本發(fā)明涉及一種合成L-天冬氨酸(2,3,3-D3)的方法,尤其涉及一種直接以廉價(jià)的L-天冬氨酸、氘水為原料合成L-天冬氨酸(2,3,3-D3)的方法。
背景技術(shù):
L-天冬氨酸(2,3,3-D3)是重要的穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸,在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、藥學(xué)及化學(xué)等方面具有廣泛的應(yīng)用。L-天冬氨酸(2,3,3-D3)可用于合成穩(wěn)定同位素標(biāo)記多肽化合物,在多肽等的生物代謝、疾病診斷與治療和氨基酸在細(xì)胞培養(yǎng)中的機(jī)理及作用時(shí)具有重要意義。同時(shí),L-天冬氨酸(2,3,3-D3)也是合成其他氘代L-氨基酸的重要原料,如L-賴氨酸(2,3,3-D3)、L-亮氨酸(2,3,3-D3)、L-精氨酸(2,3,3-D3)等;或者合成氘代非生物體L-氨基酸、氘代非生物體β-氨基酸等的重要原料。
目前合成L-天冬氨酸(2,3,3-D3)主要有以下幾種方法:
1、以丁炔二酸二甲酯為原料,先還原成丁烯二酸二甲酯(2,3-D2),然后水解形成丁烯二酸(2,3-D2),最后在氘代氨水存在的條件下利用細(xì)菌生物合成形成L-天冬氨酸(2,3,3-D3);
本方法先由丁炔二酸二酯,用氘氣還原或氘水存在下用三苯基膦催化得到丁烯二酸二酯(2,3-D2),隨后將二酯水解成酸后,在細(xì)菌的作用下與氘代氨水進(jìn)行生物合成而得到L-天冬氨酸(2,3,3-D3),綜合產(chǎn)率為40-50%。此方法直接采用氘水和氘代氨水合成,具有氘利用率高的特點(diǎn),但此方法反應(yīng)路線較長(zhǎng),特別是使用細(xì)菌進(jìn)行合成時(shí)需要對(duì)細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)和處理,過(guò)程較為繁瑣。
2、用氘代溴代乙酸乙酯或氘代碘代乙酸乙酯與氨基酸合成子如乙酰氨基丙二酸二乙酯、二苯亞甲基氨基乙腈等結(jié)合,然后在氘水或氘代鹽酸存在的條件下水解得到L-天冬氨酸(2,3,3-D3)或DL-天冬氨酸(2,3,3-D3)。但此種方法步驟較長(zhǎng),且手性合成子合成成本高,非手性合成子則需要進(jìn)行拆分,同時(shí)過(guò)多的無(wú)機(jī)鹽需要用樹(shù)脂進(jìn)行純化,過(guò)程較為繁瑣。
綜上可知,目前合成L-天冬氨酸(2,3,3-D3)的方法均較為繁瑣,或需要進(jìn)行拆分,或綜合產(chǎn)率嚴(yán)重偏低,且需要用樹(shù)脂進(jìn)行純化。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
針對(duì)上述缺點(diǎn),本發(fā)明的目的在于提供一種一種酶催化制備L-天冬氨酸(2,3,3-D3)的方法,該方法價(jià)格低廉,反應(yīng)過(guò)程簡(jiǎn)單易控,反應(yīng)條件溫和,產(chǎn)品提純方便,產(chǎn)率高,成本低。
一種酶催化制備L-天冬氨酸(2,3,3-D3)的方法,包括以下步驟:
在堿性條件下,L-天冬氨酸或其鹽和氘水在谷草轉(zhuǎn)氨酶和酶輔劑的作用下發(fā)生酶催化反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后,經(jīng)過(guò)后處理得到所述的L-天冬氨酸(2,3,3-D3)。
本發(fā)明通過(guò)采用谷草轉(zhuǎn)氨酶和酶輔劑作為酶催化劑,直接采用L-天冬氨酸為原料,以價(jià)廉易得的氘水為氘源,不需要拆分,一步直接合成L-天冬氨酸(2,3,3-D3),整個(gè)操作過(guò)程簡(jiǎn)單易控,最后得到的產(chǎn)品的氘豐度高。
本發(fā)明的具體的合成路線如下:
pD值會(huì)對(duì)產(chǎn)品的氘豐度產(chǎn)生較大的影響,作為優(yōu)選,所述的堿性條件下的pD值為8.0-9.0。
作為優(yōu)選,所述的堿為氘氧化鈉氘水溶液、碳酸鋰氘水溶液或三乙胺氘水溶液;為了提高純化效率和節(jié)省反應(yīng)成本,反應(yīng)過(guò)程中可以采用碳酸鋰、無(wú)水三乙胺調(diào)節(jié)溶液pH值,從而降低氘用量。
作為優(yōu)選,所述的酶輔劑為α-酮戊二酸或α-酮戊二酸鹽。
酶催化反應(yīng)的溫度和時(shí)間也會(huì)對(duì)氘豐度產(chǎn)生較大的影響,作為優(yōu)選,所述的酶催化反應(yīng)的溫度為32-42℃,所述的酶催化反應(yīng)的時(shí)間為1~5天。
作為優(yōu)選,所述的谷草轉(zhuǎn)氨酶的用量為20-100U,所述的輔酶劑與所述L-天冬氨酸或其鹽的摩爾比為1:0.01~0.2。
本發(fā)明中,所述的后處理過(guò)程如下:先采用微孔濾膜過(guò)濾除去酶,然后減壓蒸餾回收大部分氘水,再用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值約為2.5-3.2,然后采用無(wú)水醇進(jìn)行結(jié)晶得到所述的L-天冬氨酸(2,3,3-D3)。其中,后處理過(guò)程所使用的酸和醇都是普通的酸和醇,不需要采用氘代試劑。
作為優(yōu)選,所述的醇為無(wú)水乙醇或無(wú)水甲醇,用量為1~50倍體積。
同現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在:
(1)本發(fā)明直接使用價(jià)廉易得的L-天冬氨酸為起始原料,氘水為單一氘源一步氫-氘交換合成了L-天冬氨酸(2,3,3-D3),步驟簡(jiǎn)單,反應(yīng)條件溫和;
(2)本發(fā)明避免使用樹(shù)脂純化,極大地簡(jiǎn)化了純化步驟,節(jié)省了大量的溶劑和合成成本;
(3)本發(fā)明避免使用細(xì)胞或細(xì)菌進(jìn)行催化轉(zhuǎn)化,省去了細(xì)胞或細(xì)菌的生物培養(yǎng)過(guò)程,直接采用酶,簡(jiǎn)單高效;
(4)本發(fā)明避免使用低溫或高溫,這對(duì)于避免發(fā)生手性消旋引起旋光度下降或者因密封問(wèn)題引起的氘氫交換而引起氘豐度下降具有很重要的意義。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
向連有氬氣保護(hù)氣、溫度計(jì)的100ml三口燒瓶中,依次加入300mg L-天冬氨酸、10mgα-酮戊二酸,油泵置換三次,然后加入10mL氘水,再先加入2-5滴氘氧化鈉溶液(10%)使固體溶清,然后再用氘氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pD值為8.0-9.0,最后加入20-50U的谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT),密封下保溫至32-36℃反應(yīng)3-5天,LC-MS監(jiān)控反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后,先用微孔濾膜過(guò)濾除去少量固體及酶,然后減壓蒸餾回收氘水,約蒸去70-80%氘水,再用稀鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH值至2.5-3.0,靜置冷藏結(jié)晶(0-10℃),析出白色固體。過(guò)濾,濾餅用冰水洗滌,干燥,得到產(chǎn)品約210mg,產(chǎn)率68.9%,產(chǎn)品用手性柱測(cè)定ee值>98%,純度>98%,LC-MS和1HNMR確定氘豐度>96%。
實(shí)施例2
向連有氮?dú)獗Wo(hù)氣、溫度計(jì)的100ml三口燒瓶中,依次加入500mg L-天冬氨酸二鈉鹽、10mgα-酮戊二酸二鈉鹽,油泵置換三次,然后加入15mL氘水使固體溶清,然后再用氘氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pD值為8.0-9.0,最后加入20-50U的谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT),密封下保溫至32-39℃反應(yīng)1-3天,LC-MS監(jiān)控反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后,先用微孔濾膜過(guò)濾除去少量固體及酶,然后減壓蒸餾回收氘水,約蒸去70-80%氘水,再用稀鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH值至2.5-3.0,靜置冷藏結(jié)晶(0-10℃),析出白色固體。過(guò)濾,濾餅用冰水洗滌,干燥,得到產(chǎn)品約400mg,產(chǎn)率79.2%,產(chǎn)品用手性柱測(cè)定ee值>99%,純度>98%,LC-MS和1HNMR確定氘豐度>97%。
實(shí)施例3
向連有氬氣保護(hù)氣、溫度計(jì)的100ml三口燒瓶中,依次加入300mg L-天冬氨酸、10mgα-酮戊二酸、167mg碳酸鋰,油泵置換三次,然后加入10mL氘水使固體溶清,期間會(huì)有氣體產(chǎn)生,然后再用碳酸鋰氘水溶液調(diào)節(jié)其pD值為8.0-9.0,最后加入20-50U的谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT),密封下保溫至34-40℃反應(yīng)2-4天,LC-MS監(jiān)控反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后,先用微孔濾膜過(guò)濾除去少量固體及酶,然后減壓蒸餾回收氘水,約蒸去70-80%氘水,再用稀鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH值至2.5-3.0,加入10倍體積的無(wú)水乙醇,靜置冷藏結(jié)晶(0-10℃),析出白色固體。過(guò)濾,濾餅用冷無(wú)水乙醇洗滌,干燥,得到產(chǎn)品約275mg,產(chǎn)率90.8%,產(chǎn)品用手性柱測(cè)定ee值>98%,純度>99%,LC-MS和1HNMR確定氘豐度>97%。
對(duì)比例1
向連有氬氣保護(hù)氣、溫度計(jì)的100ml三口燒瓶中,依次加入300mg L-天冬氨酸、10mg吡哆醛鹽酸鹽,油泵置換三次,然后加入10mL氘水,再先加入2-5滴氘氧化鈉溶液(10%)使固體溶清,然后再用氘氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pD值為8.0-9.0,最后加入20-50U的谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT),密封下保溫至35-38℃反應(yīng)5-6天,采用LC-MS監(jiān)控反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束之后,先用水相微孔濾膜過(guò)濾除去少量固體以及酶,然后減壓蒸餾以回收氘水,約蒸去70-80%氘水后,再用稀鹽酸調(diào)節(jié)殘余溶液pH值至2.5-3.0,靜置冷藏(0-10℃)結(jié)晶,析出白色固體。過(guò)濾,濾餅用冰水-無(wú)水乙醇洗滌,干燥,得到產(chǎn)品約200mg,產(chǎn)率65.8%,純度>98%,LC-MS和1HNMR確定氘豐度約為87%。