈷0.066mg/L、維生素B10.76mg/L、維生素B121.2mg/L、泛酸鈣25.6mg/L。

裂殖壺菌種活化，將保存在-80℃凍存管中的裂殖壺菌劃線到固體培養(yǎng)基，28℃，培養(yǎng)4天；將固體培養(yǎng)基上劃線長出的裂殖壺菌刮入100ml培養(yǎng)基(500ml三角瓶)中，28℃，180rpm搖床下培養(yǎng)30h。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1-3結(jié)果表明：

純葡萄糖發(fā)酵時(shí)，4天生物量達(dá)115.4g/L，總脂占干重41.21％，DHA占總脂肪酸40.45％，DHA產(chǎn)量15.61g/L，類胡蘿卜素產(chǎn)量86.25mg/L，消耗葡萄糖1120g；

純甘油發(fā)酵時(shí)，4天生物量113.6g/L，總脂占干重25.14％，DHA占總脂肪酸27.93％，DHA產(chǎn)量7.97g/L，消耗甘油750g。

葡萄糖為碳源菌體生長速度較快、總脂含量高，DHA產(chǎn)量較高，但消耗碳源較多；以甘油為碳源，生物量可以接近葡萄糖，消耗碳源少，但總脂含量低，DHA產(chǎn)量低。

實(shí)施例2：初始以甘油為碳源發(fā)酵，維持甘油濃度在20g/L以上，48h后，待碳源濃度降到20g/L以下開始以葡萄糖為碳源補(bǔ)料發(fā)酵。

裂殖壺菌種子培養(yǎng)基如實(shí)施例1所述。裂殖壺菌發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源為80g/L甘油，其余組成如實(shí)施例1所述。

裂殖壺菌培養(yǎng)方法如實(shí)施例1所述。

初始以甘油為碳源發(fā)酵，48h后待碳源濃度降到20g/L以下開始用600g/L葡萄糖為碳源補(bǔ)料發(fā)酵，發(fā)酵4天，生物量達(dá)100g/L，總脂占干重32.35％，DHA產(chǎn)量14.72g/L，類胡蘿卜素產(chǎn)量441.75mg/L，消耗葡萄糖235g，消耗甘油262g。

本實(shí)施例前期以甘油為碳源使菌體生物量增加，后期轉(zhuǎn)換碳源為葡萄糖，積累DHA和類胡蘿卜素，提高DHA和類胡蘿卜素的產(chǎn)率，節(jié)省原料，提升經(jīng)濟(jì)效益。

實(shí)施例3：初始以甘油為碳源發(fā)酵，維持甘油濃度在20g/L以上，60h后，待碳源濃度降到20g/L以下開始以葡萄糖為碳源補(bǔ)料發(fā)酵。

裂殖壺菌種子培養(yǎng)基如實(shí)施例1所述。裂殖壺菌發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源為80g/L甘油，其余組成如實(shí)施例1所述。

裂殖壺菌培養(yǎng)方法如實(shí)施例1所述。

初始以甘油為碳源發(fā)酵，60h后待碳源濃度降到20g/L以下開始600g/L葡萄糖為碳源補(bǔ)料發(fā)酵，發(fā)酵4天，生物量為50g/L，總脂占干重27.68％，DHA 產(chǎn)量4.96g/L，類胡蘿卜素產(chǎn)量314.25mg/L，消耗葡萄糖150g，消耗甘油376g。

本實(shí)施例，生物量、總脂及DHA產(chǎn)量均較實(shí)施例2相比明顯降低，胡蘿卜素產(chǎn)量也降低。

實(shí)施例4：初始以甘油為碳源發(fā)酵，維持甘油濃度在20g/L以上，72h后，待碳源濃度降到20g/L以下開始以葡萄糖為碳源補(bǔ)料發(fā)酵。

裂殖壺菌種子培養(yǎng)基如實(shí)施例1所述。

裂殖壺菌發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源為80g/L甘油，其余組成如實(shí)施例1所述。

裂殖壺菌培養(yǎng)方法如實(shí)施例1所述。

初始以甘油為碳源發(fā)酵，72h后待碳源濃度降到20g/L以下開始以葡萄糖為碳源補(bǔ)料發(fā)酵，發(fā)酵4天，生物量為112.2g/L，總脂占干重18.56％，DHA產(chǎn)量7.84g/L，類胡蘿卜素產(chǎn)量373.50mg/L，消耗葡萄糖35g，消耗甘油420g。

本實(shí)施例，生物量與純葡萄糖或甘油發(fā)酵接近，但總脂及DHA產(chǎn)量均較低，類胡蘿卜素產(chǎn)量較實(shí)施例2略降低。

結(jié)果如圖4-5可見，以葡萄糖或甘油作為單一碳源發(fā)酵時(shí)，各自具有不同的優(yōu)勢：葡萄糖生長速度快，總脂含量高，適合用于發(fā)酵前期菌體擴(kuò)增，后期油脂積累，但有較多底物轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)，葡萄糖利用率不高；以甘油為碳源，總脂含量及DHA產(chǎn)量較低，但生長速度及生物量較葡萄糖無明顯差別，底物利用率極高，適合前期菌體生長生物量增加，節(jié)約原料，節(jié)省成本。綜上，本發(fā)明中提出前期以甘油為初始碳源，使菌體生長，生物量增加，48h后轉(zhuǎn)換碳源為葡萄糖，促進(jìn)裂殖壺菌DHA和類胡蘿卜素的積累，提高DHA和類胡蘿卜素的產(chǎn)率。

同時(shí)從實(shí)施例2-4中可以看出，采用本發(fā)明的方式制備，消耗的碳源總量較少，優(yōu)選實(shí)施例2中的發(fā)酵時(shí)間為48h時(shí)，其DHA、類胡蘿卜素產(chǎn)量和產(chǎn)率均較高。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。