專利名稱：生產(chǎn)l－賴氨酸的棒狀菌和制備賴氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及棒狀菌的生產(chǎn)L-賴氨酸的菌株，其具有擴(kuò)增的pyc基因(丙酮酸羧化酶基因)，在這些菌株中，選自包括dapA基因(二氫吡啶二羧酸合酶基因)，lysC基因(天冬氨酸激酶基因)，lysE基因(賴氨酸輸送載體基因)和dapB基因(二氫吡啶二羧酸還原酶基因)的組的附加基因，特別是dapA基因得到擴(kuò)增，尤其是得到超量表達(dá)，本發(fā)明也涉及制備L-賴氨酸的方法。
L-賴氨酸是商業(yè)上重要的L-氨基酸，尤其是用作動物營養(yǎng)中的飼料添加劑。近年來需求量一直穩(wěn)步增加。
L-賴氨酸由棒狀菌，尤其是谷氨酸棒桿菌的生產(chǎn)L-賴氨酸的菌株的發(fā)酵過程產(chǎn)生。由于這一產(chǎn)物非常重要，人們不斷嘗試改進(jìn)其制備過程。對過程的改進(jìn)可以涉及牽涉發(fā)酵技術(shù)的手段，攪拌和氧供給，或營養(yǎng)培養(yǎng)基的組成(如發(fā)酵期間的糖濃度)，或產(chǎn)物的檢測(如經(jīng)離子交換色譜)，或微生物自身的內(nèi)在產(chǎn)生特征。
這些微生物的生產(chǎn)能力的特性通過利用誘變，選擇以及突變體選擇的方法來改善，以給出對抗代謝物(例如S-(2-氨乙基)半胱氨酸)具有抗性，氨基酸(例如L-亮氨酸)營養(yǎng)缺陷，并產(chǎn)生L-賴氨酸的菌株。
一些年來重組DNA技術(shù)的方法也曾用于通過擴(kuò)增個體生物合成基因改進(jìn)谷氨酸棒桿菌的L-賴氨酸生產(chǎn)菌株，并且研究了對L-賴氨酸生產(chǎn)影響。
就此而言，EP-A-0 088 166報道了在賦予對氨乙基半胱氨酸的抗性的DNA片段擴(kuò)增后生產(chǎn)能力增強(qiáng)。EP-B-0 387 527報道了編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysC等位基因擴(kuò)增后生產(chǎn)能力增強(qiáng)。EP-A-0197 335報道了編碼二氫吡啶二羧酸合酶的dapA基因擴(kuò)增后生產(chǎn)能力增強(qiáng)。EP-A-0 219 027報道了編碼天冬氨酸半醛脫氫酶的基因擴(kuò)增后生產(chǎn)能力增強(qiáng)。Pisabarro等(細(xì)菌學(xué)雜志175(9)，2743-2749(1993)描述了編碼二氫吡啶二羧酸還原酶的dapB基因。
也已經(jīng)研究了主要代謝基因的擴(kuò)增對L-賴氨酸生產(chǎn)的影響。就此而言，EP-A-0 219 027報道了編碼天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的aspC基因擴(kuò)增后生產(chǎn)能力增強(qiáng)。EP-A-0 143 195和EP-A-0 358 940報道了編碼烯醇丙酮酸磷酸羧化酶的ppc基因擴(kuò)增后生產(chǎn)能力增強(qiáng)。DE-B-19831609報道了編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因擴(kuò)增后生產(chǎn)能力增強(qiáng)。受丙酮酸羧化酶催化的添補(bǔ)反應(yīng)與受烯醇丙酮酸磷酸羧化酶催化的反應(yīng)相比特別重要。這樣，Wendisch等(FEMS微生物學(xué)通訊，112，269-274(1993))顯示關(guān)閉ppc基因不削弱菌株MH20-22B的賴氨酸產(chǎn)生。
最后，DE-A-195 48 222描述了由lysE基因編碼的L-賴氨酸輸送載體的活性增加促進(jìn)賴氨酸生產(chǎn)。
除這些擴(kuò)增個體基因的試圖之外，也嘗試了在棒狀菌中同時擴(kuò)增兩個或更多個基因，進(jìn)而改進(jìn)L-賴氨酸生產(chǎn)。就此而言，DE-B-38 23451報道了同時擴(kuò)增大腸桿菌asd基因和dapA基因后，生產(chǎn)能力增加。DE-A39 43 117公開了同時擴(kuò)增編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysC等位基因和dapA基因基因后，生產(chǎn)能力增加。EP-A-0 841 395特別報道了同時擴(kuò)增編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysC等位基因和dapB基因基因后，生產(chǎn)能力增加；進(jìn)一步的改進(jìn)可以由dapB，lysA，以及ddh基因的額外擴(kuò)增完成。EP-A-0 854 189描述了同時擴(kuò)增編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysC等位基因和dapA，dapB，lysA和aspC基因后生產(chǎn)能力增強(qiáng)。EP-A-0 857 784特別報道了同時擴(kuò)增編碼反饋抗性酶的lyse等位基因和lysA基因后生產(chǎn)能力增強(qiáng)；進(jìn)一步的改進(jìn)可以由ppc基因的額外擴(kuò)增完成。
由許多現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)中所描述的方法可以清楚看出，需要開發(fā)新的方法并改進(jìn)用棒狀菌生產(chǎn)賴氨酸的現(xiàn)行的方法。
發(fā)明人對自己提出的目的是提供新的棒狀菌的L-賴氨酸生產(chǎn)菌株和制備L-賴氨酸的方法。
L-賴氨酸是商業(yè)上重要的L-氨基酸，尤其是用作動物營養(yǎng)中的飼料添加劑。
當(dāng)L-賴氨酸或賴氨酸在下文中提及時，應(yīng)當(dāng)理解為其不僅包括其本身，而且包括適當(dāng)?shù)柠}，例如賴氨酸鹽酸鹽或賴氨酸硫酸鹽。
本發(fā)明提供了棒狀菌的L-賴氨酸生產(chǎn)菌株，它們具有擴(kuò)增的pyc基因(丙酮酸羧化酶基因)，其中選自包括dapA基因(二氫吡啶二羧酸合酶基因)，lysC基因(天冬氨酸激酶基因)，lysE基因(賴氨酸輸送載體基因)和dapB基因(二氫吡啶二羧酸還原酶基因)組的附加基因，尤其是dapA基因得到擴(kuò)增，尤其是得到超量表達(dá)。
也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，位于dapB基因上游(5’末端)的新的DNA序列，其攜帶dapB啟動子的-35區(qū)，對dapB基因的表達(dá)是有利的。其顯示在SEQ ID No．1中。
因此，也要求了具有在SEQ ID No．1中顯示的核苷酸序列的能夠復(fù)制的DNA。
本發(fā)明也提供了保藏在菌株DSM12868與DSM12867中的SEQID No．5和SEQ ID No．6中顯示的dapA啟動子的MC20和MA16突變。
本發(fā)明也涉及棒狀菌的L-賴氨酸生產(chǎn)菌株，其具有擴(kuò)增過的pyc基因，在這些菌株中，dapA基因和dapB基因得到了同時擴(kuò)增，尤其是得到超量表達(dá)。
本發(fā)明也涉及棒狀菌的L-賴氨酸生產(chǎn)菌株，其具有擴(kuò)增過的pyc基因，在這些菌株中，dapA，dapB以及l(fā)ysE基因得到了同時擴(kuò)增，尤其是得到超量表達(dá)。
在本說明書上下文中，術(shù)語“擴(kuò)增”描述的是利用強(qiáng)啟動子或利用編碼具有高活性的適當(dāng)酶的基因，或者可以也可以不組合這兩種手段增加基因的拷貝數(shù)，來增加由適當(dāng)DNA編碼的一種或多種酶在微生物中的胞內(nèi)活性。
本發(fā)明也提供了利用以上所描述的細(xì)菌制備L-賴氨酸的方法。
本發(fā)明提供的微生物可以從葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉或纖維素或從甘油和乙醇，尤其是從葡萄糖或蔗糖制備L-賴氨酸。所說的微生物是棒狀菌，尤其是棒桿菌屬的。在棒桿菌屬中，可以特別提及的是谷氨酸棒桿菌，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道其生產(chǎn)氨基酸的能力。這一物種包括野生型菌株，如谷氨酸棒桿菌ATCC13032，黃色短桿菌ATCC14067，Corynebacterium melassecola ATCC17965和來源于它們的菌株或突變體。棒狀菌的生產(chǎn)L-賴氨酸的突變體的例子如谷氨酸棒桿菌FERM-P 1709黃色短桿菌FERM-P 1708乳發(fā)酵短桿菌FERM-P 1712黃色短桿菌FERM-P 6463黃色短桿菌FERM-P 6464谷氨酸棒桿菌DSM 5714谷氨酸棒桿菌DSM 12866現(xiàn)在發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，除pyc基因之外的lysE基因的擴(kuò)增表達(dá)，或編碼反饋抗性天冬氨酸激酶lysC等位基因的額外擴(kuò)增表達(dá)，或dapB基因的額外擴(kuò)增表達(dá)，尤其是，dapA基因的額外擴(kuò)增表達(dá)，分別或同時進(jìn)一步改進(jìn)L-賴氨酸的生產(chǎn)。
也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對給定的pyc基因的表達(dá)而言，dapA與dapB基因的同時額外擴(kuò)增表達(dá)進(jìn)一步地為L-賴氨酸生產(chǎn)帶來益處。
最后，發(fā)明者也發(fā)現(xiàn)，對給定的pyc基因的表達(dá)而言，dapA，dapB以及l(fā)ysE基因的同時額外擴(kuò)增表達(dá)對L-賴氨酸生產(chǎn)格外有利。
擴(kuò)增(超量表達(dá))是通過增加適當(dāng)?shù)幕虻目截悢?shù)，或突變位于結(jié)構(gòu)基因上游的啟動子和調(diào)節(jié)區(qū)，或者核糖體結(jié)合位點(diǎn)。摻入結(jié)構(gòu)基因上游的表達(dá)盒以相同的方式工作。在經(jīng)發(fā)酵形成L-賴氨酸期間，誘導(dǎo)型啟動子額外地使增加表達(dá)成為可能。延期mRNA壽命的手段也改善表達(dá)。此外，酶活性也通過阻止酶蛋白質(zhì)的降解，將基因或基因構(gòu)建體位于可變拷貝數(shù)質(zhì)粒(穿梭載體)中或者在染色體中整合和擴(kuò)增而得到提高。此外，通過改變培養(yǎng)基的組成和培養(yǎng)技術(shù)，獲得目標(biāo)基因的超量表達(dá)也是可能的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會從下列文獻(xiàn)中找到有關(guān)說明Martin等(生物／技術(shù)5，137-146(1987))，Guerrero等(基因138，35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(生物／技術(shù)6，428-430(1988))，Eikmanns等(基因102，93-98(1991))，EP-0 472 869，US 4，601，893，Schwarzer和POhler(生物／技術(shù)9，-84-87(1991))，Reinscheid等(應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)60，126-132(1994))，LaBarre等(細(xì)菌學(xué)雜志175，1001-1007(1993))，專利出版物WO 96／15246，Malumbres等(基因134，15-24(1993))，日本Offenlegungsschrift JP-A-10-229891，Jensen和Hammer(生物技術(shù)和生物工程58，191-195(1998))或者美國細(xì)菌學(xué)會“普通細(xì)菌學(xué)方法手冊”(華盛頓DC，USA，1981)和公知的遺傳學(xué)與分子生物學(xué)手冊。
根據(jù)本發(fā)明所利用的谷氨酸棒桿菌的基因已被描述，并且可以用已知方法分離，制備或合成。
以下文獻(xiàn)特別描述了定點(diǎn)誘變方法Higuchi等(核酸研究16，7351-7367(1988))，Silver等，Innis，Glefand和Sninsky(編者)手冊，題為PCR策略(學(xué)術(shù)出版社，倫敦，UK，1995)。
從谷氨酸棒桿菌分離目的基因的第一個步驟是為了在例如大腸桿菌中構(gòu)建這一微生物的基因文庫，或者也可以是在谷氨酸棒桿菌中構(gòu)建該文庫?；蛭膸斓臉?gòu)建在一般性的公知的教科書和手冊中有記載?？商峒暗睦邮荳innacker的教科書，題為從基因到克隆，基因技術(shù)導(dǎo)論(Verlag Chemie，Weinheim，德國，1990)或Sambrook等的手冊，題為分子克隆，實(shí)驗室手冊(冷泉港實(shí)驗室出版社，1989)。Bathe等(分子和普通遺傳學(xué)，252255-265(1996))描述了利用粘粒載體SuperCosI(Wahl等美國國家科學(xué)院學(xué)報84，2160-2164(1987))在大腸桿菌K-12 NM554(Raleigh等，核酸研究161563-1575(1988))中構(gòu)建的谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因文庫。Brmann等(分子微生物學(xué)6(3)，317-326)依次描述了采用粘粒pHC79(Hohn和Collins，基因11，291-298(1980))構(gòu)建的谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因文庫。谷氨酸棒桿菌在大腸桿菌中的基因文庫也可以采用質(zhì)粒如pBR322(Bolivar，生命科學(xué)25，807-818(1979))或pUC19(Norrander等，基因26101-106(1983))構(gòu)建。以相同的方式，也可能使用穿梭載體，如pJC1(Cremer等，分子和普通遺傳學(xué)220，478-480(1990))或pECS(Eikmanns等，基因102，93-98(1991))，這樣的載體在大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中復(fù)制。再構(gòu)和／或重組缺陷菌株是特別合適的宿主，例子是大腸桿菌菌株DH5αmcr，該菌株由Grant等(美國國家科學(xué)院院報87，4645-4649(1990))描述過。其它例子是再構(gòu)缺陷的谷氨酸棒桿菌菌株RM3和RM4，它們由Schffer等(應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)60(2)，756-759(1994))描述過。
然后，通過轉(zhuǎn)化(Hanahan，分子生物學(xué)雜志166，557-580(1983))或電穿孔(Tauch等，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通訊，123343-347(1994))將基因文庫轉(zhuǎn)移到指示菌株中。指示菌株的特征是其具有目的基因突變，這導(dǎo)致可檢測的表型，例如營養(yǎng)缺陷型。指示菌株或突變體可由公開的來源或菌株保藏中心(例如耶魯大學(xué)遺傳保藏中心(New Haven，Connect-icut，USA))獲得，或如果必要特別制備。這樣的指示菌株的例子可提及的是需要內(nèi)消旋二氨基庚二酸的大腸桿菌菌株RDA8(Richaud等，C．R．Acad．Sci．Paris Ser．Ⅲ 293507-512(1981))，其在dapA基因中攜帶突變(dapA∷Mu)。
在攜帶目的基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化指示菌株和目的基因表達(dá)后，就適當(dāng)?shù)奶卣鞫裕甘揪瓿蔀樵B(yǎng)型的。如果克隆的DNA片段賦予例如針對抗代謝物S-(2-氨乙基)半胱氨酸之類的抗性，攜帶重組質(zhì)粒的指示菌株可以通過在適當(dāng)?shù)匮a(bǔ)充營養(yǎng)物的培養(yǎng)基上選擇鑒別。
如果目的基因區(qū)的核苷酸序列是已知的或由數(shù)據(jù)庫可獲得的，則可以用已知方法分離染色體DNA，例如如Eikmanns等(微生物學(xué)140，1817-1828(1994))描述的方法。可以采用合適的引物通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)合成目的基因，并克隆進(jìn)合適的質(zhì)粒載體中，例如Invitrogen的pCRIITOPO(Groningen，荷蘭)。PCR方法的梗概可以從Newton和Graham的題為PCR的書中找到(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，德國，1994)。
公眾可利用的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫的例子是歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗室的數(shù)據(jù)庫(EMBL，Heidelberg，德國)或生物技術(shù)信息國家中心的數(shù)據(jù)庫(NCBI，Bethesda，MD，美國)。
從谷氨酸棒桿菌ATCC13032分離與克隆pyc基因在DE-A-19831609和Koffas等(應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)1050，346-352(1988))中有描述。pyc基因的核苷酸序列可以以登記號AF038548或Y09548獲得。
從谷氨酸棒桿菌ATCC13032分離與克隆lysE基因在DE-A-19548222中有描述。lysE基因的核苷酸序列可以以登記號X96471獲得。
從各種谷氨酸棒桿菌中分離，克隆以及測序dapA基因在下列文獻(xiàn)中有描述Cremer等(分子和普通遺傳學(xué)220478-480(1990))，Pisabarro等(細(xì)菌學(xué)雜志1752743-2749(1993))和Bonnassie等(核酸研究186421(1990))。DE-B-39 43 117報道了借助質(zhì)粒pJC23擴(kuò)增dapA基因。dapA基因的核苷酸序列可以以登記號X53993獲得。
從Brevibacterium lactofermentum分離，克隆以及測序dapB基因由Pisabarro等(細(xì)菌學(xué)雜志1752743-2749(1993))描述過。dapB基因的核苷酸序列可以以登記號X67737獲得。
編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysC基因和lysC等位基因分離，克隆以及測序由幾個作者報道過。就此而言，Kalinowski等(分子和普通遺傳學(xué)224317-324(1990))報道了來源于谷氨酸棒桿菌菌株DM58-1的lysC等位基因。DE-A-3943117報道了谷氨酸棒桿菌菌株MH2OlysC等位基因的克隆。Follettie等(細(xì)菌學(xué)雜志1754096-4103(1993))報道了黃色棒桿菌菌株N13的lysC等位基因，其可以在所說的出版物中找到。lysC基因和各種lysC等位基因的核苷酸序列可以以登記號X57226和E06826獲得。
然后，可以單獨(dú)或適當(dāng)組合將以這一方法獲得的基因摻入進(jìn)質(zhì)粒載體中，例如pJCl(Cremer等，分子和普通遺傳學(xué)220，478-480(1990))或pECS(Eikmanns等，基因，102，93-98(1991))，通過轉(zhuǎn)化例如如Thierbach等(應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)29，356-362(1988))中描述的，或通過電穿孔，例如如Dunican和Shivnan(生物／技術(shù)7，1067-1070(1989))中所描述的轉(zhuǎn)移到所需的棒狀菌菌株中，例如菌株MH2O-22B(Schrumpf等，應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)37566-571(1992))，并表達(dá)。待選擇的菌株可以用兩種質(zhì)粒載體同樣好地轉(zhuǎn)化，各質(zhì)粒載體含有所說基因或目的基因，從而獲得除了已知擴(kuò)增的pyc基因外。有利的同時擴(kuò)增表達(dá)的兩種或多種基因，這些菌株的例子是菌株MH20-22B／pJC23／pEC7pyc，其中pyc和dapA基因同時擴(kuò)增，并被表達(dá)，或菌株MH20-22B／pJC33／pEC7pyc，其中pyc基因和lysC(FBR)等位基因同時擴(kuò)增，尤其是超量表達(dá)，或菌株MH20-22B／pJ23／pEC7dapBpyc，其中pyc，dapA和dapB基因同時擴(kuò)增，尤其是超量表達(dá)，或菌株MH20-22B／pJC23／pEC7lysEdapBpyc，其中pyc，dapA，dapB和lysE基因同時擴(kuò)增，尤其是超量表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明制備的微生物可以培養(yǎng)來連續(xù)生產(chǎn)L-賴氨酸，或者通過分批發(fā)酵，流加分批方法或重復(fù)流加分批方法不連續(xù)生產(chǎn)L-賴氨酸。已知培養(yǎng)方法的概述在Chmiel的教科書(Bioprozesstechnik 1．Einfhrung in die Bioverfahrenstechnik(生物技術(shù)1．生物工程導(dǎo)論)(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991)或Storhas的教科書(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(生物反應(yīng)器和配套設(shè)備)(Vieweg Verlag，Brunswick／Wiesbaden，1994))中有描述。
所利用的培養(yǎng)基必須適合特定微生物的需要。各種微生物的培養(yǎng)基的描述在美國細(xì)菌學(xué)學(xué)會(華盛頓D．C．，USA，1981)的“普通細(xì)菌學(xué)方法手冊”中找到?？梢岳锰荚词翘呛吞妓衔铮缙咸烟?，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉和纖維素，油和脂肪，例如大豆油，向日葵油，落花生油和椰子脂肪，脂肪酸，例如棕櫚酸，硬脂酸和亞油酸，醇，例如甘油和乙醇，以及有機(jī)酸，例如乙酸。這些物質(zhì)可以單獨(dú)或混合使用。可以利用氮源是有機(jī)含氮化合物，如胨，酵母提取物，肉膏，麥芽抽提物，玉米漿，大豆粉和尿素，或無機(jī)化合物，如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。氮源可以單獨(dú)或混合使用?？梢岳玫牧自词橇姿岫溻浕蛄姿釟涠浕?qū)?yīng)的鈉鹽。培養(yǎng)基也必須含有金屬鹽，例如硫酸鎂或硫酸鐵，這對生長必需的。最后，除以上提及的物質(zhì)之外，可以使用必需的促生長物質(zhì)如氨基酸和維生素。所說的添加物可以一次或分批添加到培養(yǎng)基中。
培養(yǎng)的pH通過適當(dāng)使用堿性化合物，如氫氧化鈉，氫氧化鉀或氨，或酸性化合物，如磷酸或硫酸控制?？梢杂美孟輨?，如脂肪酸聚乙二醇酯控制。質(zhì)粒的穩(wěn)定性可以通過向培養(yǎng)基中添加合適的選擇性作用物保持，例如抗生素。需氧條件可以通過向培養(yǎng)基中引入氧或含氧的氣體混合物保持，例如空氣。培養(yǎng)溫度通常是20℃-45℃，優(yōu)選的是25℃-40℃。繼續(xù)培養(yǎng)，直到L-賴氨酸的形成達(dá)到最大值。這一目標(biāo)通常在10小時160小時之內(nèi)達(dá)到。
形成的L-賴氨酸的濃度可以借助氨基酸分析儀經(jīng)離子交換層析和與茚三酮的柱后反應(yīng)測定，如Spackmann等(分析化學(xué)30，1190(1958))描述的。
下列微生物按照布達(dá)佩斯條約的條款保藏在德意志微生物保藏中心((DSMZ)，Brunswick，德國)大腸桿菌K-12菌株DH5α／pEC7pyc，保藏號DSM12870大腸桿菌K-12菌株DH5α／pEC7dapBpyc，保藏號DSM12873大腸桿菌K-12菌株DH5α/pEC7lysEdapBpyc，保藏號DSM12874谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715／pJC23，保藏號DSM12869
谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715aecD∷dapA(MA16)，保藏號DSM12867谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715aecD∷dapA(MC20)，保藏號DSM12868谷氨酸棒桿菌菌株DM678，保藏號DSM12866大腸桿菌K-12菌株DH5α／pEC7lysEpyc，保藏號DSM12872大腸桿菌K-12菌株DH5α／pEC7dapBlysE，保藏號DSM12875大腸桿菌K-12菌株DH5α／pEC7lysE，保藏號DSM12871
借助在0．8％瓊脂糖凝膠上的電泳鑒別攜帶lysE基因的擴(kuò)增過的約1．1 kb DNA片段，用來源于Qiagen(Hilden,德國)的QIAquick凝膠抽提試劑盒(產(chǎn)品號28704)從凝膠上分離并純化。
然后借助來源于寶靈格曼海姆(曼海姆，德國)的T4 DNA連接酶將給片段連接至載體pUC18(Norrander等，基因(26)101-106(1983))上。這一過程通過以限制性內(nèi)切核酸酶SmaⅠ充分切割載體pUC18完成，并且用堿性磷酸酶(寶靈格曼海姆，曼海姆，德國)處理來完成。將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株DH5α(Hanahan，DNA克隆，一種操作方法，Vol．I．IRL-出版社，牛津，華盛頓DC，USA)。通過在LB瓊脂(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗室手冊。第二版。冷泉港實(shí)驗室出版社，冷泉港，N．Y．)上平板接種轉(zhuǎn)化混合物選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞，所說的瓊脂上補(bǔ)充有氨芐青霉素50 mg／l。從轉(zhuǎn)化子分離質(zhì)粒DNA，并且通過用限制酶BamHⅠ處理，其后用瓊脂糖凝膠電泳檢查。該質(zhì)粒稱為pUC18lysE。實(shí)施例2 dapB的制備如實(shí)施例1所述，從谷氨酸棒桿菌菌株ATCC 13032分離染色體DNA。這樣的來源于谷氨酸棒桿菌的dapB基因的序列是已知的(登記號X67737)。然而，所出版的DNA序列僅包括翻譯起始位點(diǎn)上游的56 bp，因此翻譯起始位點(diǎn)的5’末端上游被附加測序。
測序利用在已知dapB序列(登記號X67737)的區(qū)中結(jié)合的引物寡核苷酸以質(zhì)粒pJC25(EP-B 0435 132)進(jìn)行。所利用的測序引物的序列是5′GAA CGC CAA CCT TGA TTC C3′測序用由Sanger等，美國國家科學(xué)院院報，(74)5463-5467(1977)描述的鏈終止方法進(jìn)行。測序反應(yīng)是借助AutoRead測序試劑盒(Pharmacia，F(xiàn)reiburg)完成的。對測序產(chǎn)品的電泳分析和檢測用Pharmacia(Freiburg，德國)的A．L．F．DNA測序儀完成。
所獲得的DNA序列用來選擇第二引物，以獲得轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的進(jìn)一步的序列數(shù)據(jù)。下列引物選擇來用于該目的5′CTT TGC CGC CGT TGG GTT C3′如上的描述進(jìn)行測序反應(yīng)，dapB基因的新上游序列顯示在SEQID No．1中。包括dapB基因核苷酸序列的序列顯示在SEQ ID No．2中。
聚合酶鏈反應(yīng)用來擴(kuò)增dapB基因。對于這一目的而言，由MWGBiotech合成在dapB基因的已知DNA序列基礎(chǔ)上選擇的兩引物寡核苷酸P-dap5′(AAG CTT)AGG TTG TAG GCG TTG AGC 3′dapall5′TTA ACT TGT TCG GCC ACA GC 3′5′引物(引物P-dap)含有HindⅢ切割位點(diǎn)，以上序列中由括弧表示。如實(shí)施例1進(jìn)行PCR。以這種方法擴(kuò)增約1．1 kb DNA片段，其攜帶dapB基因并含有在末端的限制性內(nèi)切核酸酶HindⅢ切割位點(diǎn)。從0．8％瓊脂糖凝膠(QIAquick凝膠抽提試劑盒，來源于Qiagen，Hilden，德國)純化所獲得的PCR片段，用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen，Leek，荷蘭，產(chǎn)品號K4550-01)克隆進(jìn)克隆載體pCR2．1TOPO。將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)Invitrogen的大腸桿菌菌株TOP10F′，將轉(zhuǎn)化混合物平板接種在含有卡那霉素(50 mg／l)，IPTG(0．16mM)和X-Gal(64 mg／l)的LB培養(yǎng)基上，分離卡那霉素抗性菌落。借助Qiagen的Q1Aprep旋轉(zhuǎn)小量制備試劑盒從轉(zhuǎn)化子分離質(zhì)粒DNA，通過用限制酶HindⅢ切割和接下來的瓊脂糖凝膠電泳檢查。擴(kuò)增過的DNA片段的DNA序列通過測序檢查。PCR產(chǎn)物的序列與在SEQ IDNo．1中顯示的序列匹配。所獲得的質(zhì)粒稱為pCR2．1TOPOdapB。實(shí)施例3制備編碼pyc的DNA谷氨酸棒桿菌菌株ATCC13032用作染色體DNA的供體。如實(shí)施例1的描述從菌株ATCC13032分離染色體DNA。聚合酶鏈反應(yīng)用來擴(kuò)增攜帶pyc基因的DNA片段。在已知的谷氨酸棒桿菌pyc基因序列(PetersWendisch等，微生物學(xué)144，915-927(1998))的基礎(chǔ)上選擇下列PCR引物寡核苷酸(登記號Y09548)。5-PYC-IN5′GC(T CTA GA)A GTG TCG CAA CCG TGC TTG A 3′3-PYC-IN5′GC(T CTA GA)T TGA GCC TTG GTC TCC ATC T 3′所顯示的引物是通過MWG Biotech(Ebersberg，德國)合成的，用Innis等的標(biāo)準(zhǔn)PCR方法(PCR方案，方法和應(yīng)用指導(dǎo)，1990，學(xué)術(shù)出版社)進(jìn)行PCR。這些引物使擴(kuò)增攜帶pyc基因的3．8 kb DNA片段成為可能。所說引物也含有限制性內(nèi)切核酸酶XbaⅠ的切割位點(diǎn)序列，在以上核苷酸序列中由括弧顯示。
借助在0．8％瓊脂糖凝膠上的電泳鑒別攜帶pyc基因的擴(kuò)增過的約3．8 kb DNA片段，用常規(guī)方法(QIAquick凝膠抽提試劑盒，QuiagenHilden)從凝膠上分離并純化。
然后借助雙重啟動子Topo TA克隆試劑盒(Invitrogen，Leek，荷蘭，產(chǎn)品編號K4600-01)將片段連接到載體pCRⅡ-TOPO上。將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株TOP10(Invitrogen，Leek，荷蘭)。通過將混合物平板接種在含有卡那霉素(50mg／l)和XGal(64 mg／l)的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。
在DNA分離之后，借助限制切割檢測所獲得的質(zhì)粒，并且在瓊脂糖凝膠上鑒別。質(zhì)粒稱為pCRⅡ-TOPOpyc，測序克隆插入物的DNA序列，用以對照。由于在pCRⅡ-TOPOpyc中的pyc插入物的測定的序列與基因文庫中的匹配，因此其后使用這一質(zhì)粒。實(shí)施例4將dapB克隆進(jìn)載體pEC7從質(zhì)粒pCR2．1TOPOdapB(來源于實(shí)施例2)分離攜帶dapB基因的約1．1 kb DNA片段。為這一目的，質(zhì)粒pCR2．1TOPOdapB以限制酶HindⅢ消化，分離攜帶dapB基因的約1．1 kb DNA片段。
將dapB片段插入到載體pEC7中。載體pEC7基于大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體pEC5(Eikmanns等，10293-98(1991))。以下列方式從質(zhì)粒pEC5上除去不位于多接頭上的BamHⅠ切割位點(diǎn)以限制酶BamHⅠ部分切割質(zhì)粒pEC5。從瓊脂糖凝膠分離約7．2 kb DNA片段，突出端以Klenow聚合酶(寶靈格曼海姆)填平。將所形成的DNA片段連接(T4連接酶，寶靈格曼海姆)。將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株DH5α，在含有卡那霉素(50mg／l)的LB瓊脂上分離卡那霉素抗性菌落。從轉(zhuǎn)化子分離(Qiagen的QlAprep旋轉(zhuǎn)小量制備試劑盒)質(zhì)粒DNA，并且用限制酶BamHⅠ與PstⅠ限制切割檢查。所形成的質(zhì)粒稱為pEC6。
質(zhì)粒pEC6以限制酶XhoⅠ充分切割。將攜帶trp終止子的DNA片段連接到載體DNA片段上(T4連接酶，寶靈格曼海姆)。將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株DH5α，在含有卡那霉素(50mg／l)的LB瓊脂上分離卡那霉素抗性菌落。從轉(zhuǎn)化子分離(Qiagen的Q1Aprep旋轉(zhuǎn)小量制備試劑盒)質(zhì)粒DNA，并且用限制酶BamHⅠ與XhoⅠ限制切割檢查。所形成的質(zhì)粒稱為pEC7。
所獲得的攜帶dapB的DNA片段連接到載體pEC7上(T4 DNA連接酶，寶靈格曼海姆)，該載體已經(jīng)以限制酶HindⅢ充分消化，并且用堿性磷酸酶(寶靈格曼海姆)處理。將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株DH5α，在含有卡那霉素(50mg／l)的LB瓊脂上分離卡那霉素抗性菌落。從轉(zhuǎn)化子分離(Qiagen的Q1Aprep旋轉(zhuǎn)小量制備試劑盒)質(zhì)粒DNA，并且用限制酶HindⅢ限制切割檢查。所形成的質(zhì)粒稱為pEC7dapB(


圖1)。所獲得的大腸桿菌菌株稱為DH5α／pEC7dapB。實(shí)施例5將lysE克隆進(jìn)載體pEC7將實(shí)施例1中所描述的質(zhì)粒pUC18lysEneu以限制酶BamHⅠ充分消化，攜帶lysE基因的1．1 kb BamHⅠ片段用如實(shí)施例1的方法分離。載體pEC7以限制酶BamHⅠ同樣充分地切割，并用堿性磷酸酶被處理。將BamHⅠ載體片段和BamHⅠlysE片段連接(迅速DNA連接試劑盒，寶靈格曼海姆)，并且轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株DH5α。在含有氯霉素(10mg／l)的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。分離質(zhì)粒DNA(Qiagen的QlAprep旋轉(zhuǎn)小量制備試劑盒)，并且用酶BamHⅠ限制切割檢查。所形成的質(zhì)粒稱為pEC7lysE(圖2)。通過將質(zhì)粒pEC7lysE轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株DH5α獲得的菌株稱為DH5α/pEC7lysE。實(shí)施例6將pyc克隆進(jìn)載體pEC7通過以限制酶XbaⅠ切割從質(zhì)粒pCRII30 TOPOpyc(實(shí)施例3)獲得谷氨酸棒桿菌ATCC13032的攜帶pyc基因的3．8 kb DNA片段。3．8 kbDNA片段由凝膠電泳鑒別，從凝膠上分離并用常規(guī)方法純化，突出端以Klenow聚合酶填充。載體pEC7以限制酶SmaⅠ同樣充分地切割，并且用堿性磷酸酶處理。將用Klenow聚合酶處理的SmaⅠ載體片段和XbaⅠ pyc片段連接(T4連接酶，寶靈格曼海姆)，并且轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株DH5α。在含有氯霉素(10mg／l)的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。分離質(zhì)粒DNA(Q1Aprep旋轉(zhuǎn)小量制備試劑盒，Qiagen，Hilden，德國)，并且以限制酶SalⅠ限制切割檢查。所形成的質(zhì)粒稱為pEC7pyc(圖3)。通過將質(zhì)粒pEC7pyc轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株DH5α獲得的大腸桿菌菌株稱為DH5α／pEC7pyc。實(shí)施例7制備含有l(wèi)ysE和dapB的質(zhì)粒從谷氨酸棒桿菌ATCC13032的含有dapB基因的質(zhì)粒pCR2．1TOPOdapB分離作為HindⅢ片段的dapB基因。為此，質(zhì)粒以限制酶HindⅢ充分消化，從0．8％瓊脂糖凝膠(Qiagen的Q1Aquick凝膠抽提試劑盒)分離攜帶dapB的DNA片段。
載體pEC7lysE也以限制酶HindⅢ充分消化，并且利用堿性磷酸酶被處理。將含有dapB的1．1 kb片段連接到所形成的線型載體片段上(T4連接酶，寶靈格曼海姆)，并將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株DH5α。在含有氯霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。分離質(zhì)粒DNA(Q1Aprep旋轉(zhuǎn)小量制備試劑盒，Qiagen，Hilden，德國)，并且以限制酶HindⅢ限制切割檢查。
所形成的質(zhì)粒稱為pEC7lysEdapB。這一質(zhì)粒能夠在大腸桿菌和在棒狀菌中自我復(fù)制，并且賦予在其宿主上對抗生素氯霉素的抗性。
質(zhì)粒pEC7lysEdapB同時含有dapB基因(其編碼二氫吡啶二羧酸還原酶)以及l(fā)ysE基因(其編碼賴氨酸輸送物)。
通過用pEC7lysEdapB轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得的菌株被保藏。實(shí)施例8制備同時含有dapB和pyc的質(zhì)粒如實(shí)施例6所述，將谷氨酸棒桿菌ATCC13032的攜帶pyc基因(編碼丙酮酸羧化酶)的質(zhì)粒以限制酶XbaⅠ充分切割，突出端以Klenow聚合酶填充，這使得分離含有丙酮酸羧化酶基因的3．8 kb DNA片段成為可能。
也用限制酶SmaⅠ充分切割質(zhì)粒pEC7dapB(實(shí)施例4)，末端用堿性磷酸酶處理。利用T4 DNA連接酶(寶靈格曼海姆，Mannheiin，德國)將所形成的線型載體片段連接到3．8 kb DNA片段(含有pyc基因)上。這一步驟產(chǎn)生含有棒狀菌dapB基因和pyc基因的質(zhì)粒。在含有氯霉素的LB瓊脂上(10mg／l)選擇含有質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。分離質(zhì)粒DNA(Q1Aprep旋轉(zhuǎn)小量制備試劑盒，Qiagen，Hilden，德國)，并且以限制酶SmaⅠ限制切割檢查。質(zhì)粒如圖4中所示，稱為pEC7dapBpyc。通過將質(zhì)粒pEC7dapBpyc轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α獲得的大腸桿菌菌株稱為DH5α/pEC7dapBpyc。實(shí)施例9制備含有同時編碼lysE，dapB和pyc的序列的質(zhì)粒如實(shí)施例6所述，將谷氨酸棒桿菌ATCC13032的攜帶pyc基因(編碼丙酮酸羧化酶)的質(zhì)粒pCRⅡ-TOPOpyc以限制酶XbaⅠ充分切割，并以Klenow聚合酶處理，這使得分離含有丙酮酸羧化酶基因的3．8 kbDNA片段成為可能。
也用限制酶SmaⅠ充分切割質(zhì)粒pEC7dapBlysE，末端用堿性磷酸酶處理。利用T4 DNA連接酶(寶靈格曼海姆，Mannheiin，德國)將所形成的線型載體片段連接到3．8 kb DNA片段(含有pyc基因)上。這一步驟產(chǎn)生含有棒狀菌dapB基因和pyc基因的質(zhì)粒。在含有氯霉素的LB瓊脂上(10mg／l)選擇含有質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。分離質(zhì)粒DNA(Q1Aprep旋轉(zhuǎn)小量制備試劑盒，Qiagen，Hilden，德國)，并且以限制酶SmaⅠ限制切割證實(shí)。質(zhì)粒如圖5中所示，稱為pEC7dapBlysEpyc。通過將質(zhì)粒pEC7dapBlysEpyc轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α獲得的大腸桿菌菌株稱為DH5α/pEC7dapBlysEpyc。實(shí)施例10用質(zhì)粒pJC23和pJC33轉(zhuǎn)化菌株MH20-22B質(zhì)粒pJC1能夠在大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中復(fù)制(Cremer等，分子和普通遺傳學(xué)220478-480(1990))。質(zhì)粒攜帶谷氨酸棒桿菌菌株MH20-22B的lysC(Fbr)基因的pJC33(Cremer等，應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)57(6)，1746-1752(1991))來源于該質(zhì)粒。
質(zhì)粒pJC23也基于載體pJC1，并且攜帶谷氨酸棒桿菌ATCC13032的dapA基因(Cremer等，分子和普通遺傳學(xué)220478-480(1990))(EP-B 0 435 132)。通過電穿孔法(Haynes和Britz，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通訊(61)329-334(1989))將質(zhì)粒pJC1，pJC33和pJC23引入菌株MH20-22B。谷氨酸棒桿菌菌株MH20-22B是AEC-抗性賴氨酸生產(chǎn)菌，以保藏號DSM5715保藏。
在含有卡那霉素15mg／l的選擇瓊脂(LBHIS瓊脂(18．5g／l腦-心浸漬液，0．5M山梨醇，5g／l細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨，2．5g／l細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物的，5g／lNaCl，18g／l細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂))上，分離電穿孔法獲得的轉(zhuǎn)化子。用常規(guī)方法(Peters-Wendisch等，微生物學(xué)144，915-927(1998))分離質(zhì)粒DNA，以合適的限制性內(nèi)切酶切割，并且檢查。所獲得的菌株稱為MH20-22B／pJCl，MH20-22B／pJC33和MH20-22B／pJC23。實(shí)施例11用質(zhì)粒pEC7pyc，pEC7dapBpyc和pEC7dapBlysEpyc轉(zhuǎn)化將第二種質(zhì)粒提供給實(shí)施例10中制備的菌株。
將下列質(zhì)粒用電穿孔法方法引入所描述的菌株MH20-22B／pJCl，MH20-22B／pJC33和MH20-22B／pJC23中pEC7pyc(參見實(shí)施例6)pEC7dapBpyc(參見實(shí)施例8)pEC7dapBlysEpyc(參見實(shí)施例9)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌基于它們所含有的質(zhì)粒的抗生素抗性選擇。在選擇瓊脂(LBHIS瓊脂，含有卡那霉素15mg／l以及氯霉素7．5 mg／l)上分離借助電穿孔法所獲得的轉(zhuǎn)化子。分離質(zhì)粒DNA，以合適的限制性內(nèi)切酶切割，并且檢查。
獲得的菌株列表如下DSM 5715／pJC1／PEC7pycDSM 5715／pJC33／pEC7pycDSM 5715／pJC23／pEC7pycDSM 5715／pJC23／pEC7dapBpycDSM 5715／pJC23／pEC7lysEdapBpyc
其是由以下步驟完成的，首先于33℃在具有合適的抗生素的瓊脂平板(腦-心瓊脂，含有卡那霉素(25mg／l)，氯霉素(10mg／l))上培養(yǎng)各種菌株24小時。將這些瓊脂平板培養(yǎng)物用于接種預(yù)培養(yǎng)物(100ml錐形瓶中10ml培養(yǎng)基)。完全培養(yǎng)基CgⅢ用作預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基。加入卡那霉素(25mg／l)和氯霉素(10mg／l)。預(yù)培養(yǎng)在搖床上于240rpm下33℃進(jìn)行24小時。這一預(yù)培養(yǎng)物用來接種主培養(yǎng)，以給出初始OD(660nm)0．2。培養(yǎng)基MM用于主培養(yǎng)。
培養(yǎng)基MMCSL 5gMOPS20g／l葡萄糖 50g／l(分別加壓滅菌)鹽硫酸銨 25g／l磷酸二氫鉀 0．1g／l七水硫酸鎂 1．0g／l二水氯化鈣 10mg／l七水硫酸亞鐵10mg／l一水硫酸錳 5．0mg／l生物素 0．3mg／l(過濾滅菌)硫胺素*HCl 0．2mg／l(過濾滅菌)碳酸鈣 25g／l縮寫CSL玉米漿MOPS嗎啉丙烷磺酸CSL，MOPS和鹽溶液以氨水調(diào)整至pH7，并加壓滅菌。然后加入無菌底物、維生素溶液和干滅菌的碳酸鈣。
培養(yǎng)在具有擋板的100ml錐形瓶中的10ml體積中進(jìn)行。加入卡那霉素(25mg／l)和氯霉素(10mg/l)。在33℃和80％大氣濕度下進(jìn)行培養(yǎng)。
在72小時之后，在660nm的波長下測量OD。所形成的賴氨酸的量借助EppendorfBioTronik(漢堡，德國)的氨基酸分析儀經(jīng)離子交換層析和與茚三酮的柱后衍生化檢測反應(yīng)測定。葡萄糖含量用SkalarAnalytik GmbH(Erkelenz，德國)的糖分析儀測定。
實(shí)驗結(jié)果如表1所示。
表1
實(shí)施例13將aecD基因克隆進(jìn)載體pUC18用限制酶Bg1Ⅱ和EcoRV充分消化質(zhì)粒pSIR21(Rossol，博士論文，Bielefeld大學(xué)，1992)，然后分離攜帶谷氨酸棒桿菌ATCC13032的aecD基因(登錄號M89931)(Rossol和Puhler，細(xì)菌學(xué)雜志，174(9)，2968-2977(1992))的1．4kb DNA片段。根據(jù)Sambrook等所述(分子克隆實(shí)驗手冊(1989)，冷泉港實(shí)驗室出版社)用T4 DNA連接酶將分離出的DNA片段與已預(yù)先用BamHⅠ和SmaⅠ限制性內(nèi)切酶充分消化的質(zhì)粒pUC18連接。將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株DH5α。在含有氨芐青霉素(100mg／l)的腦-心瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化子，分離質(zhì)粒DNA。所得質(zhì)粒被稱為pUC18∷aecD。實(shí)施例14將dapA基因克隆進(jìn)質(zhì)粒pSP72從質(zhì)粒pJC20(Cremer，J．博士論文，1989，Dusseldorf大學(xué))分離作為SphⅠ-BamHⅠ片段的dapA基因片段。載體pSP72(Promega公司，USA)用酶SphⅠ和BamHⅠ充分切割并用堿性磷酸酶處理。將載體和攜帶dapA的片段用T4 DNA連接酶連接，并將該DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株XL1 Blue(Bullock，F(xiàn)ernandez和Short，生物技術(shù)(5)376-379(1987))。在含100mg／l氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子。從轉(zhuǎn)化子分離質(zhì)粒DNA，該質(zhì)粒被稱為pSP72∷dapA。實(shí)施例15dapA啟動子的誘變及質(zhì)粒pSP72∷dapA(MC20)和pSP72∷dapA(MA16)的制備用Stratagene公司的Quickchange定點(diǎn)誘變試劑盒進(jìn)行啟動子區(qū)的誘變。根據(jù)已有的dapA序列設(shè)計如下引物用于誘變對于制備pSP72∷dapA(MC20)針對MC20的引物dap1CCA AAT GAG AGA TGG TAA CCT TGA ACT CTA TGA GCA針對MC20的引物dap2GTG CTC ATA GAG TTC AAG GTT ACC ATC TTC CCT CATTTG G對于制備pSP72∷dapA(MA16)針對MA16的引物dap3CCA AAT GAG GGA AGA AGG TAT AAT TGA ACT CTA TGAGCA
針對MA16的引物dap4GTG CTC ATA GAG TTC AAT TAT ACC TTC TTC CCT CATTTG G根據(jù)廠商(Stratagene)指導(dǎo)用Quickchange定點(diǎn)誘變試劑盒以質(zhì)粒pSP72∷dapA(實(shí)施例14)為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。
將誘變反應(yīng)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株XL1-Blue。在具有100mg／l羧芐青霉素的LB培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子。從轉(zhuǎn)化子中分離質(zhì)粒DNA，用BstEⅡ切割證實(shí)BstEⅡ切割位點(diǎn)的刪除，不再具有BstEⅡ切割位點(diǎn)的質(zhì)粒具有所希望的突變。
將所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化dapA缺陷型大腸桿菌突變體RDA8。轉(zhuǎn)化反應(yīng)物涂布在具有100mg／l羧芐青霉素的LB上，以測試dapA突變的互補(bǔ)作用。從轉(zhuǎn)化子中分離DNA，所得質(zhì)粒稱為pSP72∷dapA(MC20)和pSP72∷dapA(MA16)。用反向和通用測序引物經(jīng)Sanger等，美國科學(xué)院院刊(74)5463-5467(1977)所述的鏈終止反應(yīng)法測序質(zhì)粒。測序反應(yīng)用AutoRead測序試劑盒(Pharmacia，F(xiàn)reiburg)進(jìn)行。對測序產(chǎn)物的電泳分析和檢測用Pharmacia(Freiburg，德國)的A．L．F．DNA測序儀完成。
質(zhì)粒pUC18aecD∷dapA(MC20)和pUC18aecD∷dapA(MA16)用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ部分酶切并用SalⅠ酶充分酶切，以獲得3．0kb的攜帶aecD∷dapA(MA16)或aecD∷dapA(MC20)的片段。用T4 DNA連接酶將該片段與經(jīng)酶切并經(jīng)堿性磷酸酶處理的載體pK19mobsacB(Schafer等，基因(145)69-73(1994))連接。連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5(Hanahan(1985)，DNA克隆實(shí)用方案，第1卷，IRL出版社，Oxford，美國華盛頓特區(qū))。在具有50mg／l卡那霉素的LB培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子。由此獲得質(zhì)粒pK19mobsacBaecD∷dapA(MC20)和pK19mobsacBaecD∷dapA(MA16)。
用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株S17-1(Simon，Priefer和Puhler，生物／技術(shù)，(1)784-791(1983))。在具有50mg／l卡那霉素的LB培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子。從轉(zhuǎn)化子中分離質(zhì)粒DNA并檢查。獲得的菌株稱為S17-1／pK19mobsacBaecD∷dapA(MC20)和S17-1／pK19mobsacBaecD∷dapA(MA16)。實(shí)施例17制備谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715aecD∷dapA(MC20)和DSM5715aecD∷dapA(MA16)用接合方法(Schafer等，細(xì)菌學(xué)雜志(172)1663-1666(1990))將S17-1／pK19mobsacBaecD∷dapA(MC20)和S17-1／pK19mobsacBaecD∷dapA(MA16)(實(shí)施例16)中的質(zhì)粒pK19mobsacBaecD∷dapA(MC20)和pK19mobsacBaecD∷dapA(MA16)轉(zhuǎn)移進(jìn)谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715中。將接合混合物涂布在具有萘啶酮酸和卡那霉素的腦-心培養(yǎng)基上以選擇接合轉(zhuǎn)移子。將所得接合轉(zhuǎn)移子在10ml腦-心培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，將培養(yǎng)基等份涂布在含有蔗糖的培養(yǎng)基平板上(含10％蔗糖的腦-心瓊脂)，以根據(jù)對蔗糖的敏感性篩選。分離蔗糖抗性菌落并在含氯霉素和卡那霉素的瓊脂平板(含15mg／l卡那霉素的腦-心培養(yǎng)基和含10mg／l氯霉素的腦-心培養(yǎng)基)再檢查。
分離具有下述表型的菌落蔗糖抗性卡那霉素敏感性氯霉素敏感性經(jīng)Southern印跡(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗手冊(1989)，冷泉港實(shí)驗室出版社)證實(shí)dapA片段插入aecD基因中。
實(shí)施例18制備谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715aecD∷dapA(MC20)／pEC7pyc，DSM5715aecD∷dapA(MA16)／pEC7pyc，DSM5715aecD∷dapA(MC20)／pEC7，DSM5715aecD∷dapA(MA16)pEC7和DSM5715／pEC7將實(shí)施例6的pyc基因插入載體pEC7中，經(jīng)電穿孔(Haynes，1989，F(xiàn)EMS微生物通信61329-334)將質(zhì)粒pEC7pyc或質(zhì)粒pEC7導(dǎo)入菌株DSM5715aecD∷dapA(MC20)，DSM5715aecD∷dapA(MA16)和DSM5715(實(shí)施例17)中，獲得谷氨酸棒桿菌DSM5715aecD∷dapA(MC20)／pEC7pyc，DSM5715aecD∷dapA(MA16)／pEC7pyc，DSM5715aecD∷dapA(MC20)／pEC7，DSM5715aecD∷dapA(MA16)／pEC7和DSM5715／pEC7。在具有25mg／l卡那霉素的腦-心瓊脂上選擇轉(zhuǎn)化子。從轉(zhuǎn)化子分離質(zhì)粒DNA并證實(shí)。
以此方式獲得如下菌株DSM5715aecD∷dapA(MC20)／pEC7pyc，DSM5715aecD∷dapA(MA16)／pEC7pyc，DSM5715aecD∷dapA(MC20)／pEC7，DSM5715aecD∷dapA(MA16)／pEC7和DSM5715／pEC7。實(shí)施例19用實(shí)施例18中制得的菌株制備賴氨酸如實(shí)施例12所述，將菌株DSM5715aecD∷dapA(MC20)／pEC7pyc，DSM5715aecD∷dapA(MA16)／pEC7pyc，DSM5715aecD∷dapA(MC20)／pEC7，DSM5715aecD∷dapA(MA16)／PEC7和DSM5715／pEC7在培養(yǎng)基CgⅢ(Kase＆Nakayama，農(nóng)業(yè)和生物化學(xué)36(9)1611-1621(1972)中預(yù)培養(yǎng)，然后在生產(chǎn)培養(yǎng)基MM中培養(yǎng)。48小時后測660nm光密度和所形成的L-賴氨酸濃度。
表2示出結(jié)果。
表2
序列表<110>德古薩-于爾斯股份公司于利希研究中心有限公司<120>生產(chǎn)L-賴氨酸的棒狀菌和制備賴氨酸的方法<130>980183 BT<140>
<141>
<160>6<170>PatentIn Ver．2．1<210>1<211>795<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>-35信號<222>(774)．．(779)<220>
<223>dapB上游的DNA<400>1ctgcagcaat gagaccgagt aatttcgggg ttgaccagat acaccaatga gaacttggga 60acgggcttca aaaatactgg tgaagttgat gtcttcaaca atgcctgcac caggatatga 120tccggtatcg atacctggaa cgacaacctg atcaggatat ccagtgcctt gaatattgac 180gttgaggaag gaatcaccag ccatctcaac tggaagacct gacgcctgct gaattggatc 240agtggcccaa tcgacccacc aaccaggttg gccattaccg gcgatatcaa aaacaactcg 300tgtgaacgtt tcgtgctcgg caacgcggat gccagcgatc gacatatcgg agtcaccaac 360ttgagcctgc tgcttctgat ccatcgacgg ggaacccaac ggcggcaaag cagtggggga 420aggggggagt ttggtgcact ctgaaccgag tggtctctga agtggtaggc gacggggcag 480ctatctgaag gcgtgcgagt tgtggtgacc gggttagcgg tttcagtttc tgtcacaact 540ggagcaggac tagcagaggt tgtaggcgtt gagccgcttc catcacaagc acttaaaagt 600aaagaggcgg aaaccacaag cgccaaggaa ctactgcgga acgggcggtg aagggcaact 660taagtctcat atttcaaaca tagttccacc tgtgtgatta atccctagaa cggaacaaac 720tgatgaacaa tcgttaacaa cacagaccaa aacggtcagt taggtatgga tatcagcacc 780ttctgaacgg gtacg 795<210>2<211>1815<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>-35信號<222>(774)．．(779)<220>
<221>-10-信號<222>(798)．．(803)<220>
<221>CDS<222>(851)．．(1594)
<400> 2ctgcagcaat gagaccgagt aatttcgggg ttgaccagat acaccaatga gaacttggga 60acgggcttca aaaatactgg tgaagttgat gtcttcaaca atgcctgcac caggatatga 120tccggtatcg atacctggaa cgacaacctg atcaggatat ccagtgcctt gaatattgac 180gttgaggaag gaatcaccag ccatctcaac tggaagacct gacgcctgct gaattggatc 240agtggcccaa tcgacccacc aaccaggttg gccattaccg gcgatatcaa aaacaactcg 300tgtgaacgtt tcgtgctcgg caacgcggat gccagcgatc gacatatcgg agtcaccaac 360ttgagcctgc tgcttctgat ccatcgacgg ggaacccaac ggcggcaaag cagtggggga 420aggggggagt ttggtgcact ctgaaccgag tggtctctga agtggtaggc gacggggcag 480ctatctgaag gcgtgcgagt tgtggtgacc gggttagcgg tttcagtttc tgtcacaact 540ggagcaggac tagcagaggt tgtaggcgtt gagccgcttc catcacaagc acttaaaagt 600aaagaggcgg aaaccacaag cgccaaggaa ctactgcgga acgggcggtg aagggcaact 660taagtctcat atttcaaaca tagttccacc tgtgtgatta atccctagaa cggaacaaac 720tgatgaacaa tcgttaacaa cacagaccaa aacggtcagt taggtatgga tatcagcacc 780ttctgaacgg gtacgtctag actggtgggc gtttgaaaaa ctcttcgccc cacgaaaatg 840aaggagcata atg gga atc aag gtt ggc gtt ctc gga gcc aaa ggc cgt889Met Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Arg1 5 10gtt ggt caa act att gtg gca gca gtc aat gag tcc gac gat ctg gag 937Val Gly Gln Thr Ile Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp Leu Glu15 20 25ctt gtt gca gag atc ggc gtc gac gat gat ttg agc ctt ctg gta gac 985Leu Val Ala Glu Ile Gly Val Asp Asp Asp Leu Set Leu Leu Val Asp30 35 40 45aac ggc gct gaa gtt gta gtt gac ttc acc act cct aac gct gtg atg 1033Asn Gly Ala Glu Val Val Val Asp Phe Thr Thr Pro Asn Ala Val Met50 55 60ggc aac ctg gag ttc tgc atc aac aac ggc att tct gcg gtt gtt gga 1081Gly Asn Leu Glu Phe Cys Ile Ash Asn Gly Ile Set Ala Val Val Gly65 70 75acc acg ggc ttc gat gat gct cgt ttg gag cag gtt cgc gac tgg ctt 1129Thr Thr Gly Phe ASp Asp Ala Arg Leu Glu Gln Val Arg Asp Trp Leu80 85 90gaa gga aaa gac aat gtc ggt gtt ctg atc gca cct aac ttt gct atc 1177Glu Gly Lys Asp Asn Val Gly Va1 Leu Ile Ala Pro Asn Phe Ala Ile95 100 105tct gcg gtg ttg acc atg gtc ttt tcc aag cag gct gcc cgc ttc ttc 1225Ser Ala Val Leu Thr Met Val Phe Ser Lys Gln Ala Ala Arg Phe Phe110 115 120 125
gaa tca gct gaa gtt att gag ctg cac cac ccc aac aag ctg gat gca 1273Glu Ser Ala Glu Val Ile Glu Leu His His Pro Asn Lys Leu Asp Ala130 135 140cct tca ggc acc gcg atc cac act gct cag ggc att gct gcg gca cgc 1321Pro Ser Gly Thr Ala Ile His Thr Ala Gin Gly Ile Ala Ala Ala Arg145 150 155aaa gaa gca ggc atg gac gca cag cca gat gcg acc gag cag gca ctt 1369Lys Glu Ala Gly Met Asp Ala Gln Pro Asp Ala Thr Glu Gln Ala Leu160 165 170gag ggt tcc cgt ggc gca agc gta gat gga atc ccg gtt cat gca gtc 1417Glu Gly Ser Arg Gly Ala Ser Val Asp Gly Ile Pro Val His Ala Val75 180 185cgc atg tcc ggc atg gtt gct cac gag caa gtt atc ttt ggc acc cag 1465Arg Met Ser Gly Met Val Ala His Glu Gln Val Ile Phe Gly Thr Gln190 195 200 205ggt cag acc ttg acc atc aag cag gac tcc tat gat cgc aac tca ttt 1513Gly Gln Thr Leu Thr Ile Lys Gln Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe210 215 220gca cca ggt gtc ttg gtg ggt gtg cgc aac att gca cag cac cca ggc 1561Ala Pro Gly Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Ala Gln His Pro Gly225 230 235cta gtc gta gga ctt gag cat tac cta ggc ctg taaaggctca tttcagcagc 1614Leu Val Val Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu240 245gggtggaatt ttttaaaagg agcgtttaaa ggctgtggcc gaacaagtta aattgagcgt 1674ggagttgata gcgtgcagtt cttttactcc acccgctgat gttgagtggt caactgatgt 1734tgagggcgcg gaagcactcg tcgagtttgc gggtcgtgcc tgctacgaaa cttttgataa 1794gccgaaccct cgaactgctt c 1815<210>3<211>248<212>PRT<213>谷氨酸棒桿菌<400>3Met Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Arg Val Gly Gln1 5 10 15Thr Ile Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp Leu Glu Leu Val Ala20 25 30Glu Ile Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu Val Asp Asn Gly Ala35 40 45Glu Val Val Val Asp Phe Thr Thr Pro Asn Ala Val Met Gly Asn Leu50 55 60Glu Phe Cys Ile Asn Asn Gly Ile Ser Ala Val Val Gly Thr Thr Gly65 70 75 80
Phe Asp Asp Ala Arg Leu Glu Gln Val Arg Asp Trp Leu Glu Gly Lys85 90 95Asp Asn Val Gly Val Leu Ile Ala Pro Asn Phe Ala Ile Ser Ala Val100 105 110Leu Thr Met Val Phe Ser Lys Gln Ala Ala Arg Phe Phe Glu Ser Ala115 120 125Glu Val Ile Glu Leu His His Pro Asn Lys Leu Asp Ala Pro Ser Gly130 135 140Thr Ala Ile His Thr Ala Gln Gly Ile Ala Ala Ala Arg Lys Glu Ala145 150 155 160Gly Met Asp Ala Gln Pro Asp Ala Thr Glu Gln Ala Leu Glu Gly Ser165 170 175Arg Gly Ala Ser Val Asp Gly Ile Pro Val His Ala Val Arg Met Ser180 185 190Gly Met Val Ala His Glu Gln Val Ile Phe Gly Thr Gln Gly Gln Thr195 200 205Leu Thr Ile Lys Gln Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe Ala Pro Gly210 215 220Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Ala Gln His Pro Gly Leu Val Val225 230 235 240Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu245<2l0>4<211>79<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>dapA野生型啟動子<400>4gttaggtttt ttgcggggtt gtttaacccc caaatgaggg aagaaggtaa ccttgaactc 60tatgagcaca ggtttaaca 79<210>5<211>79<212>DNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列的描述；具有MC20突變的谷氨酸棒桿菌dapA啟動子<220>
<221>突變<222>(45)
<400> 5gttaggtttt ttgcggggtt gtttaacccc caaatgaggg aagatggtaa ccttgaactc 60tatgagcaca ggtttaaca 79<210>6<211>80<212>DNA<213>合成序列<220>
<223>合成序列的描述具有MA16突變的谷氨酸棒桿菌dapA啟動子<220>
<221>突變<222>(35)．．(53)<400>6gttaggtttt ttgcggggtt gtttaacccc caaaatgagg gaagaaggta taattgaact 60ctatgagcac aggtttaaca 80附圖有下列附圖
圖1pEC7dapB(參見實(shí)施例4)圖2pEC7lysE(參見實(shí)施例5)圖3pEC7pyc(參見實(shí)施例6)圖4pEC7dapBpyc(參見實(shí)施例8)圖5pEC7lysEdapBpyc(參見實(shí)施例9)用于附圖的縮寫定義如下Cm氯霉素抗性基因dapB谷氨酸棒桿菌的dapB基因lysE谷氨酸棒桿菌的lysE基因pyc谷氨酸棒桿菌的pyc基因OriE質(zhì)粒編碼的大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)pBL質(zhì)粒pBL1的DNA片段EcoRⅠ限制酶EcoRⅠ切割位點(diǎn)EcoRV限制酶EcoRV切割位點(diǎn)HincⅡ限制酶HincⅡ切割位點(diǎn)HindⅢ限制酶HindⅢ切割位點(diǎn)KpnⅠ限制酶KpnⅠ切割位點(diǎn)SalⅠ限制酶Sa1Ⅰ切割位點(diǎn)SmaⅠ限制酶SmaⅠ切割位點(diǎn)SphⅠ限制酶SphⅠ切割位點(diǎn)PvuⅡ限制酶PvuⅡ切割位點(diǎn)BamHⅠ限制酶BamHⅠ切割位點(diǎn)
權(quán)利要求
1．生產(chǎn)L-賴氨酸的棒狀菌，其具有擴(kuò)增的pyc基因，在這些菌株中，選自包括dapA基因，lysC基因，lysE基因和dapB基因的組的附加基因分別或一起得到擴(kuò)增，尤其是得到超量表達(dá)。
2．如權(quán)利要求1中所要求的棒狀菌，其中dapA基因及任選地dapB基因得到擴(kuò)增，尤其是得到超量表達(dá)。
3．如權(quán)利要求1中所要求的棒狀菌，其中dapA基因，dapB基因以及l(fā)ysE基因得到擴(kuò)增，尤其是得到超量表達(dá)。
4．如權(quán)利要求1中所要求的棒狀菌，其含有SEQ ID No．5和SEQID No．6中所示的dapA啟動子的MC20或MA16突變。
5．如權(quán)利要求1中所要求的棒狀菌，其中dapB基因得到擴(kuò)增，尤其是得到超量表達(dá)，該基因額外含有SEQ ID No．1中所示的其翻譯起始位點(diǎn)上游的5’末端。
6．優(yōu)選地為重組的DNA，其來源于棒狀菌，并且能夠在棒狀菌中復(fù)制，該DNA至少含有額外包含SEQ ID No．1中所示的dapB基因翻譯區(qū)5’末端上游的核苷酸序列。
7．如權(quán)利要求5中所要求的能夠復(fù)制的DNA，其具有SEQ ID No．1中所示的核苷酸序列。
8．一種通過發(fā)酵具有擴(kuò)增的pyc基因的棒狀菌制備L-賴氨酸的方法，其中使用這樣的細(xì)菌，該細(xì)菌中編碼選自dapA，lysC，lysE和dapB基因的核苷酸序列分別或一起得到擴(kuò)增，尤其是得到超量表達(dá)。
9．如權(quán)利要求8的方法，其中使用這樣的細(xì)菌，該細(xì)菌中dapA基因得到擴(kuò)增，尤其是得到超量表達(dá)，任選地lysC基因也同時得到擴(kuò)增，尤其是超量表達(dá)。
10．如權(quán)利要求8的方法，其中使用這樣的細(xì)菌，該細(xì)菌中dapA基因，dapB基因以及l(fā)ysE基因同時得到擴(kuò)增，尤其是得到超量表達(dá)，
11．如權(quán)利要求8的方法，其中使用由一種或多種質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的菌株，所說的質(zhì)粒載體攜帶有待擴(kuò)增的一種或多種基因的核苷酸序列。
12．如權(quán)利要求8的方法，其中使用由一種或多種質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的菌株，所說的質(zhì)粒載體攜帶有編碼選自pyc，dapA，dapB和／或lysE基因的一種或多種基因的核苷酸序列。
13．如前述一或多項權(quán)利要求所要求的方法，其中使用谷氨酸棒桿菌菌種的細(xì)菌。
14．如前述一或多項權(quán)利要求所要求的通過發(fā)酵制備L-賴氨酸的方法，該方法包括以下步驟a)發(fā)酵L-賴氨酸生產(chǎn)菌，在這些細(xì)菌中，所描述的基因得到了擴(kuò)增，b)在培養(yǎng)基中或在細(xì)菌細(xì)胞中富集L-賴氨酸，和c)分離L-賴氨酸。
15．大腸桿菌K-12菌株DH5α/pEC7lysE，保藏號為DSM12871。
16．大腸桿菌K-12菌株DH5α／pEC7dapBlysE，保藏號為DSM12875。
17．谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715／pJC23，保藏號為DSM12869。
18．谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715aecD∷dapA(MA16)，保藏號為DSM12867。
19．谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715aecD∷dapA(MC20)，保藏號為DSM12868。
20．谷氨酸棒桿菌678菌株，保藏號為DSM12866。
21．能夠復(fù)制的DNA，具有SEQ ID No．5中所示的核苷酸序列MC20。
22．能夠復(fù)制的DNA，具有SEQ ID No．6中所示的核苷酸序列MA16。
全文摘要
本發(fā)明涉及棒狀菌的生產(chǎn)L－賴氨酸的菌株,其具有擴(kuò)增的pyc基因(丙酮酸羧化酶基因),在這些菌株中,選自包括dapA基因(二氫吡啶二羧酸合酶基因),lysC基因(天冬氨酸激酶基因),lysE基因(賴氨酸輸送載體基因)和dapB基因(二氫吡啶二羧酸還原酶基因)的組的附加基因,特別是dapA基因得到擴(kuò)增,尤其是得到超量表達(dá)。本發(fā)明也涉及制備L－賴氨酸的方法。
文檔編號C12N15/09GK1280185SQ0012035
公開日2001年1月17日 申請日期2000年7月7日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月7日
發(fā)明者卡羅琳·克羅伊策, 貝蒂娜·默克爾, 瓦爾特·普費(fèi)弗勒, 洛塔爾·埃格林, 赫爾曼·扎姆, 米羅斯拉夫·帕特克 申請人:德古薩－于爾斯股份公司, 于利希研究中心有限公司