專利名稱：棒狀桿菌中調節(jié)基因表達的dna的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及棒狀桿菌中調節(jié)基因表達的DNA。
生物體處于生長過程之中，因而提供了重新合成的細胞物質。因此，很多細胞組分，如氨基酸和卟啉從檸檬酸循環(huán)的代謝產物出發(fā)，進行重新合成(gebidet)。其前題是由檸檬酸循環(huán)代謝產物進行重新合成。當微生物生長于乙酸鹽、乙醇、或脂肪酸上時，檸檬酸循環(huán)的代謝產物通過被稱為乙醛酸循環(huán)的反應途徑重新合成(Kornberg，Biochem J99(1966)1-11)，乙醛酸循環(huán)的關鍵酶是異檸檬酸裂解酶和蘋果酸合成酶。然而，除了在乙酸、乙醇、和脂肪酸上生長之外，在很多生物體中，所提及的酶并非在碳水化合物上生長所必需的，因為活性，換言之，這兩種酶的重新合成是通過培養(yǎng)基的碳源調節(jié)的。
基于其棒狀外形，谷氨酸棒狀桿菌及其近親種屬蜜糖桿菌，黃色短桿菌和乳發(fā)酵短桿菌被看作棒狀細菌。此外，這些種類亦被稱為“谷氨酸-細菌”，因為在某些生長環(huán)境下，在其培養(yǎng)基中產生大量谷氨酸鹽。因為可用于氨基酸，嘌呤和蛋白的生產，例舉的微生物具有重要的工業(yè)價值。已證實谷氨酸棒狀桿菌，蜜糖桿菌，黃色短桿菌和乳發(fā)酵短桿菌在乙酸鹽如乙醇上生長，表明其具有乙醛酸循環(huán)，即亦具有異檸檬酸酶和蘋果酸合成酶(為了大致了解，參見Kinoshita，Amino acids，inBiology of industrial organisms，1985，pp.115-142，Benjamin/cummings Publishing)。
盡管多年來應用于工業(yè)，這些生物體只是借助于近年來發(fā)展的分子生物學方法，為達到應用的目的，將棒狀桿菌進行遺傳突變，一般說來，經(jīng)過克隆的基因在載體上處于其特有的啟動子控制之下，在棒狀桿菌中以高拷貝形式出現(xiàn)。這樣，在很多情況下，少數(shù)基因的強的過量表達表現(xiàn)出不利于棒狀桿菌生長，因此不利于所期望的產物的產生。其原因在于，一種相關的基因產物的過量產生對于細胞的新陳代謝是有毒性的，因而延緩了細胞生長。這樣的情況可以例舉編碼脫調節(jié)的(deregulierte)酶的突變基因的同源過表達，即其活性未曾過多受到終產物抑制，如編碼脫調節(jié)的高絲氨酸脫氫酶的homl-基因的同源過量表達(Reinscheid et al.，Appl Environm Microbiol 60(1994)，126-132)。然而我們知道這一種情形，一種非突變基因在同源體系中的過量表達對于谷氨酸棒狀桿菌的生長是有害的(如Eikmanns等，微生物學140(1994)1817-1828)。但也常有這樣的問題，當基因不來自于棒狀桿菌時，也能有這樣的過度表達。為了在棒狀桿菌中表達所需基因，而無需忍受相應基因產物的生長抑制，存在著多種可能性一個期望的基因以單拷貝整合到棒狀桿菌染色體上，由于在生物體中僅存在該基因的一個拷貝，一般不會出現(xiàn)由相應基因產物引起的毒性效應。本方法的缺點在于為了實現(xiàn)預期目標，該方法耗費大量精力。此外通過插入基因的一個拷貝，很少能有足量預期物質產生。
一種替代向棒狀桿菌染色體插入基因的方法是在棒狀桿菌中，以低拷貝數(shù)克隆一個處于載體上基因。這樣具有此種優(yōu)點相應的基因產品以相對低的量產生因而多半對細胞無毒。然而，在這種情況下，產生的基因產物的相對較低的量對于生物工程上的應用是一缺點。
因而我們預期由于這種基因產物對于生產即生物的生長的不利影響的出現(xiàn)，較大量的基因產物僅在預期的時間點產生。為達到這一目的，提供了一種預期基因，在其可調節(jié)的啟動子之后克隆 非其特有的啟動子。就可調節(jié)的大腸桿菌啟動子lac，λpL和trp而言，已表明能夠在棒狀桿菌中調節(jié)多種插入基因的表達(Tsnchiya和Morinaga，Bio/Technology 6(1988)428-431)。然而這些啟動子具有多種不利之處這些例舉的啟動子，不是來自于棒狀桿菌生物體，因而是外源DNA。通過向棒狀桿菌中插入這樣的一個啟動子，這些重組子生物體被視為具有嚴格的規(guī)定的安全性。另一個前提是這三個所需要的誘導基因的啟動子的任一個，就工業(yè)目的來說都是相對地令人不感興趣的。由于誘導基因的lac啟動子需要相對昂貴的物質IPTG，這樣的啟動子應用于大生產是不盈利的。λPL啟動子通過熱激活。熱不僅損傷生物體而且引起損傷產生的產物，因而該啟動子就棒狀桿菌而言是基本沒有工業(yè)價值的。trp啟動子將通過色氨酸缺乏激活。由于假定應用生產棒狀桿菌色氨酸缺乏突變體的啟動子，一般說來棒狀桿菌不會遭受色氨酸缺乏。這樣的突變體的應用相對耗資巨大，因而迄今未發(fā)現(xiàn)trp啟動子開始應用于棒狀桿菌的生物技術中。
就可調節(jié)啟動子而言，一種理想的情形是提供了一種可通過一種易得的，價廉物美的物質調節(jié)的棒狀桿菌啟動子。迄今已被描述的唯一的棒狀桿菌啟動子是異檸檬酸裂合酶基因的啟動子(EP-OS 0 530765)。只要在培養(yǎng)基中沒有糖，這個啟動子將引起基因表達。然而在大多數(shù)發(fā)酵基質中將加入糖作為碳源，獲得可調節(jié)的啟動子是有意義的，該啟動子在糖存在的條件下，借助于一種價廉物美的誘導物亦會引起基因表達。
因而本發(fā)明的目的是提供一種制備的DNA片段，該片段使多種基因在棒狀桿菌中不依賴于培養(yǎng)基中的碳源而能夠調節(jié)表達。
本發(fā)明相關的目的通過一個位于蘋果酸合成酶基因之前，并從其分離的DNA片段解決，在構建到載體和轉化到棒狀桿菌之后，該片段將調節(jié)插入到該DNA片段之后的編碼蛋白質的結構基因的表達。
現(xiàn)已查明，棒狀桿菌中蘋果酸合成酶基因的表達可通過誘導物如乳酸、丙酮酸和/或乙酸的出現(xiàn)而誘導。當培養(yǎng)基有其他碳源時，該誘導仍可通過乳酸完成。甚至于如在完全培養(yǎng)基中在糖出現(xiàn)時仍有顯著的乳酸誘導。
分離位于棒狀桿菌蘋果酸合成酶之前的DNA片段之后，將任一編碼欲合成的蛋白的結構基因插入其后，該構建物連接于載體中，隨即轉化到棒狀桿菌中。當培養(yǎng)這種轉化體時，在任一時間點，加入誘導物如乳酸、丙酮酸及乙酸，在此，結構基因在期望的時間點表達，因而合成期望的蛋白質。本發(fā)明相關的，提供的DNA片段使多種基因在棒狀桿菌中表達成為可能。由于該分離的DNA來源于棒狀桿菌中，上述調節(jié)在同源系統(tǒng)中完成。因而本發(fā)明相關的DNA區(qū)域首次提供了這種可能性，在同源系統(tǒng)中，通過一種廉價的誘導物，如乙酸，而且不依賴于發(fā)酵培養(yǎng)基的組成，在棒狀桿菌中調節(jié)基因表達。
優(yōu)選制備位于谷氨酸棒狀桿菌的蘋果酸合成酶基因之前，并由此即，從谷氨酸棒狀桿菌中分離的DNA片段；分離該蘋果酸合成酶(aceB)以及表達和調節(jié)所需的結構物。表2中描述了DNA序列和由此推導的氨基酸序列，在表2中，aceB-基因的核糖體結合位點是下劃線的，且有“RBS”標志。aceB的轉錄的潛在終止子通過反向平行的箭頭表示。
因而可以確認來自于蘋果酸合成酶基因的，現(xiàn)有的如表2中的1至547位核苷酸的DNA區(qū)域，用于調節(jié)表達及給出了其他基因。
實施例1.在多種培養(yǎng)基上生長的谷氨酸棒狀桿菌的細胞提取物的蘋果酸合成酶基因的活性的研究用谷氨酸棒狀桿菌菌株ATCC 13032(野生型)的提取物，測定了在多種培養(yǎng)基上生長之后的蘋果酸合成酶(MSY)的活性，以研究碳源對于酶活性的影響。為此細胞在30℃，于10ml 2×TY完全培養(yǎng)基(Sambrook等人，分子克隆，實驗室手冊，1989，冷泉港實驗室)振搖(120 UpM)溫孵14小時。隨即細胞通過離心沉降，用pH 6.8緩沖液(0.1M磷酸鉀)洗一遍，然后懸浮于1ml同樣的緩沖液。隨即將獲得的細胞懸浮液接種到60ml培養(yǎng)基中，以達到光密度OD600為1.0。就應用的培養(yǎng)基而言，涉及2×TY-完全培養(yǎng)基或CgC-基本培養(yǎng)基(Eikmanns等，應用微生物生物技術學34(1991)617-622)加入1％葡萄糖、乙酸、丙酮酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸如葡萄糖鹽作為碳源應用。培養(yǎng)物在30℃再次溫孵，并跟蹤OD600值。當OD600達到8-10時，離心收集細胞，用pH7.6(50mM Tris/HCl)洗滌一遍，懸浮于1ml同種緩中液中，在Branson-Sonifier W250(10分鐘，其脈中有20％間隔，且其功率為30瓦)中通過超聲處理而破碎。為去除細胞碎片，將勻漿物于Sigma 2K 15冷凍離心機中于4℃，13000UpM，離心30分鐘，隨即將澄清的上清(粗提物)用于MSY-活性測定。
酶活測定包含于1.0ml的50mM Tris/HCl(pH 7.6)40mMMgCl2，2mM乙醛酸鈉，0.15mM乙酰-輔酶A，和粗提物的終體積中。該混合物于30℃溫孵。兩分鐘之后于232nm測定吸光度，其基于乙酰CoA的硫酯鍵的裂解而給出。乙酰CoA于232nm處的消光系數(shù)為4.5mM-1cm-1(Stadtman，酶學方法，Vol 3，1957，紐約，學術出版社)。粗提物的蛋白含量借助于Biuret-法(Bradford，分析生物化學72(1976)248-254)測定。測出的具體的蘋果酸合成酶活性在表1中給出。
表1中顯示了生長于2×TY完全培養(yǎng)基及CgC基本培養(yǎng)基以葡萄糖、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸及谷氨酸為碳源的MSY的活性，大約是0.04U/mg蛋白質。在以乳酸鹽和丙酮鹽為碳源的CgC基本培養(yǎng)基上，其MSY-活性提高為0.173U/mg蛋白和0.192U/mg。最高的MSY活性為2,212U/mg蛋白，在生長于以乙酸鹽為碳源的MSY-基本培養(yǎng)基上被觀測到。乙酸鹽加到上述培養(yǎng)基時，同樣引起較強的MSY活性提高，為0.500U/mg蛋白質至1,330U/mg蛋白。該結果表明，在谷氨酸棒狀桿菌中，MSY活性通過培養(yǎng)基的碳源調節(jié)。2.來源于谷氨酸棒狀桿菌的MSY-基因的分離和亞克隆為從谷氨酸棒狀桿菌中分離MSY基因(aceB)，按已知方法(Sambrook et al，分子克隆，實驗室手冊，1989，冷泉港實驗室出版社)構建基于柯斯質粒(Cosmid)pHC79(Hohn和Collins，基因11(1980)291-298)的棒狀桿菌柯斯質粒基因文庫。為此將從谷氨酸棒狀桿菌中分離染色體DNA (Eikmanns et al.，微生物學140(1994)1817-1828)，并用Sau 3A部分消化。當獲得的片段連接到柯斯質粒pHC79的BamHI位點之后，連接物(Ansatz)包裝到λ噬菌體的蛋白衣殼中，轉化大腸桿菌ED 8654(Murray et al.Mol GenGenet 150(1977)53-61)。按照Sternberg等人(基因1(1979)255-280)的方法進行在λ噬菌體的蛋白質衣殼中的重組體柯斯質粒包裝，按Sambrook等人的方法進行轉染大腸桿菌ED 8654(分子克隆，實驗室手冊，1989，冷泉港實驗室出版社)，從獲得的總共30個重組大腸桿菌克隆中分離出相應的柯斯質粒(Sambrook et al，分子克隆，實驗室手冊，1989，冷泉港實驗室出版社)并經(jīng)酶Hind III限制性酶切分析。表明有24個含有被研究的柯斯質粒插入，證明該插入片段的大小約為35kb?？偣灿?200個載有柯斯質粒的大腸桿菌克隆，按已知方法(Sambrook et al，分子克隆，實驗室手冊，1989，冷泉港實驗室出版社)制備柯斯質粒DNA。為了從谷氨酸棒狀桿菌分離ace B基因，按已知方法(Sambrook等，分子克隆，實驗室手冊，1989，冷泉港實驗室出版社)將柯斯質粒基因文庫轉化到MSY-缺陷的大腸桿菌突變株DV 21A05中(Vanderwinkel和De Vlieghere歐洲生物化學雜志5(1968)81-90)。由于MSY-缺陷，突變體DV 21A05在以乙酸鹽為唯一碳源的情況下幾乎不生長。用柯斯質?；蛭膸燹D化這些突變體后總共獲得1000個克隆。在這些克隆中顯示出總共有3個克隆在以乙酸鹽為唯一碳源的M9基本培養(yǎng)基(Sambrook等，分子克隆，實驗室手冊，1989，冷泉港實驗室出版社)上的生長。從這些克隆中分離出相應的柯斯質粒之后(Sambrook等人，分子克隆，實驗室手冊，1989，冷泉港實驗室出版社)，再次轉化E.coli突變體DV 21A05，生成的克隆再次在以乙酸鹽為唯一碳源的M9-培養(yǎng)基上生長。猜想來源于谷氨酸棒狀桿菌的aceB-基因局限于這三個柯斯質粒里。
為了將來源于谷氨酸棒狀桿菌的aceB-基因以較小片段插入，用限制性酶Sau 3A部分消化這三個柯斯質粒，按已知方法(Sambrook等，分子克隆，實驗室手冊，1989，冷泉港實驗室出版社)在電場中在0.8％瓊脂糖凝膠上拆分。在3.0kb至6.0kb大小范圍內的片段通過電洗脫(Sambrook等，分子克隆，實驗室手冊，1989，冷泉港實驗室出版社)從凝膠中分離，且連接到載體pHCYC 184(張和Cohen，細菌雜志(1978)1141-1156)的BamHI酶切位點上。用該連接混合物轉化大腸桿菌DV 21A05，再次研究獲得的轉化子在以乙酸鹽為唯一碳源時生長的能力。用這種方法可以分離到這樣的克隆，其質粒允許突變體DV21A05在乙酸鹽上生長。從這些重組子菌株中分離相應的質粒，并進行染色體圖譜分析。其中一個質粒pAB-17的限制性圖譜如

圖1描述。從這一質粒中，按已知方法，將MSY編碼DNA片段通過BfrI-PvuI限制性酶切作為3kb片段分離，并連接到谷氨酸棒狀桿菌/大腸桿菌-穿梭載體pEKU(Eikmanns等，基因102(1991)93-98)。當載體中，插入片段的取向相互獨立的情況下，新構建的質粒被稱為pEKB1a和pEKB1b。這兩個質粒的限制性圖譜在圖2中展示。3.MSY結構基因和鄰近區(qū)域的核苷酸序列分析為了測序，將兩個來源于質粒pAB-17的重疊部分片段，1.6kbBfrI-KpnI和1.8kb SpnI-PvuI-片段按已知方法分離。這兩個片段的懸垂末端將用Klenow聚合酶填平為平整末端(Sambrook等，分子克隆，實驗室手冊，1989，冷泉港實驗室出版社)且連結到質粒pUC 18(Vieira和Messing，基因19(1982)259-268)的合適位點上。如此生成的質粒將按照Henikoff(基因28(1984)351-359)的方法，用于制備缺失構建物，該構建物隨即通過鏈終止法測序。此時獲得的3kb BfrI-PvuI-片段的全部序列在表2中描述。此外表2還描述由aceB基因推導的來自于谷氨酸棒狀桿菌的MSY的蛋白質序列，處于該基因之前的核糖體結合位點和處于該基因之后的轉錄終止結構。4.谷氨酸棒狀桿菌菌株的MSY活性，該菌株的質粒上載有MSY-基因通過電穿孔法(Liebl等，F(xiàn)EMS Microbiol Lett 65(1989)299-304)將質粒pEKB1a和pEKB1b導入谷氨酸棒狀桿菌，形成的菌株被稱為WT(pEKB1a)和WT(pEKB1b)按已知方法，將新構建的谷氨酸棒狀桿菌菌株在以葡萄糖、葡萄糖/乙酸鹽以及乙酸鹽作為碳源的CgC基本培養(yǎng)基上生長，直至OD600達到8-10。制備粗提物且以此測定MSY比活。測定的MSY活性在表3中描述。
與谷氨酸棒狀桿菌野生型(WT)和含有起始載體pEK0的谷氨酸棒狀桿菌菌株WT(pEK0)相比，谷氨酸棒狀桿菌菌株WT(pEKB1a)和WT(pEKB1b)顯示了在所有三種碳源上生長時的明顯提高的活性。該結果證明來源于谷氨酸棒狀桿菌的aceB-基因有功能地處于3kbBfrI-PvuI片段上。與這些菌株生長于葡萄糖上相比，谷氨酸棒狀桿菌菌株(pEKB1a)和WT(pEKB1b)在CgC-葡萄糖/乙酸鹽上生長，其MSY活性幾乎高出8倍。與生長在CgC葡萄糖上相比，這兩個菌株生長在以乙酸鹽為唯一碳源的CgC基本培養(yǎng)基上時，其MSY活性甚至高出16至18倍。該結果證實在分離的片段上，存在著所有aceB-基因表達和調節(jié)所需的結構物，即啟動子和調節(jié)序列。這些結構物位于aceB基因的前面。該克隆的片段在實際的aceB結構基因之前還有584bp(見表2)，用于表達和調節(jié)的結構大概局限于該DNS區(qū)內。5.來源于谷氨酸棒狀桿菌的aceB-基因的調節(jié)和表達的研究為了證明觀測到的MSY的調節(jié)涉及基因水平上的調節(jié)，而不是涉及酶本身的調節(jié)(如通過抑制激活或共價修飾)，以其蛋白質模式(Proteinmuster)研究在具有葡萄糖的CgC基本培養(yǎng)基上生長的谷氨酸棒狀桿菌WT如WT(pEKB1a)細胞和在具有乙酸鹽的CgC基本培養(yǎng)基上生長的谷氨酸棒狀桿菌WT(pEKB1a)細胞的提取物。這樣一來將提及的菌株按已知方法于相應培養(yǎng)基上培養(yǎng)，制備其粗提物按Laemmli(自然227(1970)680-685)在變性條件下于12.5％聚丙烯酰胺凝膠上拆分(圖3)。為了定位粗提物中的MSY-蛋白帶，來自于谷氨酸棒狀桿菌的MSY純化至均一(見附圖1)平行于在變性條件下的粗提物電泳(圖3)。谷氨酸棒狀桿菌WT于CgC-乙酸鹽上生長之后，與這些菌株生長于CgC-葡萄糖相比，顯示出明顯的強烈的蛋白帶。菌株WT(pEKB1a)表明在CgC乙酸鹽生長后有一較強的MSY蛋白帶。由帶的強度可以估計，在菌株中MSY占總細胞蛋白的約20％。這一結果表明，這些aceB表達和調節(jié)必需的結構，在環(huán)境的誘導下，導致了大量的蛋白質的新合成。此外，通過此結果，顯然觀測到的在乙酸鹽上生長之后的MSY活性的提高，是由于MSY蛋白的新合成引起的。6.在一獨立體系中，從功能上測試處于aceB-基因的DNS區(qū)域在aceB-基因前的DNS區(qū)用已知方法作為574bp BfrI-DraI-片段分離，懸垂末端用Klenow聚合酶填平，并連接到用Klenow聚合酶填平的載體pEKplCm的SalI酶切位點(Eikmanns等，基因102(1991)93-98)。該質粒在插入位點之后載有氯霉素乙酰轉移酶-基因(cat)，然而沒有啟動子，即，質粒pEKplCm無法產生cat基因。BfrI-DraI片段連接到載體pEKplCm之后，用已知方法測序，可以確定，BfrI-DraI片段取向是在位于aceB-基因之前的cat-基因之前。相應質粒被稱為pIWI。用已知方法將質粒pIWI導入谷氨酸棒狀桿菌之后，測定在CgC-葡萄糖，CgC-葡萄糖/乙酸鹽及CgC-乙酸鹽上生長的該菌株的氯霉素-乙酰轉移酶活性(CAT)。為此，待研究的菌株按已知方法在上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直到OD600為8到10，制備粗提物，按Shaw(酶學方法43(1975)737-755)測定其CAT比活。該反應包含于1.0ml終體積的100mM Tris/HCl pH7.8，1mM乙酰輔酶A，1mM 5，5-二硫雙-(2-硝基苯酸)和粗提物中，用2.5mM氯霉素啟動反應。該混合物于30℃溫孵，經(jīng)2分鐘后，將提取的混合物于412nm處測定。粗提物蛋白質含量用Biuret法(Bradford，分析化學72(1976)248-254)測定。測得的CAT比活于表4中給出。然而在研究的條件下，谷氨酸棒狀桿菌WT未被證實具有CAT活性，而重組體菌株谷氨酸棒狀桿菌在所有的碳源上都顯示了CAT活性。但是，生長于CgC-葡萄糖上的CAT活性比生長于CgC-葡萄糖/乙酸鹽上低20倍，比生長于CgC-乙酸鹽上低50倍。該結果證明分離的574bp BfrI-DraI片段能夠調節(jié)外源基因的基因表達。乙酸鹽可誘導外源基因，甚至于在糖存在時。附錄I從谷氨酸棒狀桿菌中純化MSY為從谷氨酸棒狀桿菌中純化MSY，采用60ml在CgC-乙酸鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)的OD600為8至10的培養(yǎng)物。細胞用20ml 50mM嗎啉代乙磺酸(MES)/NaOH pH6.0洗兩遍，懸浮于1ml加入5U/ml DNase，15μg/mg RNase和100μm苯甲磺?；锏耐痪彌_液中。按已知方法進行細胞碎片的增溶和分離。所有的純化步驟于4℃進行。細胞提取物用50mM MES/NaOH pH稀釋到10ml。于183,000×g超速離心2小時后，將上清借助于HR 5/5 Mono Q-陰離子交換柱色譜(Pharmacia LKB，F(xiàn)reiburg德國)進行FPLC制備。第一次色譜純化時，MSY用NaCl梯度為0.1M至0.4M的50mM MES/NaOH pH6洗脫。為進行第二次色譜，將部分純化的MSY的緩沖液借助于超濾由50mMMES/NaOH pH6.0轉換為50mM Tris/HCl pH8。進行第二次色譜純化時，MSY用NaCl梯度為0.2M至0.5M的50mM Tris/HCl pH8洗脫。進行第二次色譜拆分時，流速定為1ml/min。第二次拆分的流出液一般以1ml級分收集，且測定MSY活性。具有活性的級分一般進行合并。表1在不同碳源上生長的谷氨酸棒狀桿菌的粗提物的蘋果酸合成酶(MSY)活性培養(yǎng)基 MSY比活(U/mg蛋白)2×TY-完全培養(yǎng)基0.0302×TY-完全培養(yǎng)基+1％乙酸鹽 0.840CgC-基本培養(yǎng)基(MM)+1％葡萄糖0.040CgC-MM+1％乙酸鹽2.212CgC-MM+1％丙酮酸鹽 0.192CgC-MM+1％乳酸鹽0.173CgC-MM+1％檸檬酸鹽 0.038CgC-MM+1％琥珀酸鹽 0.045CgC-MM+1％富馬酸鹽 0.034CgC-MM+1％葡糖酸鹽 0.041CgC-MM+1％乙酸鹽+1％葡萄糖 0.970CgC-MM+1％乙酸鹽+1％丙酮酸鹽0.730CgC-MM+1％乙酸鹽+1％乳酸鹽 0.860CgC-MM+1％乙酸鹽+1％檸檬酸鹽0.500CgC-MM+1％乙酸鹽+1％琥珀酸鹽0.920CgC-MM+1％乙酸鹽+1％富馬酸鹽0.910CgC-MM+1％乙酸鹽+1％葡糖酸鹽1.330表2. . . . . . . . .1 CTTAAGTGCTGATTCGCAATGGGCGGTGCCGACCACAAAGTATGAGCTAATGCACTGTCACTGTTTCGACGTGATGTGCATCGGTTTGCG. . . . . . . . .91 TGGTGGCGTGGTTCACACATTGCTCCATCGGGCATTGGTGCGTCAATCGGTTTGGGTTTTTAAGTTTTGTGCGGGGGTGGTCACCCCTGT. . . . . . . . .181 TGTGAAGTTTGCAAAGTTCTGGCTTCGCAGAAAAAGTGGGCGGGGGAGTTGCTAGTACGGATGTACTGGGCAAATGCTCTGAAATGGGAA. . . . . . . . .271 AATGCAGGCACCGCAACGTTCCGTAGGTTTCGAAGGTGTGACCTAGATAAAAGTCGGGGTTAGGCGGGGGTAATGACTTAGTAAAGTTCG. . . . . . . . .361 CAAACCCCTTTTGCTGGTGACGGTGATCACTTAGTCTGATCACATCGCCAAACACGATAAGGGTTGAAATCGAAAGAAGAGTGGCACCTA. . . . . . . . .451 GATTCCAGAGGTAGTCAGAGTGCTTTTCTTAAAAGAGTTTTCACAACCGTTAACGCGTAGCCAAACAAGAAGGATTCGCATTCTTCTGGT. . . . . . . . .541 TTAGGCACAGGTCATCTAAAACCCATGCTTTAAAAGGAGCCTTCAATGACTGAACAGGAACTGTTGTCTGCTCAGACTGCCGACAACGCTRBS M T E Q E L L S A Q T A D N A. . . . . . . . .631 GGAACTGACAGCACCGAACGCGTTGACGCGGGCGGAATGCAGGTTGCAAAAGTTCTCTACGACTTTGTAACCGAAGCGGTACTCCCTCGCG T D S T E R V D A G G M Q V A K V L Y D F V T E A V L P R. . . . . . . . .721 GTGGGTGTGGATGCGGAAAAGTTCTGGTCCGGATTCGCCGCCATCGCCCGGGACCTCACCCCACGCAACCGCGAGCTGCTTGCTCGCCGCV G V D A E K F W S G F A A I A R D L T P R N R E L L A R R. . . . . . . . .811 GATGAACTGCAGATGCTTATCGACGACTACCACCGCAACAACTCCGGCACCATCGACCAAGAGGCGTACGAGGATTTCCTCAAAGAAATCD E L Q M L I D D Y H R N N S G T I D Q E A Y E D F L K E I. . . . . . . . .901 GGATACTTGGTTGAGGAGCCAGAAGCTGCAGAAATCCGTACCCAAAACGTCGATACGGAAATCTCCAGCACCGCAGGACCTCAGCTGGTTG Y L V E E P E A A E I R T Q N V D T E I S S T A G P Q L V. . . . . . . . .991 GTTCCAATTCTGAACGCACGCTTCGCGCTGAACGCTGCCAATGCTCGCTGGGGTTCCCTCTACGATGCGTTGTACGGCACCAACGCCATCV P I L N A R F A L N A A N A R W G S L Y D A L Y G T N A I. . . . . . . . .1081 CCAGAAACTGATGGCGCTGAAAAGGGCAAGGAGTACAACCCGGTCCGCGGCCAGAAGGTCATCGAGTGGGGTCGTGAATTCCTCGACAGCP E T D G A E K G K E Y N P V R G Q K V I E W G R E F L D S. . . . . . . . .1171 GTTGTCCCACTGGACGGTGCTTCGCATGCCGATGTTGAGAAGTACAACATCACCGATGGAAAGCTTGCAGCCCACATTGGAGATAGCGTCV V P L D G A S H A D V E K Y N I T D G K L A A H I G D S V表2(續(xù)頁). . . . . . . . .1261 TACCGACTGAAAAACCGTGAATCCTACCGTGGCTTCACCGGCAACTTCCTTGATCCAGAAGCAATCCTGCTGGAAACCAACGGCCTGCACY R L K N R E S Y R G F T G N F L D P E A I L L E T N G L H. . . . . . . . .1351 ATCGAGCTGCAGATCGATCCTGTCCACCCAATCGGCAAGGCAGACAAGACTGGTCTCAAAGACATCGTTTTGGAATCTGCGATCACCACGI E L Q I D P V H P I G K A D K T G L K D I V L E S A I T T. . . . . . . . .1441 ATCATGGACTTCGAAGACTCCGTTGCAGCTGTTGATGCTGAAGACAAGACCTTAGGTTACTCTAACTGGTTCGGACTCAACACCGGCGAAI M D F E D S V A A V D A E D K T L G Y S N W F G L N T G E. . . . . . . . .1531 CTGAAAGAAGAGATGTCCAAGAACGGACGCATCTTCACCCGTGAGCTCAACAAGGACCGCGTCTACATTGGCCGCAATGGTACCGAGCTGL K E E M S K N G R I F T R E L N K D R V Y I G R N G T E L. . . . . . . . .1621 GTTCTGCACGGTCGTTCCCTGCTGTTCGTCCGCAACGTTGGTCACCTCATGCAAAACCCATCCATCTTGATTGATGGCGAGGAGATCTTCV L H G R S L L F V R N V G H L M Q N P S I L I D G E E I F. . . . . . . . .1711 GAAGGCATCATGGATGCTGTCTTGACCACTGTTTGTGCCATCCCAGGAATTGCTCCGCAGAACAAGATGCGCAATTCCCGCAAGGGCTCCE G I M D A V L T T V C A I P G I A P Q N K M R N S R K G S. . . . . . . . .1801 ATCTACATCGTGAAGCCTAAGCAGCACGGCCCTGAAGAAGTCGCGTTCACCAACGAGCTCTTCGGCCGCGTTGAGGATCTGCTTGATCTGI Y I V K P K Q H G P E E V A F T N E L F G R V E D L L D L. . . . . . . . .1891 CCACGCCACACCTTGAAGGTTGGTGTTATGGATGAGGAGCGTCGCACGTCCGTGAACCTGGATGCCAGCATCATGGAAGTTGCTGACCGCP R H T L K V G V M D E E R R T S V N L D A S I M E V A D R. . . . . . . . .1981 TTGGCATTCATCAACACTGGCTTCCTGGACCGCACCGGCGATGAAATCCACACCTCCATGGAAGCAGGCGCCATGGTGCGCAAGGCTGATL A F I N T G F L D R T G D E I H T S M E A G A M V R K A D. . . . . . . . .2071 ATGCAGACCGCACCGTGGAAGCAGGCCTACGAGAACAACAACGTTGATGCAGGTATTCAGCGTGGTCTTCCTGGCAAGGCTCAGATCGGTM Q T A P W K Q A Y E N N N V D A G I Q R G L P G K A Q I G. . . . . . . . .2161 AAGGGCATGTGGGCGATGACTGAACTCATGGCAGAAATGCTGGAGAAGAAGATCGGCCAGCCACGCGAAGGCGCCAACACTGCATGGGTTK G M W A M T E L M A E M L E K K I G Q P R E G A N T A W V表2(續(xù)頁). . . . . . . . .2251 CCTTCACCAACTGGTGCGACGCTGCACGCAACGCACTACCACTTGGTTGATGTGTTCAAGGTTCAAGACGAACTGCGTGCTGCCGGCCGCP S P T G A T L H A T H Y H L V D V F K V Q D E L R A A G R. . . . . . . . .2341 CGCGACAGCCTGCGCAACATTCTCACCATTCCAACCGCACCAAACACCAATTGGTCTGAGGAAGAGAAGAAGGAAGAGATGGACAACAACR D S L R N I L T I P T A P N T N W S E E E K K E E M D N N. . . . . . . . .2431 TGCCAGTCCATCCTCGGATACGTTGTGCGCTGGGTTGAGCACGGTGTTGGTTGCTCCAAGGTTCCAGACATCCATGACATCGACCTCATGC Q S I L G Y V V R W V E H G V G C S K V P D I H D I D L M. . . . . . . . .2521 GAAGACCGCGCAACGCTGCGTATTTCCTCGCAGATGCTGGCCAACTGGATCCGCCATGATGTTGTCTCGAAGGAGCAGGTCTTGGAGTCAE D R A T L R I S S Q M L A N W I R H D V V S K E Q V L E S. . . . . . . . .2611 CTGGAACGAATGGCAGTGGTCGTCGACAAGCAAAATGCGGGCGACGAGGCCTACCGCGATATGGCGCCGAACTACGACGCCTCCCTCGCCL E R M A V V V D K Q N A G D E A Y R D M A P N Y D A S L A. . . . . . . . .2701 TTCCAGGCGGCTAAGGACTTGATTTTCGAAGGCACCAAGTCCCCATCGGGCTACACCGAGCCCATCTTGCACGCACGCCGCCGCGAGTTCF Q A A K D L I F E G T K S P S G Y T E P I L H A R R R E F. . . . . . . . .2791 AAAGCAAAAAACTAAGCACGCTTTTCGACGCTTACCTGCATCCCAACGGTGACTGACTGCCCCGGAGCCACCCTCACTCCTTTTTGGTCAK A K N -. . . . . . . . .2881 GCACCCAAAAGCGCCGGTTCAACACACACAAAGTCGCGCCATTCACCTTCGCCAATATCGGCCACGGTGGAGGCGCGACTTTCGCCTGGA---------------------→ ←---------------------. . . . . . . . .2971 TTCCACACCACAGTGGAATCATGACCATCGCCCTCAATGGTGATGATGCGATCG表3在以葡萄糖、葡萄糖/乙酸鹽及乙酸鹽為碳源的CgC基本培養(yǎng)基生長的谷氨酸棒狀桿菌野生型(WT)和具有質粒pEK0、pEKB1a和pEKB1b的重組谷氨酸棒狀桿菌菌株的粗提物的蘋果酸合成酶(MSY)的比活。谷氨酸 MSY比活(U/mg蛋白質)棒狀桿菌 CgC-葡萄糖 CgC-葡萄糖/乙酸鹽 CgC-乙酸鹽WT 0.0400.970 2.11WT(pEK0) 0.0380.954 2.23WT(pEKB1a) 0.3503.120 6.22WT(pEKB1b) 0.3743.240 6.08表4在以葡萄糖、葡萄糖/乙酸鹽及乙酸鹽為碳源的CgC基本培養(yǎng)基生長的谷氨酸棒狀桿菌的野生型(WT)和重組谷氨酸棒狀桿菌菌株WT(pIWI)的粗提物的氯霉素乙?；D移酶(CAT)的比活谷氨酸CAT比活(U/mg蛋白質)棒狀桿菌CgC-葡萄糖CgC-葡萄糖/乙酸鹽CgC-乙酸鹽WT 0.0010.001 0.001WT(pIWI) 0.0260.620 1.320
權利要求
1.一種位于棒狀桿菌蘋果酸合成酶基因之前且從該基因分離的DNA片段，在構建入載體并轉化到棒狀桿菌中之后，它調節(jié)任一編碼蛋白質、且插入到該DNA片段之后的結構基因的表達。
2.權利要求1的DNA片段，其來源于谷氨酸棒狀桿菌的蘋果酸合成酶基因。
3.權利要求2的DNA片段，其具有表2所示的1至574位核苷酸，其中表2是要求的組成部分。
4.上述權利要求1至3之一的DNA片段，其具有任一插在后面的(nachgeschalteten)的結構基因。
5.載體，含有權利要求1至4之任一的DNA片段。
6.重組體棒狀桿菌細胞，含有可復制形式的權利要求1至4之任一的DNA片段。
7.權利要求6的重組體棒狀桿菌細胞，含有權利要求5的載體。
8.通過培養(yǎng)轉化子棒狀桿菌生產任一蛋白質的方法，該轉化子棒狀桿菌含有一種可復制的從棒狀桿菌分離的DNA片段，編碼待合成的蛋白質的結構基因插入到該片段的后面，該片段調節(jié)編碼待合成蛋白質的結構基因的表達，該轉化子棒狀桿菌培養(yǎng)于加入了誘導物的培養(yǎng)基中，隨后結構基因表達，從而合成期望的蛋白質。
9.權利要求8的方法，其特征在于，乳酸鹽、丙酮酸鹽，特別是乙酸鹽作為誘導物加至培養(yǎng)基中。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種DNA片段,它位于棒狀桿菌蘋果酸合成酶基因之前,并由此分離。任何編碼蛋白質的結構基因均可插在該DNA片段的后面。將這樣一個構建物轉化到棒狀桿菌之后,將調節(jié)插入到該DNA片段之后的結構基因的表達。本發(fā)明還涉及一種通過培養(yǎng)轉化的棒狀桿菌合成任一蛋白的方法。這種細菌含有一種可復制形式的來源于棒狀桿菌蘋果酸合成酶的DNA片段。編碼待合成的蛋白質的結構基因插入到該片段的后面。由于編碼待合成的蛋白質的結構基因的表達由位于其前面的DNA片段調節(jié),一但合適的誘導劑加至培養(yǎng)基中,結構基因被表達,期望的蛋白質被合成。
文檔編號C12N15/31GK1174574SQ95197304
公開日1998年2月25日 申請日期1995年11月7日 優(yōu)先權日1994年11月11日
發(fā)明者D·賴恩徹爾德, B·艾克曼斯, H·扎姆 申請人:于利奇研究中心有限公司