專利名稱：天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶作為除草劑的靶標(biāo)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶(E.C.2.1.3.2)作為除草劑活性組份的新靶標(biāo)的鑒定。本發(fā)明進(jìn)一步涉及SEQ ID NO1或SEQ ID NO3或SEQ ID NO5的DNA序列或其編碼具有天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶活性的植物多肽的部分或衍生物，在產(chǎn)生一種實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中的應(yīng)用，該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)用于鑒定植物天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶抑制劑。本發(fā)明還涉及一種方法或?qū)嶒?yàn)系統(tǒng)，用于尋找能夠抑制植物天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶活性的物質(zhì)，還涉及使用這些方法或該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)所鑒定出的植物天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶抑制劑。
這個過程只能利用合成有機(jī)物質(zhì)的生物化學(xué)反應(yīng)來完成。核苷酸在植物中從頭合成。作為核酸的組份，它們格外重要。共價連接地，核苷酸激活碳水化合物，生物合成多糖。它們進(jìn)一步激活脂類合成的主要基團(tuán)。幾乎所有的代謝途徑都涉及核苷酸。三磷酸核苷，特別是ATP，驅(qū)動多數(shù)細(xì)胞需能反應(yīng)。還發(fā)現(xiàn)腺嘌呤核苷酸在如輔酶A和尼克酰胺以及黃素輔酶的必需因子中作為組份，這些必需因子涉及大量的細(xì)胞反應(yīng)。鳥嘌呤核苷-5’-三磷酸(GTP)偶連的水解定義了各種細(xì)胞過程的反應(yīng)方向，如蛋白翻譯，微管組裝，囊泡運(yùn)輸，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細(xì)胞分裂。進(jìn)一步的，在植物茜草科(Rubiaceae) 和山茶科(Theaceae)中，核苷酸構(gòu)成甲基黃嘌呤類的生物合成代謝的起始物，如咖啡因和可可堿。
由于植物依靠有效的核苷酸新陳代謝，可以推測，與核苷酸生物合成相關(guān)的酶可以作為除草劑作用的合適靶蛋白(靶標(biāo))。這樣，已描述了一些能夠抑制植物中嘌呤從頭生物合成的活性成分。一個可以提及的實(shí)例為天然物質(zhì)hydanthocidin，其在植物中磷酸化后可以抑制腺苷酸琥珀酸合成酶(ASS)(Siehl等人，Plant Physiol.110(1996)，753-758)。
嘌呤從頭生物合成的酶反應(yīng)以及嘧啶從頭生物合成的酶反應(yīng)對于核苷酸代謝的調(diào)節(jié)很重要。天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶(ATCase)是這些酶中之一。在嘧啶生物合成的第二步，ATCase催化氨甲酰磷酸與天冬氨酸連接，產(chǎn)生氨甲酰天冬氨酸，即氨甲酰天冬氨酸脫水酶的底物。
氨甲酰磷酸也是精氨酸生物合成中鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶的底物。在植物和許多其它真核和原核生物中，ATCase受到嘧啶核苷酸的變構(gòu)反饋調(diào)節(jié)。UMP和UDP對于夏南瓜(zucchini)ATCase的抑制作用比CMP和CDP更強(qiáng)(Lovatt和Cheng，Plant Physiol.75(1984)，511-515)。在釀酒酵母中，URA2基因編碼具有ATCase和氨甲酰磷酸合成酶活性(CPS)的融合蛋白。在高等真核生物中，ATCase是三功能蛋白(CAD)的組份，該蛋白除含有ATCase和CPS外，還含有氨甲酰天冬氨酸脫水酶。在大腸桿菌(E.coli)中，ATCase作為三個催化亞基和三個調(diào)節(jié)亞基的異數(shù)復(fù)合物存在。植物ATCase中還未發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)亞基。
植物ATCase基因最初通過功能互補(bǔ)作用從大腸桿菌(Williamson和Slocum，Plant Physiol.105(1994)，377-384)和釀酒酵母pyrB突變株(Nasr等，Mol.Gen.Genet.244(1994)，23-32)中被分離。同時，來自各種植物物種如，鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)(AB024036)，豌豆(Pisum sativum)(M96981，U05293，L15798)，番茄(Lycopersiconesculentum)(X74072)，稻(Oryza sativa)(C27734)和大豆(Glycinemax)(AW132309)的ATCase基因可以在數(shù)據(jù)庫中找到。從豌豆中分離到了3種ATCase的同工型。這些同工型中至少有一種可以在大腸桿菌中功能性地表達(dá)(Williamson和Slocum，Plant Physiol.105(1994)，377-384)。
植物中ATCase的活性檢測主要在葉綠體中(Shibata等，PlantPhysiol.80(1986)，126-129)。底物類似物N-磷酸乙酰-L-天冬氨酸(PALA)是一種來自原核和真核的強(qiáng)有力的ATCase抑制劑，并且具有抗微生物的功能。
一種酶作為除草劑的靶標(biāo)是否合適的證據(jù)可以通過在轉(zhuǎn)基因植物中利用例如反義技術(shù)來減少該酶的活性而表明。如果將特定基因的反義DNA導(dǎo)入植物，會導(dǎo)致生長減少，這暗示這個活性減少的酶作為除草劑活性成分的作用位點(diǎn)是合適的。例如，在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物中反義抑制乙酰乳酸合成酶(ALS)導(dǎo)致與對對照植物用ALS-抑制除草劑進(jìn)行處理可比較的表現(xiàn)型(H_fgen等，Plant Physiology 107(1995)，469-477)。
我們發(fā)現(xiàn)這個目的可以這樣達(dá)到分離編碼天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶植物酶的DNA序列，產(chǎn)生植物天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶的反義構(gòu)建體并在植物中表達(dá)，以及在細(xì)菌或真核細(xì)胞中功能性地表達(dá)植物天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶。
為實(shí)現(xiàn)該目的，來自馬鈴薯的編碼植物天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶的cDNA以及來自展葉劍葉蘚(Physcomitrella patens)的2個部分cDNA被分離出來并測序，參見實(shí)施例1，2.1和2.2，或者序列表SEQ ID NO1，SEQ ID NO3和SEQ ID NO5。
對具有天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶的反義構(gòu)建體的馬鈴薯植物進(jìn)行了更詳細(xì)的表征。該植物顯示出不同程度的生長阻滯。轉(zhuǎn)基因系和第1和2代的后代顯示在土壤中生長降低。通過Northern雜交在生長降低的植物中檢測到相較于野生型植物有所減少的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶RNA數(shù)量，參見實(shí)施例5。進(jìn)一步的，通過測量酶活，在轉(zhuǎn)基因系中檢測到相較于野生型植物有所減少的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶活性量。天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶活性的表達(dá)水平和減少與生長阻滯相關(guān)。盡管很可能在馬鈴薯中存在幾種天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶的同工型，但是令人驚奇地發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶反義構(gòu)建體會導(dǎo)致植物的生長降低。這種明顯的關(guān)聯(lián)首次清楚地鑒別天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶為除草劑活性成分的合適的靶蛋白(靶)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過高處理量的方法鑒定植物天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶抑制劑的方法。所以本發(fā)明涉及植物天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶特別是來自馬鈴薯和展葉劍葉蘚(Physcomitrella patens)的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶，在合適的表達(dá)系統(tǒng)中的功能性表達(dá)，還涉及所獲的酶在測定天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶活性的體外實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中的應(yīng)用。
為能夠獲得有效的植物天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶抑制劑，必須提供合適的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中能夠研究抑制劑-酶的結(jié)合。為達(dá)到這個目的，例如，來自馬鈴薯或展葉劍葉蘚的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶的完全cDNA序列或該cDNA序列的合適片段被克隆到表達(dá)載體中(pQE，Qiagen)并在大腸桿菌中超量表達(dá)。
或者，這個含有SEQ ID NO1，SEQ ID NO3或SEQ ID NO5的DNA序列，或DNA子序列(subsequence)，或這些序列的衍生物的表達(dá)盒還可以在例如其它的細(xì)菌，酵母，真菌，藻類，植物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及SEQ ID NO1，SEQ ID NO3或SEQ ID NO5衍生的DNA序列或能夠與這些序列雜交的并且編碼具有天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶生物活性的蛋白的DNA序列的應(yīng)用。
借助于表達(dá)盒表達(dá)的植物天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶蛋白特別適于尋找天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶特異性的抑制劑。
為達(dá)到該目的，例如，植物天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶可在酶試驗(yàn)中被采用，該試驗(yàn)中，在存在或不存在待測的活性成分條件下，測定天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶活性。兩個活性測定結(jié)果的比較可以對待測活性成分的抑制能力給出定性和定量的描述，參見實(shí)施例9。
本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)可快速簡單地測定多種化合物是否具有除草劑屬性。使用該方法，具有強(qiáng)作用的物質(zhì)可以從大量物質(zhì)中被特異地、可重復(fù)地選出，以將這些物質(zhì)用于后續(xù)的進(jìn)一步的深入檢驗(yàn)，而這些檢驗(yàn)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種通過如下方式鑒定具有除草劑活性潛能的植物天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶抑制劑的方法克隆植物天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶基因，在合適的表達(dá)盒如在昆蟲細(xì)胞中過量表達(dá)，裂解細(xì)胞并在測定酶活的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，在低分子量化合物存在下，直接或者在濃縮或分離天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶之后，應(yīng)用該細(xì)胞提取物。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種鑒定除草劑活性物質(zhì)的方法，該物質(zhì)抑制植物中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶活性，該方法包括a)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，植物組織或植物細(xì)胞，其包含額外的編碼具有天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶活性的酶的DNA序列，并且能夠過量表達(dá)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶活性；b)將物質(zhì)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物，植物細(xì)胞，植物組織或植物部分以及未轉(zhuǎn)化的植物，植物細(xì)胞，植物組織或植物部分；c)在應(yīng)用了化學(xué)物質(zhì)后，測定該轉(zhuǎn)基因和未轉(zhuǎn)基因的植物，植物細(xì)胞，植物組織或植物部分的生長或存活力；以及d)對比在應(yīng)用了化學(xué)物質(zhì)后該轉(zhuǎn)基因和未轉(zhuǎn)基因的植物，植物細(xì)胞，植物組織或植物部分的生長或存活力；未轉(zhuǎn)化植物，植物細(xì)胞，植物組織或植物部分的生長或存活力被抑制，而轉(zhuǎn)基因植物，植物細(xì)胞，植物組織或植物部分未被嚴(yán)重抑制，則證實(shí)b)的物質(zhì)能夠抑制植物天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶活性，具有除草劑活性。
本發(fā)明還進(jìn)一步涉及能夠用上述實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)鑒定的除草劑活性化合物。
除草劑活性的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶抑制劑可用作脫葉劑，干燥劑，殺草劑(haulm killers)以及特別是除草劑。廣義的雜草應(yīng)理解為所有在不期望它們生長的地方生長的植物。排除其它因素外，本發(fā)明實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)找到的活性成分作為完全或選擇性除草劑則依賴于所用的用量。
除草劑活性天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶抑制劑可用于例如針對下述雜草下列屬的雙子葉雜草白芥屬(Sinapis)，獨(dú)行菜屬(Lepidium)，豬殃殃屬(Galium)，縷屬(Stellaria)，母菊屬(Matricaria)，春黃菊屬(Anthemis)，牛騰菊屬(Galinsoga)，藜屬(Chenopodium)，蕁麻屬(Urtica)，千里光屬(Senecio)，莧屬(Amaranthus)，馬齒莧屬(Portulaca)，苔兒屬(Xanthium)，旋花屬(Convolvulus)，番薯屬(Ipomoea)，蓼屬(Polygonum)，田菁屬(Sesbania)，豚草屬(Ambrosia)，薊屬(Cirsium)，飛廉屬(CardUUS)，苦苣菜屬(Sonchus)，茄屬(Solanum)，蔊菜屬(Rorippa)，節(jié)節(jié)菜屬(Rotala)，母草屬(Lindernia)，野芝麻屬(lamium)，婆婆納屬(Veronica)，白麻屬(Abutilon)，Emex，曼陀羅屬(Datura)，堇菜屬(Viola)，鼬瓣花屬(Galeopsis)，罌粟屬(Papaver)，矢車菊屬(Centaurea)，三葉草屬(Trifolium)，毛茛屬(Ranunculus)，蒲公英屬(Taraxacum)。
下列屬的單子葉雜草稗屬(Echinochloa)，天藍(lán)草屬(Setaria)，稷屬(Panicum)，馬唐屬(Digitaria)，梯牧草屬(Phleum)，早熟禾屬(Poa)，木蘋果屬(Festuca)，穇屬(Eleusine)，臂形草屬(Brachiaria)，黑麥草屬(Lolium)，雀麥屬(Bromus)，燕麥屬(Avena)，莎草屬(Cyperus)，高粱屬(Sorghum)，冰草屬(Agropyron)，狗牙根屬(Cynodon)，雨久花屬(Monochoria)，飄拂草屬(Fimbristyslis)，石縫蘚屬(Sagittaria)，Eleocharis，蔗草屬(Scirpus)，雀稗屬(Paspalum)，鴨嘴草屬(Ischaemum)，尖瓣花屬(Sphenoclea)，龍爪茅屬(Dactyloctenium)，剪股穎屬(Agrostis)，看麥娘屬(Alopecurus)，阿披拉草屬(Apera)。
本發(fā)明還涉及表達(dá)盒在產(chǎn)生尋找除草劑活性化合物的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中的應(yīng)用，該表達(dá)盒序列編碼馬鈴薯或展葉劍葉蘚天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶或其功能等同物。核酸序列可以是如DNA或cDNA序列。
這樣的表達(dá)盒進(jìn)一步包括調(diào)節(jié)核酸序列，其在宿主細(xì)胞中指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。根據(jù)一個優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的表達(dá)盒包含上游，即在編碼序列的5’末端，啟動子及下游，即，在3’末端，多聚腺苷酸化的信號以及合適的話，其它調(diào)節(jié)各調(diào)節(jié)元件，其與編碼天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶的基因操作性連接，而該基因位于其中。操作性連接應(yīng)理解為啟動子，編碼序列，終止子以及如果合適的話，其它各調(diào)節(jié)元件的順序安排，調(diào)節(jié)元件的數(shù)量應(yīng)使每個調(diào)節(jié)元件在編碼序列被表達(dá)時能如期望行使功能。
該類表達(dá)盒可這樣形成將合適的啟動子與合適的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶DNA序列以及多聚腺苷酸信號進(jìn)行融合，可采用常規(guī)重組及克隆技術(shù)如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook描述的，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY(1989)以及T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist描述的，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)以及Ausubel，F(xiàn).M.等人描述的，Current Protocols in Molecular Biology，Greene PublishingAsSoc.and Wiley-Interscience(1987)。
本發(fā)明還涉及功能等同的DNA序列的應(yīng)用，其編碼天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶基因并基于DNA序列的總長度，與SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5顯示出40-100％的序列同源性。
本發(fā)明優(yōu)選涉及功能等同的DNA序列的應(yīng)用，該序列編碼天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶基因并基于DNA序列的總長度，與SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5顯示出60-100％的序列同源性。
本發(fā)明特別優(yōu)選涉及功能等同的DNA序列的應(yīng)用，其編碼天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶基因并基于DNA序列的總長度，與SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5顯示出80-100％的序列同源性。
編碼天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶基因的功能等同序列是那些雖然偏離了核苷酸序列，但仍保持著所期望功能的序列。功能等同物包括此處所述序列的天然存在的變體，還包括人工核苷酸序列，如那些通過化學(xué)合成的并已改進(jìn)到適應(yīng)了植物密碼子選擇的序列。
功能等同物還可理解為特別是編碼天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶并繼續(xù)顯示出所期望功能的原始分離序列的天然或人工突變體。突變包括一個或多個核苷酸殘基的替換，增加，缺失，交換或插入。這樣，本發(fā)明還延伸到例如修飾該核苷酸序列所得到的核苷酸序列。這種修飾的目的可以是例如進(jìn)一步界定其中所含編碼序列的位置或者其它目的如進(jìn)一步導(dǎo)入限制性酶切位點(diǎn)。
功能等同物還可以是那些相較于起始基因或基因片段功能減弱或增強(qiáng)了的各種變體。
另外，表達(dá)盒可應(yīng)用于細(xì)菌，藍(lán)細(xì)菌，酵母，絲狀真菌和藻類，以及真核細(xì)胞(如昆蟲細(xì)胞)的轉(zhuǎn)化，達(dá)到產(chǎn)生足夠數(shù)量的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶的目的。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及具有天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶活性的馬鈴薯或展葉劍葉蘚(Physcomitrella patens)蛋白或該蛋白的衍生物或部分在產(chǎn)生尋找除草劑活性成分的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中的應(yīng)用，該蛋白特征在于其氨基酸序列為SEQ ID NO2或SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
本發(fā)明還涉及具有天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶活性的植物蛋白在產(chǎn)生尋找除草劑活性成分的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中的應(yīng)用，該蛋白氨基酸序列與SEQ ID NO2或SEQ ID NO4或SEQ ID NO6的馬鈴薯或展葉劍葉蘚天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶具有20-100％的同一性。
本發(fā)明還優(yōu)選涉及具有天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶活性的植物蛋白在產(chǎn)生尋找除草劑活性成分的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中的應(yīng)用，該蛋白氨基酸序列與SEQ IDNO2或SEQ ID NO4或SEQ ID NO6的馬鈴薯或展葉劍葉蘚天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶具有50-100％的同一性。
特別優(yōu)選的是具有天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶活性的植物蛋白在產(chǎn)生尋找除草劑活性成分的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中的應(yīng)用，該蛋白氨基酸序列與SEQ ID NO2或SEQ ID NO4或SEQ ID NO6的馬鈴薯或展葉劍葉蘚天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶具有80-100％的同一性。
本發(fā)明還包括天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶的同功酶。這樣，SEQ ID NO3和SEQ ID NO5的展葉劍葉蘚基因編碼兩個ATCase同功酶(SEQ ID NO4和6)，其很可能在苔蘚的不同發(fā)育階段表達(dá)。
同功酶應(yīng)理解為同工形式的酶，這些酶具有相同或類似底物特異性以及作用特異性，但是具有不同的一級結(jié)構(gòu)。
編碼天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶的SEQ ID NOl，SEQ ID NO3或SEQ IDNO5基因序列在植物中的過量表達(dá)導(dǎo)致對天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶抑制劑的抗性增強(qiáng)。這樣產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物也屬于本發(fā)明的主題。
重組表達(dá)的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶基因的表達(dá)力可以測定，通過例如體外分枝-分生組織(shoot-meristem)繁殖或通過發(fā)芽檢驗(yàn)。而且，在類型和水平方面改變了的該天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶基因的表達(dá)，以及對于天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶抑制劑抗性的影響也可以使用測試植物在溫室實(shí)驗(yàn)中測定。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及轉(zhuǎn)基因植物，其是用含有SEQ ID NO1，SEQ ID NO3或SEQ ID NO5 DNA序列的表達(dá)盒所轉(zhuǎn)化的，該轉(zhuǎn)基因植物通過額外表達(dá)SEQ ID NO1，SEQ ID NO3或SEQ ID NO5 DNA序列得到了對于天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶抑制劑的耐受性，還涉及這種植物的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，組織，部分和繁殖材料。特別優(yōu)選的是轉(zhuǎn)基因作物例如大麥，小麥，黑麥，玉米，大豆，稻，棉花，甜菜，canola，向日葵，亞麻，大麻，馬鈴薯，煙草，西紅柿，菜籽油菜(oilseed rape)，苜蓿，萵苣和各種樹，堅(jiān)果和grapevine(葡萄)種以及豆科植物。
特別優(yōu)選的序列是那些能夠確保將非原生質(zhì)體，質(zhì)體，液泡，線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)作為靶標(biāo)的序列，或者在合適的操縱性序列缺乏時，能夠確保產(chǎn)物保留在形成的區(qū)域，胞液中的序列(Kermode，Crit.Rev.PlantSci.15，4(1996)，285-423)。
例如，植物表達(dá)盒可以導(dǎo)入到植物轉(zhuǎn)化載體pBinAR。
表達(dá)盒合適的啟動子原則上可以是任何能夠指導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的啟動子。優(yōu)選使用特別是植物啟動子或植物病毒來源的啟動子。特別優(yōu)選的是花耶菜病毒CaMV 35S啟動子(Franck等，Cell 21(1980)，285-294)。該啟動子含有不同的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)子識別序列，這些效應(yīng)子總體上引起的被導(dǎo)入基因的持久組成型表達(dá)(Benfey等，EMBO J.8(1989)，2195-2202)。
表達(dá)盒還可以包含化學(xué)可誘導(dǎo)的啟動子，其允許待指導(dǎo)的外源天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶基因在植物中某一特定時間點(diǎn)表達(dá)。這種文獻(xiàn)中描述的可用于此的啟動子是，例如PRPl啟動子(Ward等，Plant Mol.Biol.22(1993)，361-366)，水楊酸誘導(dǎo)啟動子(wo 95/19443)，苯磺酰胺誘導(dǎo)啟動子(EP 388186)，四環(huán)素誘導(dǎo)啟動子(Gatz等，Plant J.2(1992)，397-404)，脫落酸誘導(dǎo)啟動子(EP 0335528)或乙醇或環(huán)己酮誘導(dǎo)啟動子(WO 93/21334)。
特別優(yōu)選的啟動子更具體是那些能夠確保在組織或植物部分中表達(dá)的啟動子，嘌呤或其前體的生物合成在該組織或部分中進(jìn)行。不能不特別提到能夠確保葉特異性表達(dá)的啟動子。必須提及的啟動子是馬鈴薯胞質(zhì)的FBPase或馬鈴薯ST-LSI啟動子(Stockhaus等，EMBO J.8(1989)2445-245)。
借助于種子特異性啟動子，外源蛋白可以在轉(zhuǎn)基因煙草植物的種子中表達(dá)，其數(shù)量在種子的總可溶性蛋白中可達(dá)到0.67％(Fiedler和Conrad，Bio/Technology 10(1995)，1090-1094)。所以，本發(fā)明的表達(dá)盒可以包含例如種子特異性啟動子(優(yōu)選菜豆球蛋白啟動子，USP啟動子或LEB4啟動子)，LEB4信號肽，待表達(dá)的基因以及ER停滯信號。
編碼天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶的插入核苷酸序列可以合成或天然得到或是包含合成和天然DNA組份的混合物。通常，合成的核苷酸序列是用植物優(yōu)選的密碼子產(chǎn)生的。這些植物優(yōu)選的密碼子可以從最感興趣的植物物種中所表達(dá)的最高蛋白頻率的密碼子中檢測出來。當(dāng)制備表達(dá)盒時，可對各種DNA片段進(jìn)行操作，以得到這樣的核苷酸序列其能夠在正確的方向有利閱讀并裝備了正確的閱讀框架。接合體或接頭可被加入到該片段使DNA片段互相連接起來。
其它適合的DNA序列是人工DNA序列，只要能夠介導(dǎo)例如象以上所述的所期望的表達(dá)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶基因的屬性。這種人工DNA序列可通過例如向后翻譯(backtranslating)蛋白而鑒定，該蛋白具有天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶活性并通過分子模型方法構(gòu)建，或者可通過體外選擇鑒定。符合宿主植物特定密碼子選擇、通過向后翻譯多肽序列得到的編碼DNA序列是特別適合的。該特異性密碼子選擇可由本領(lǐng)域熟悉植物基因方法的技術(shù)人員通過計(jì)算機(jī)測定待轉(zhuǎn)化植物其它已知基因而鑒定。
其它合適的必須提及的同工核酸序列是那些編碼融合蛋白的序列，融合蛋白的一個組份是植物天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶多肽或其功能等同部分。融合蛋白的第二部分可以是例如，另一具有酶活性的多肽或抗原性多肽序列，借助于該序列可以檢測天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶的表達(dá)(例如myc-標(biāo)記或his-標(biāo)記)。但是，優(yōu)選調(diào)節(jié)蛋白序列如信號肽或轉(zhuǎn)運(yùn)多肽，其指導(dǎo)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶蛋白到達(dá)期望的作用位點(diǎn)。
啟動子和終止子序列可以有利地在轉(zhuǎn)錄方向上與含有一個或多個用于該序列插入的限制性位點(diǎn)的接頭或多接頭提供。通常，接頭具有1到10，多數(shù)情況下1到8，優(yōu)選2到6個限制性位點(diǎn)。通常，調(diào)節(jié)區(qū)域內(nèi)的接頭大小為小于100bp，通常小于60bp，但是至少要具有5bp。本發(fā)明的啟動子可以是宿主植物自身的，或者是同種異體的，或者外源的或異源的。本發(fā)明的表達(dá)盒包含，在5’-3’轉(zhuǎn)錄方向上，本發(fā)明的啟動子，任何序列和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域。各種終止區(qū)域可以如所希望的互相交換。
可以采用能提供合適的限制性切割位點(diǎn)或消除額外DNA或限制性切割位點(diǎn)的操作。在插入，缺失或替換如轉(zhuǎn)化和顛換適當(dāng)時可使用體外誘變，引物修復(fù)，限制或連接。用于連接的片段互補(bǔ)末端可以通過合適的操作提供，如限制，回切(chewing-back)或者填充突出端得到平頭末端。
優(yōu)選的多聚腺苷酸化信號是植物腺苷酸化信號，尤其是那些基本上相當(dāng)于根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA多聚腺苷酸化信號的腺苷酸化信號，特別是Ti質(zhì)粒pTiACH5的T-DNA(章魚堿合成酶)的基因3(Gielen等，EMBO J.3(1984)，835)的腺苷酸化信號，或同功物。
為用編碼天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶的DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，表達(dá)盒被并入，如插入，導(dǎo)入到重組載體中，該載體的DNA含有額外的功能調(diào)節(jié)信號，例如復(fù)制或整合所用的序列。合適的載體尤其在“Method in PlantMolecular Biology and Biotechnology”中描述(CRC Press，Chapter6/7，71-119)。
外源基因轉(zhuǎn)移到植物的染色體組中稱為轉(zhuǎn)化。其利用上述方法轉(zhuǎn)化以及從植物組織或植物細(xì)胞再生植物，得到暫時或穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化。合適的方法是通過聚乙二醇誘導(dǎo)的DNA吸入原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，用基因槍生物轟擊，電穿孔，在含有DNA的溶液中孵育干燥胚胎，顯微注射以及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。上述方法由如B.Jenes等人描述，Techniques for GeneTransfer，Transgenic Plants，1卷，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu編輯，Academic Press(1993)，128-143以及，Potrykus描述，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)，205-225。待表達(dá)的構(gòu)建體優(yōu)選克隆至適于根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的載體中，如pBinl9(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)，8711)。
用表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌可以通過已知的手段，例如通過在農(nóng)桿菌溶液中水浴受傷的葉或葉切片并接下來在合適的培養(yǎng)基中使其生長而用于進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化，特別是對作物的轉(zhuǎn)化如谷類，玉米，大豆，稻，棉花，甜菜，canola，向日葵，亞麻，大麻，馬鈴薯，煙草，西紅柿，菜籽油菜，苜蓿，萵苣和各種樹，堅(jiān)果以及grapevine物種，還有豆科植物。
嘧啶的生物合成位點(diǎn)通常在葉片組織，這樣天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶基因的葉特異性表達(dá)就有很大意義。但是，很明顯嘧啶的生物合成不必要限制在葉片組織，還可以以葉特異性方式在植物其余的所有其它部分發(fā)生，例如在含油的種子中。
另外，外源天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶基因的組成型表達(dá)是有利的。但是另一方面，可誘導(dǎo)的表達(dá)也可能是所期望的。
使用上述的重組和克隆技術(shù)，表達(dá)盒可被克隆到允許其擴(kuò)增的合適載體如在大腸桿菌中。合適的克隆載體的實(shí)例是pBR332，pUC系列，M13系列和pACYC184。特別合適的是二元載體，其能夠在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中復(fù)制。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明的表達(dá)盒在轉(zhuǎn)化植物，植物細(xì)胞，植物組織或植物部分中的應(yīng)用。優(yōu)選的應(yīng)用目的是增加植物中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶含量。
依賴于啟動子的選擇，表達(dá)可以在葉片，種子或植物的其它部分特異性地進(jìn)行。這種轉(zhuǎn)基因植物，其繁殖材料和其植物細(xì)胞，植物組織或植物部分也屬于本發(fā)明的主題。
本發(fā)明可以通過下述實(shí)施例來說明，但實(shí)施例不限制本發(fā)明的范圍。
應(yīng)用實(shí)施例基于下列遺傳操作方法常規(guī)克隆方法克隆方法如，限制性酶切，DNA分離，瓊脂糖凝膠電泳，DNA片段的純化，硝酸纖維素膜和尼龍膜上核酸的轉(zhuǎn)移，大腸桿菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，細(xì)菌培養(yǎng)和重組DNA序列分析，按Sambrook等人描述的進(jìn)行，Cold SpringHabor Laboratory Press(1989)；ISBN 0-87969-309-6。用H_fgen和Willmitzer的方法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌(Nucl.Acid Res.16(1988)，9877)。在YEB培養(yǎng)基中培養(yǎng)農(nóng)桿菌(Veryliet等，Gen.Virol.26(1975)，33)。
重組DNA的序列分析使用ABI鐳射熒光DNA測序儀對重組DNA分子測序，采用Sanger的方法(Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74(1977)，5463-5467)。多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)得到的片段被測序并檢驗(yàn)以避免在要表達(dá)的構(gòu)建體中聚合酶錯誤。
來自植物組織的總RNA分析來自植物組織的總RNA按Logemann等人描述的進(jìn)行分離，Anal.Biochem.163(1987)，21。分析時，每20mg RNA被分離到含有甲醛的1.5％強(qiáng)度瓊脂糖凝膠中，并轉(zhuǎn)移到Drualon UV膜(Stratagene)上。為檢測特異性轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，根據(jù)操作指導(dǎo)(DIG RNA Labeling Kit SP6/T7，RocheDiagnostics)制備地高辛配基標(biāo)記的鏈特異性探針，并用于雜交(DIGEasyHyb，Roche Diagnostics)。然后，用清洗緩沖液(2×SSC，0.1％SDS)在60°C對膜進(jìn)行3次20分鐘的清洗。使用Roche Diagnostics DIG檢測系統(tǒng)，使用CDP-Star作為底物利用發(fā)光和暴露在HyperfilmECL(Amersham)下進(jìn)行檢測。
Western印記分析使用研棒和研缽，葉片樣品繼續(xù)在樣品緩沖液中以1∶10的比率進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sambrook等，1989，Cold Spring HaborLaboratory PressISBN 0-87969-309-6)并在95℃變性10分鐘。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離出相同數(shù)量的提取物并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫下，5％強(qiáng)度的阻斷溶液(Blotto，BioRad)中孵育該膜1小時。然后進(jìn)行下述孵育抗體孵育室溫，2.5％強(qiáng)度阻斷液中1∶2000稀釋度的抗血清1小時。
清洗TBS(20mM Tris HCl和500mM NaCl pH7.5)簡要1次，15分鐘TBST(帶有0.1％(v/v)Tween 20)TBS一次，15分鐘TBS一次。
抗體孵育偶聯(lián)堿性磷酸酶的抗-兔IgG(BioRad)室溫下在1∶2000稀釋度2.5％強(qiáng)度阻斷液中1小時。
清洗TBS(20mM Tris HCl和500mM NaCl pH7.5)1次15分鐘。
檢測與BCIP(0.167mg/ml)和NBT(0.333mg/ml)在100mM Tris-HCl，pH9.5；100mM NaCl；5mM MgCl2中孵育。
除非特別說明，所用的化合物來自分析純度的Fluka(Neu-ULm)，Merck(Darmsruhe)，Serva(Heidelberg)和Sigma(Deisenhofen)。溶液用來自Milli-Q水純化系統(tǒng)(Millipore，Eschborn)純化的，無熱原水，下述稱H2O。限制性內(nèi)切核酸酶，DNA-修飾酶和分子生物試劑盒是獲自AGS(Heidelberg)，Amersham(Braunschweig)，Biometra(G_ttingen)，Roche(Mannheim)，Genomed(Bad Oeynnhausen)，New England Biolabs(Schwalbach/Taunus)，Novagen(Madison，Wisconsin，USA)，Perkin-Elmer(Weiterstadt)，Pharmacia(Freiburg)，Qiagen(Hilden)和Stratagene(Heidelberg)。除非特別說明，這些物質(zhì)的使用都按使用說明。
轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在M9最小培養(yǎng)基上平板接種(Sambrook等，1989)，該培養(yǎng)基還額外含有蛋氨酸(20mg/l)，硫胺素(100mg/l)，氨芐青霉素(100mg/l)和IPTG(2.5mM)。分離并測序互補(bǔ)克隆的質(zhì)粒(稱為pRBP3b)。Cdna的1344個核苷酸編碼，412個氨基酸的蛋白(SEQ ID NO1和2)。與豌豆ATCase(Genbank Accession NoM96981)進(jìn)行氨基酸序列對比，發(fā)現(xiàn)RBP3b構(gòu)成了全長cDNA。36位氨基酸很可能構(gòu)成起始蛋氨酸。衍生的蛋白與鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)ATCase有83.9％的相似度。與大腸桿菌和人ATCase的相似度分別為63.0％和65.6％。核酸序列顯示與鼠耳芥基因具有75.4％的同一性，與大腸桿菌基因具有54.4％同一性，與人cDNA具有66.4％的同一性。
通過用Asp718和BamHI切割來制備含有RBP3b cDNA的1494bp RBP3bcDNA片段并連接入載體BinAR(H_fgen和Willmitzer，Plant Science66(1990)，221-230)，該載體也以同樣的方式切割。所獲的構(gòu)建體BinRBP3b相對于花耶菜病毒35S啟動子以反義方向含有RBP3b cDNA(

圖1)。
從帶有20g/l蔗糖和卡那霉素及claforan的MS培養(yǎng)基中獲得再生的芽，一旦它們生根就轉(zhuǎn)移到土壤中并當(dāng)其在環(huán)境控制條件下的室內(nèi)，16小時光/8小時暗的光周期下，相對空氣濕度為50％條件下，成長2周后，檢測外源基因表達(dá)以及改變的代謝量和表型生長特性。改變的核苷酸含量可以檢測，例如通過Stitt等人的方法，F(xiàn)EBS Letters，145(1982)，217-222。
或者，可以在合適的原核(如大腸桿菌)或真核(如酵母，桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞)表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生植物ATCase(優(yōu)選馬鈴薯ATCase)。為此，必須產(chǎn)生含有ATCase cDNA的表達(dá)載體。修飾長度的被編碼的ATCaseN-末端可能需要以排除N-末端存在的質(zhì)體轉(zhuǎn)移多肽對表達(dá)蛋白活性的任何負(fù)面影響。適于在大腸桿菌中表達(dá)的合適的表達(dá)載體包括例如，pQE-(Qiagen)，pET-(Novagen)，pTrc99a，pKK233-3(Pharmacia)，pBluescript II(Stratagene)。為產(chǎn)生在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的重組桿狀病毒，可以使用例如，Bac-toBac系統(tǒng)(Gibco BRL)或者M(jìn)axBac系統(tǒng)(Invitrogen)。來自pYES系列的載體可適于酵母的表達(dá)。
當(dāng)細(xì)胞在合適的緩沖液中被破裂之后，并且，如果適合的話，在經(jīng)過了進(jìn)一步的純化步驟，例如通過硫酸胺沉淀或?qū)游龇椒ㄖ?，ATCase活性，例如形成的氨甲?；於彼?，可以根據(jù)所述方法類似測定(Prescott & Jones，Anal.Biochem32(1969)，406-419；Else & Herye，Anal.Biochem186(1990)，219-221)。為此，酶反應(yīng)的等分試樣與含有安替比林和2，3-丁二酮單肟的在硫酸中的染料溶液一起在暗處40-60℃至少孵育4小時。形成的染料可以在468nm光度計(jì)定量。
或者，可以監(jiān)測[14C]氨基甲酰磷酸向[14C]氨基甲酰天冬氨酸的轉(zhuǎn)化，后者對于酸是穩(wěn)定的(Lovatt和Cheng，Plant Physiology75(1984)，511-515)。該方法尤其因?yàn)樗撵`敏度而揚(yáng)名。
特別適于高處理量ATCase活性測定的方法是Wedler等人描述的，Analytical Biochemistry 218(1994)，449-453，通過與嘌呤核苷磷酸化酶反應(yīng)檢測獲得的無機(jī)磷酸。
應(yīng)用該檢測方法至微量滴定板規(guī)模上允許高處理量研究有除草劑活性的ATCase活性抑制劑。
(B)含有在載體pBinAR中反義方向的編碼馬鈴薯ATCase的cDNA(RBP3b)以及花耶菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子和根癌農(nóng)桿菌章魚肉堿合成酶(OCS)終止子的植物轉(zhuǎn)化載體BinRBP3b示意圖。顯示出了限制性內(nèi)切酶的單一識別位點(diǎn)。
圖2Western印跡分析法檢測葉片組織中馬鈴薯ATCase。顯示出分子量標(biāo)記(M)和轉(zhuǎn)基因植物系8，17，19，44，51，53和60的提取物與野生型(WT)比較在用ATCase抗血清雜交中的應(yīng)用。
圖3植物品系62，19，53，8和51與野生型(W)進(jìn)行對比其生長阻滯(總鮮重克)和ATCase蛋白量減少之間的相關(guān)性。
序列表<110>BASF Aktiengesellschaft<120>天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶作為除草劑的靶標(biāo)<130>BASF-OZ-0050-51219-PCT<140><141><160>6<170>patentIn Ver.2.1<210>1<211>1344<212>DNA<213>馬鈴薯(Solanum tuberosum)<220><221>CDS<222>(106)..(1236)<400>1ctcgagcagc tccaatctcc gacagaacca aacgtcatcg gaaaactctt gacgatctcc 60gccacactgc cgccgttgtt cctctctccg gtgagtgatt tcaat atg act att tcc 117Met Thr Ile Ser1gca aca ttt tct tcc cat gga aaa ata ctc atg tca cct ctt aga aag 165Ala Thr Phe Ser Ser His Gly Lys Ile Leu Met Ser Pro Leu Arg Lys5 10 15 20agt gaa tgg gca aat caa cct gtg ctc tgt aaa tct gtt gaa ttg ttt 213Ser Glu Trp Ala Asn Gln Pro Val Leu Cys Lys Ser Val Glu Leu Phe25 30 35aaa aat gga cga aat caa tat cgt atg tca aca aat agc aac aaa ttc 261Lys Asn Gly Arg Asn Gln Tyr Arg Met Ser Thr Asn Ser Asn Lys Phe40 45 50caa tgc cga gca ctg gag atc gaa aat aaa tct tca act aag ttt cac 309Gln Cys Arg Ala Leu Glu Ile Glu Asn Lys Ser Ser Thr Lys Phe His55 60 65ctt gat gat gta att gaa tct caa caa ttt gat aga gaa act ctt agt 357Leu Asp 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權(quán)利要求
1.含有植物天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶編碼區(qū)的DNA序列SEQ ID NO1，SEQID NO3或SEQ ID NO5在產(chǎn)生用于鑒定植物天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶抑制劑的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中的應(yīng)用。
2.權(quán)利要求1的DNA序列的應(yīng)用，該序列能夠與SEQ ID NO1，SEQID NO3或SEQ ID NO5或其部分或這些序列通過插入，缺失或替換而衍生的衍生物雜交并且編碼具有植物天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶生物活性的蛋白。
3.權(quán)利要求1或2的DNA序列的應(yīng)用，用于導(dǎo)入原核或真核細(xì)胞，該序列可選擇地與確保在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯的控制元件連接并引起可翻譯的mRNA的表達(dá)，導(dǎo)致植物天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶合成。
4.具有天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶活性的蛋白在產(chǎn)生用于鑒定能夠抑制植物天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶的物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求4的具有天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶活性的蛋白的應(yīng)用，其特征在于該蛋白含有SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6所示的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求5的具有天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶活性的蛋白的應(yīng)用，該蛋白含有SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6中的至少100個氨基酸的氨基酸子序列。
7.一種尋找可抑制植物天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶活性的物質(zhì)的方法，其特征在于，第一步，使用如權(quán)利要求1，2或3中所述的DNA序列產(chǎn)生天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶，并且，第二步，在被測物質(zhì)的存在下測定該植物天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶的活性。
8.權(quán)利要求7的方法，其特征在于該植物天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶在高處理量篩選(HTS)中測定。
9.一種鑒定可抑制植物天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶活性的除草劑活性物質(zhì)的方法，該方法包括a)產(chǎn)生這樣的轉(zhuǎn)基因植物，植物組織或植物細(xì)胞，其含有額外的編碼具有天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶活性的酶的DNA序列并且能夠過量表達(dá)具有酶活性的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶；b)將物質(zhì)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物，植物細(xì)胞，植物組織或植物部分以及未轉(zhuǎn)化的植物，植物細(xì)胞，植物組織或植物部分；c)應(yīng)用該化學(xué)物質(zhì)之后，測定轉(zhuǎn)基因的和未轉(zhuǎn)化的植物，植物細(xì)胞，植物組織或植物部分的生長或存活力；以及d)比較應(yīng)用該化學(xué)物質(zhì)之后轉(zhuǎn)基因和未轉(zhuǎn)化的植物，植物細(xì)胞，植物組織或植物部分的生長或存活力；如果未轉(zhuǎn)化的植物，植物細(xì)胞，植物組織或植物部分的生長或存活力被抑制而轉(zhuǎn)基因的植物，植物細(xì)胞，植物組織或植物部分未被嚴(yán)重抑制，則證實(shí)b)的物質(zhì)具有除草劑活性，能夠抑制植物天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶活性。
10.一種用于鑒定植物天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶抑制劑的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，該系統(tǒng)基于權(quán)利要求1，2或3中所述的DNA序列SEQ ID NO1，SEQ ID NO3或SEQ ID NO5或其部分或衍生物的表達(dá)。
11.權(quán)利要求10的用于鑒定植物天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶抑制劑的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，其包括將酶與待測的試驗(yàn)物質(zhì)一起孵育并在合適的反應(yīng)時間后，測定該酶的酶活性，與未抑制的酶的活性相比較。
12.植物天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶抑制劑。
13.植物天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶抑制劑，其通過權(quán)利要求9，10或11所述的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)被鑒定。
14.權(quán)利要求12或13中任一項(xiàng)所述的被鑒定出的抑制劑，用作除草劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物來源的編碼具有天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶(E.C.2.1.3.2)活性的多肽的DNA序列在產(chǎn)生用于尋找天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶抑制劑的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中的應(yīng)用。本發(fā)明借助于反義技術(shù)首次顯示，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶構(gòu)成了除草劑的靶標(biāo)。
文檔編號C12Q1/48GK1406281SQ01805850
公開日2003年3月26日 申請日期2001年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月2日
發(fā)明者T·赫哈德, J·勒施爾, M·斯逖特尼格爾, R·茲倫尼爾, T·M·里特爾 申請人:巴斯福股份公司