本發(fā)明屬于生物發(fā)酵領域，具體涉及一種生產(chǎn)埃博霉素B的方法。

背景技術：

埃博霉素(epothilones)是1993年在黏細菌纖維堆囊菌Sorangium cellulosum的次級代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的，其結構為大環(huán)內(nèi)酯類化合物?？鼓[瘤作用機理與紫杉醇相似，具有抑制微管解聚的作用，相比之下，埃博霉素的水溶性更好，并且對多重耐藥腫瘤細胞和耐紫杉醇的腫瘤細胞都表現(xiàn)出強大的抗癌活性，也沒有紫杉醇臨床應用中的粒細胞減少癥、外周神經(jīng)病變、脫發(fā)、過敏等嚴重副作用。因此，開發(fā)埃博霉素類化合物具有臨床價值和社會意義。2007年，埃博霉素類B的衍生物伊沙匹隆在美國批準上市，激發(fā)了人們對埃博霉素類化合物研究的熱潮，現(xiàn)已有六種埃博霉素類化合物進入了臨床研究階段。

目前，埃博霉素全合成步驟大都在20步以上，無法滿足生產(chǎn)規(guī)模；而大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)又存在諸多困難：埃博霉素的產(chǎn)生菌纖維堆囊菌的代時較長，生長速度非常緩慢，營養(yǎng)攝取率很低，氧的消耗比較少，發(fā)酵周期長，發(fā)酵時細胞濃度較低。因此，如何使纖維堆囊菌迅速生長，并提高埃博霉素的產(chǎn)量，減少主要雜質的含量，降低生產(chǎn)成本成為目前埃博霉素B研究的一個重要課題。

現(xiàn)有文獻，有報道通過優(yōu)化菌株提高埃博霉素B產(chǎn)量的方法，但對于纖維堆囊菌ATCC25532的發(fā)酵培養(yǎng)方法報道不多。經(jīng)研究，中國專利CN103937851A、CN103045675A、CN103772407A和CN103788105A發(fā)酵效價均低于52mg/L?，F(xiàn)有技術發(fā)酵方法仍然無法滿足大生產(chǎn)的需求。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種埃博霉素B的發(fā)酵生產(chǎn)工藝，克服了埃博霉素B現(xiàn)有生產(chǎn)技術的不足，加速了菌體生長，提高了埃博霉素B的產(chǎn)量，減少了主要雜質埃博霉素A的含量，利于后期純化，降低了生產(chǎn)成本。

本發(fā)明提供的發(fā)酵生產(chǎn)工藝具體包括種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)方法。所述的埃博霉素B生產(chǎn)菌為纖維堆囊菌ATCC25532。

埃博霉素B的培養(yǎng)方法具體包括以下步驟：

1)固體平板培養(yǎng)：菌種涂布于固體平板培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)6-7天；

2)搖瓶擴培：平板接種于搖瓶中，30℃，200rpm培養(yǎng)4-5天；

3)種子罐培養(yǎng)：將搖瓶接種于種子罐中，30℃培養(yǎng)，轉速為200rpm，通氣量為0.5vvm，罐壓為0.04kg/cm2，并流加酸堿調(diào)節(jié)劑使pH維持在7.2，當溶氧下降緩慢時，進行移種；

4)發(fā)酵罐培養(yǎng)：利用壓差法將種子液接入到發(fā)酵罐中，接種量為10％的體積比，30℃，200rpm培養(yǎng)，空氣流量為0.5vvm，維持在50％附近；發(fā)酵過程中加入酸堿調(diào)節(jié)劑維持pH值在7.2，在發(fā)酵48小時加入大孔樹脂XAD-16N，發(fā)酵96小時開始測定效價。

優(yōu)選地，所述步驟3)種子罐酸堿調(diào)節(jié)劑為氨水。

優(yōu)選地，所述步驟4)發(fā)酵罐酸堿調(diào)節(jié)劑為氨水和丙酸。

優(yōu)選地，所述步驟3)種子罐和步驟4)發(fā)酵罐酸堿調(diào)節(jié)劑的配置濃度為20％-30％，121℃滅菌20min使用。

優(yōu)選地，所述步驟4)發(fā)酵罐采用流加方式進行pH自動控制，前期補入氨水，后期補入丙酸。

優(yōu)選地，所述步驟1)固體平板培養(yǎng)的培養(yǎng)基成份為，葡萄糖0.1％、蛋白胨0.2％、硫酸鎂0.1％、氯化鈣0.2％、磷酸氫二鉀0.2％、酵母提取物0.3％。調(diào)節(jié)pH至7.2。

優(yōu)選地，所述步驟2)搖瓶擴培和步驟3)種子罐培養(yǎng)的培養(yǎng)基組份為葡萄糖0.1％、可溶性淀粉2％、硫酸鎂0.1％、氯化鈣0.2％、磷酸氫二鉀0.2％、酵母提取物0.3％。調(diào)節(jié)pH至7.2。

優(yōu)選地，所述步驟4)發(fā)酵罐培養(yǎng)的培養(yǎng)基組份為可溶性淀粉0.3％、硫酸鎂0.2％、氯化鈣0.3％、磷酸氫二鉀0.2％、酵母提取物0.3％，花生粉0.5％。

進一步優(yōu)選的，纖維堆囊菌的培養(yǎng)方法為：

1)固體平板培養(yǎng)：其固體培養(yǎng)基成份為，葡萄糖0.1％、蛋白胨0.2％、硫酸鎂0.1％、氯化鈣0.2％、磷酸氫二鉀0.2％、酵母提取物0.3％。調(diào)節(jié)pH至7.2，于121℃滅菌30分鐘，菌種涂布于固體平板培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)6-7天。

2)搖瓶擴培：平板接種于搖瓶中，搖瓶培養(yǎng)基的組份為葡萄糖0.1％、可溶性淀粉2％、硫酸鎂0.1％、氯化鈣0.2％、磷酸氫二鉀0.2％、酵母提取物0.3％。調(diào)節(jié)pH至7.2，于121℃滅菌30分鐘，30℃，200rpm培養(yǎng)4-5天。

3)種子培養(yǎng)：將搖瓶接種于種子罐中，培養(yǎng)基與搖瓶培養(yǎng)基相同，121℃蒸汽滅菌30分鐘，滅菌后接種，培養(yǎng)溫度為30℃，轉速為200rpm，通氣量為0.5vvm，罐壓為0.04kg/cm2，并流加氨水使pH維持在7.2，當溶氧下降變緩時，進行移種。

4)發(fā)酵培養(yǎng)：發(fā)酵培養(yǎng)基組份為可溶性淀粉0.3％、硫酸鎂0.2％、氯化鈣0.3％、磷酸氫二鉀0.2％、酵母提取物0.3％，花生粉0.5％。121℃蒸汽滅菌30分鐘，滅菌后壓差接種，培養(yǎng)溫度為30℃，轉速為200rpm，通氣量為0.5vvm，罐壓為0.04kg/cm2，流加氨水或丙酸使pH維持在7.2。為了提高埃博霉素的產(chǎn)量，在培養(yǎng)48小時后，加入1.2％大孔樹脂XAD-16N，這樣既讓菌體在發(fā)酵前期得到了充分生長，又能夠避免發(fā)酵后期的產(chǎn)物抑制。發(fā)酵96小時開始測定效價，直至效價不再明顯增加時結束發(fā)酵。

采用本發(fā)明所述的發(fā)酵方法，整個發(fā)酵過程操作簡單，發(fā)酵產(chǎn)物埃博霉素B的含量高，通用性強，易推廣，工業(yè)化成本較低。

本發(fā)明的方法與現(xiàn)有技術相比有如下優(yōu)點：

本發(fā)明的方法中在種子培養(yǎng)過程中通過流加氨水調(diào)節(jié)pH，加速了菌體生長，為發(fā)酵提供了高質量的種子。

本發(fā)明的方法中在發(fā)酵培養(yǎng)過程初期通過流加氨水，調(diào)節(jié)pH的同時，也為纖維堆囊菌補充了氮源，加速了菌體的生長，增加了發(fā)酵前期的菌體量，為提高產(chǎn)量奠定了物質基礎。

本發(fā)明的方法中在發(fā)酵培養(yǎng)中后期通過流加丙酸替代傳統(tǒng)工藝的硫酸和丙酸鈉，簡化了發(fā)酵生產(chǎn)過程中的補料控制，既調(diào)節(jié)了pH，也為埃博霉素B提供了前體，增加了產(chǎn)物中埃博霉素B與埃博霉素A的比率，提高產(chǎn)量的同時降低了主要雜質的含量，利于后續(xù)提取純化，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

具體實施方式

以下通過具體實施例對本發(fā)明予以進一步詳細說明，但本發(fā)明不限于以下實施例。

實施例1.固體平板培養(yǎng)

其固體培養(yǎng)基成份為，葡萄糖0.1％、蛋白胨0.2％、硫酸鎂0.1％、氯化鈣0.2％、磷酸氫二鉀0.2％、酵母提取物0.3％。調(diào)節(jié)pH至7.2，于121℃滅菌30分鐘，涂布于固體平板培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)6-7天。

實施例2.纖維堆囊菌的種子培養(yǎng)

①搖瓶擴培

將長勢良好的平板接種于搖瓶中，搖瓶培養(yǎng)基的組份為葡萄糖0.1％、可溶性淀粉2％、硫酸鎂0.1％、氯化鈣0.2％、磷酸氫二鉀0.2％、酵母提取物0.3％。調(diào)節(jié)pH至7.2，于121℃滅菌30分鐘，30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)4天。

②種子培養(yǎng)

將長勢良好的搖瓶接種于種子罐中，培養(yǎng)基與搖瓶培養(yǎng)基相同，121℃蒸汽滅菌30分鐘，滅菌后接種，培養(yǎng)溫度為30℃，轉速為200rpm，通氣量為0.3vvm，罐壓為0.04kg/cm2，并流加1M氫氧化鈉使pH維持在7.2，當溶氧下降緩慢時，進行移種。測定菌體量為8％。

實施例3.埃博霉素B的種子培養(yǎng)

將長勢良好的搖瓶接種于種子罐中，培養(yǎng)基與搖瓶培養(yǎng)基相同，121℃蒸汽滅菌30分鐘，滅菌后接種，培養(yǎng)溫度為30℃，轉速為200rpm，通氣量為0.3vvm，罐壓為0.04kg/cm2，并流加20％氨水使pH維持在7.2，當溶氧下降緩慢時，進行移種。測定菌體量為13％。

實施例4.埃博霉素B的發(fā)酵培養(yǎng)a

①發(fā)酵前準備：將35L發(fā)酵培養(yǎng)基加到50L發(fā)酵罐中，121℃蒸汽滅菌30分鐘，降溫至30℃待用。

②發(fā)酵：利用壓差法將實施例3中的種子液接入到發(fā)酵罐中，接種量為10％的體積比，30℃，200rpm培養(yǎng)，調(diào)節(jié)空氣流量為0.5vvm，并更改轉速和空氣流量使溶氧維持在50％附近。用1M氫氧化鈉維持pH在7.2，在發(fā)酵48小時加入大孔樹脂XAD-16N，80-100小時pH開始上升，改用1M硫酸調(diào)節(jié)pH。發(fā)酵96小時開始測定效價，直至效價不再明顯增加時結束發(fā)酵。

所述的發(fā)酵培養(yǎng)基成份為可溶性淀粉0.3％、硫酸鎂0.2％、氯化鈣0.3％、磷酸氫二鉀0.2％、酵母提取物0.3％，花生粉0.5％。

發(fā)酵結果：發(fā)酵結束后，用甲醇浸泡樹脂提取埃博霉素B，測得效價為26.1mg/L，埃博霉素A效價為72.5mg/L。

實施例5.埃博霉素B的發(fā)酵培養(yǎng)b

③發(fā)酵前準備：將35L發(fā)酵培養(yǎng)基加到50L發(fā)酵罐中，121℃蒸汽滅菌30分鐘，降溫至30℃待用。

④發(fā)酵：利用壓差法將實施例3中的種子液接入到發(fā)酵罐中，接種量為10％的體積比，30℃，200rpm培養(yǎng)，調(diào)節(jié)空氣流量為0.5vvm，并更改轉速和空氣流量使溶氧維持在50％附近。用1M氫氧化鈉維持pH在7.2，在發(fā)酵48小時加入大孔樹脂XAD-16N，80-100小時pH開始上升，改用1M硫酸調(diào)節(jié)pH，并流加3.5％的丙酸鈉，補速為10ml/h。發(fā)酵96小時開始測定效價，直至效價不再明顯增加時結束發(fā)酵。

所述的發(fā)酵培養(yǎng)基成份為可溶性淀粉0.3％、硫酸鎂0.2％、氯化鈣0.3％、磷酸氫二鉀0.2％、酵母提取物0.3％，花生粉0.5％。

發(fā)酵結果：發(fā)酵結束后，用甲醇浸泡樹脂提取埃博霉素B，測得效價為55.2mg/L，埃博霉素A效價為43.4mg/L。

實施例6.埃博霉素B的發(fā)酵培養(yǎng)c

①發(fā)酵前準備：將35L發(fā)酵培養(yǎng)基加到50L發(fā)酵罐中，121℃蒸汽滅菌30分鐘，降溫至30℃待用。

②發(fā)酵：利用壓差法將實施例3中的種子液接入到發(fā)酵罐中，接種量為10％的體積比，30℃，200rpm培養(yǎng)，調(diào)節(jié)空氣流量為0.5vvm，并更改轉速和空氣流量使溶氧維持在50％附近。用20％氨水調(diào)節(jié)維持pH在7.2，在發(fā)酵48小時加入大孔樹脂XAD-16N，80-100小時pH開始上升，改用20％丙酸調(diào)節(jié)pH，待pH再次下降時繼續(xù)用20％氨水維持pH。發(fā)酵96小時開始測定效價，直至效價不再明顯增加時結束發(fā)酵。

所述的發(fā)酵培養(yǎng)基成份為可溶性淀粉0.3％、硫酸鎂0.2％、氯化鈣0.3％、磷酸氫二鉀0.2％、酵母提取物0.3％，花生粉0.5％。

發(fā)酵結果：發(fā)酵結束后，用甲醇浸泡樹脂提取埃博霉素B，測得效價為86.3mg/L，埃博霉素A效價為35.6mg/L。