本發(fā)明涉及吡唑化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。本發(fā)明化合物是甲硫氨酸氨基肽酶2(metap2)和二肽基肽酶-4(dpp-4)的抑制劑。

metap2是裂解從核糖體出現(xiàn)的新生肽的起始子甲硫氨酸的金屬蛋白酶。wo2010/065879報道了用于肥胖治療的小分子metap2抑制劑。

dpp-4抑制劑是一種用于改善2型糖尿病患者血糖控制的已經(jīng)確立的藥物類別。需要具有metap2和dpp-4雙重抑制活性的化合物。

本發(fā)明提供了具有metap2和dpp-4雙重抑制作用的新型化合物。這些雙重抑制劑化合物可用于治療metap2和dpp-4介導(dǎo)的病癥。

本發(fā)明提供了式i的化合物

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

在本發(fā)明的一個實施方案中，化合物為

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

在本發(fā)明的一個實施方案中，化合物是(3r,4s)-1-[5-[[3-(4,4-二氟環(huán)己烯-1-基)-1h-吡唑-4-基]氧基]嘧啶-2-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)吡咯烷-3-胺。

本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含式i化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，以及選自藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和賦形劑中的至少一種。

本發(fā)明提供了在有需要的哺乳動物中治療ii型糖尿病的方法，其包括向所述哺乳動物施用有效量的式i化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。本發(fā)明提供了用于在有需要的哺乳動物中治療肥胖的方法，其包括向哺乳動物施用有效量的式i化合物。在另一個實施方案中，提供了用于治療法的式i化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。此外，提供了用于制備藥物的式i化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。

本發(fā)明的化合物可以作為藥學(xué)上可接受的鹽提供?！八帉W(xué)上可接受的鹽”是指被認(rèn)為是臨床和/或獸醫(yī)用途可接受的本發(fā)明化合物的鹽。藥學(xué)上可接受的鹽和制備它們的常用方法是本領(lǐng)域公知的。參見例如p.stahl等人，handbookofpharmaceuticalsalts：properties,selectionanduse(vcha/wiley-vch,2002)；s.m.berge等人，“pharmaceuticalsalts”，journalofpharmaceuticalsciences，第66卷，第1期，1977年1月。

另外，以下制備例中描述的某些中間體可含有一個或多個氮保護基?？勺儽Ｗo基在每次出現(xiàn)時可以相同或不同，這取決于具體的反應(yīng)條件和要進行的特定轉(zhuǎn)化。保護和脫保護條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并且在文獻中有描述(參見例如“greene'sprotectivegroupsinorganicsynthesis”第四版，petergmwuts和theodoraw.greene，johnwileyandsons,inc2007)。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以通過諸如選擇性結(jié)晶技術(shù)或手性色譜法的方法，在本發(fā)明化合物的合成中的任何方便的點，分離或拆分單個的異構(gòu)體、對映異構(gòu)體和非對映異構(gòu)體(參見例如j.jacques等人，“enantiomers，racematesandresolutions”，johnwileyandsons,inc.，1981和e.l.eliel和s.h.wilen的“stereochemistryoforganiccompounds”，wiley-interscience，1994)。

本發(fā)明的化合物或其鹽可通過本領(lǐng)域已知的多種方法制備，其中一些在下面的制備例和實施例中說明。所描述的每種途徑的具體合成步驟可以以不同的方式組合，或與來自不同流程的步驟相結(jié)合，以制備本發(fā)明的化合物或其鹽。以下流程中的每個步驟的產(chǎn)物可以通過本領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法回收，包括萃取、蒸發(fā)、沉淀、色譜、過濾、研磨和結(jié)晶。在下面的流程中，除非另有說明，所有取代基如前所定義。試劑和原料是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易獲得的。其他可以通過有機和雜環(huán)化學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備，其類似于已知的結(jié)構(gòu)相似化合物的合成以及下文包括任何新穎方法的制備例和實施例中描述的方法。

本文使用的縮寫根據(jù)aldrichimicaacta，第17卷，第1期，1984定義。其他縮寫定義如下：“amc”是指7-氨基-4-甲基香豆素氫溴酸鹽；“bsa”是指牛血清白蛋白；“dio”是指飲食誘導(dǎo)的肥胖；“edta”是指乙二胺四乙酸；“hec”是指羥乙基纖維素；“hepes”是指4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸；“hfd”是指高脂飲食；“hoac”是指乙酸；“ic50”是指產(chǎn)生活性劑可能的最大抑制反應(yīng)的50％的該活性劑的濃度；“meoh”是指甲醇；“thf”是指四氫呋喃，“tris”是指三(羥甲基)氨基甲烷。

制備例1

2-(2-氯嘧啶-5-基)氧基乙腈

向溴乙腈(2.94ml，42.18mmol)、2-氯嘧啶-5-醇(5g，38.30mmol)在ch3cn(100ml)中的混合物中加入碳酸鉀(7.94g，57.45mmol)。將反應(yīng)混合物加熱至60℃達2小時。冷卻至室溫后，過濾固體，并減壓濃縮濾液。將殘余物經(jīng)硅膠快速色譜純化，用100％乙醚至1/1的乙醚/乙酸乙酯梯度洗脫，得到標(biāo)題化合物(6g，35.38mmol，92.37％)，為白色固體。質(zhì)譜(m/z)：170(m+h)。

制備例2

2-(2-氯嘧啶-5-基)氧基-3-氧代-丙腈

在0℃下向2-(2-氯嘧啶-5-基)氧基乙腈(6.00g，35.4mmol)和甲酸乙酯(26.2g，354mmol)在1,2-二甲氧基乙烷(200ml，1930mmol)中的溶液中分批加入叔丁醇鉀(5.96g，53.1mmol)。將該混合物在85℃下攪拌過夜。將該混合物濃縮，溶于水(200ml)中，用hoac將ph調(diào)節(jié)至ph～4。將水相用乙酸乙酯萃取(5×200ml)。將合并的有機相用水(2×500ml)洗滌，干燥，并濃縮，得到棕色固體狀的標(biāo)題化合物(6.10g，30.9mmol，87.3％)，使用不經(jīng)進一步純化的該化合物。質(zhì)譜(m/z)：196(m-h)。

制備例3

4-(2-氯嘧啶-5-基)氧基-1h-吡唑-3-胺

向2-(2-氯嘧啶-5-基)氧基-3-氧代-丙腈(6.00g，30.4mmol)在乙酸(20ml)和乙醇(40ml)中的溶液中加入在水(5.00ml)中的肼(64質(zhì)量％)。將該溶液在85℃攪拌2小時，濃縮，并加入7nnh3/meoh(20ml)。將該混合物攪拌30分鐘，并濃縮。經(jīng)硅膠快速色譜純化殘余物，用100％ch2cl2至80％ch2cl2和20％meoh梯度洗脫，得到橙色油狀的標(biāo)題化合物(3.15g，14.9mmol，49％)。質(zhì)譜(m/z)：212(m+h)。

制備例4

5-[(3-溴-1h-吡唑-4-基)氧基]-2-氯-嘧啶

向叔丁基腈(2.13ml，17.9mmol)在ch3cn(100ml)中的溶液中加入溴化銅(i)(2.56g，17.9mmol)。將該混合物在n2下在室溫下攪拌1小時，然后加入在ch3cn(10ml)中的4-(2-氯嘧啶-5-基)氧基-1h-吡唑-3-胺(3.15g，14.9mmol)。將該混合物攪拌3小時，濃縮，將殘余物經(jīng)硅膠快速色譜純化，用100％ch2cl2至80％ch2cl2和20％meoh梯度洗脫，得到標(biāo)題化合物(1.30g，4.72mmol，31.7％)，為橙色油狀物。質(zhì)譜(m/z)：275(m+h)。

制備例5

5-(3-溴-1-四氫吡喃-2-基-吡唑-4-基)氧基-2-氯-嘧啶

向5-[(3-溴-1h-吡唑-4-基)氧基]-2-氯-嘧啶(1.30g，1.30g，4.72mmol)在thf(50ml)中的溶液中加入3,4-二氫-2h-吡喃(2.15ml，23.6mmol)和對甲苯磺酸(0.246g，1.42mmol)。將該混合物在60℃攪拌3小時，濃縮，將殘余物經(jīng)硅膠快速色譜純化，用100％石油醚至1:1的石油醚/乙酸乙酯梯度洗脫，得到標(biāo)題化合物(1.5g，4.2mmol，88％)，為白色固體。質(zhì)譜(m/z)：259(m+h)。

制備例6

n-[(3r,4s)-1-[5-(3-溴-1-四氫吡喃-2-基-吡唑-4-基)氧基嘧啶-2-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁基酯

將5-(3-溴-1-四氫吡喃-2-基-吡唑-4-基)氧基-2-氯-嘧啶(1.50g，4.17mmol)、n-[(3r,4s)-4-(2,4,5-三氟苯基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(1.45g，4.59mmol)和碳酸鉀(1.73g，12.5mmol)在dmso(20ml)中的混合物在100℃攪拌過夜。將該混合物冷卻至室溫，倒入水(100ml)中，用乙酸乙酯(3×100ml)萃取。將合并的有機萃取液用水(2×50ml)洗滌，干燥，并濃縮。經(jīng)硅膠快速色譜純化殘余物，用100％ch2cl2至80％ch2cl2和20％meoh梯度洗脫，得到標(biāo)題化合物(2.33g，3.64mmol，87.3％)，為黃色油狀物。質(zhì)譜(m/z)：639(m+h)。

制備例7

n-[(3r,4s)-1-[5-[3-(4,4-二氟環(huán)己烯-1-基)-1-四氫吡喃-2-基-吡唑-4-基]氧基嘧啶-2-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁基酯

向n-[(3r,4s)-1-[5-(3-溴-1-四氫吡喃-2-基-吡唑-4-基)氧基嘧啶-2-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁基酯(2.33g，3.64mmol)、2-(4,4-二氟環(huán)己烯-1-基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環(huán)戊烷(1.07g，4.37mmol)、氯(2-二環(huán)己基膦基-2',4',6'-三異丙基-1,1'-聯(lián)苯)[2-(2-氨基乙基)苯基]鈀(ii)(0.136g，0.182mmol)、2-(二環(huán)己基膦基)-2',4',6'-三異丙基聯(lián)苯(0.177g，0.364mmol)和磷酸三鉀(1.59g，7.29mmol)的混合物中加入水(8ml)和1,4-二噁烷(40ml)。將該混合物在110℃在n2下攪拌過夜。將該混合物濃縮，將殘余物經(jīng)硅膠快速色譜純化，用100％ch2cl2至80％ch2cl2和20％meoh梯度洗脫，得到標(biāo)題化合物(1.61g，2.38mmol，65.3％)，為淡黃色泡沫。質(zhì)譜(m/z)：677(m+h)。

實施例1

(3r,4s)-1-[5-[[3-(4,4-二氟環(huán)己烯-1-基)-1h-吡唑-4-基]氧基]嘧啶-2-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)吡咯烷-3-胺

在室溫向n-[(3r,4s)-1-[5-[3-(4,4-二氟環(huán)己烯-1-基)-1-四氫吡喃-2-基-吡唑-4-基]氧基嘧啶-2-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(1.5g，2.2mmol)在二氯甲烷(10ml，156.0mmol)中的溶液中加入三氟乙酸(10ml)。將該混合物在室溫攪拌16小時，并減壓濃縮。經(jīng)硅膠快速色譜純化殘余物，用100％ch2cl2(0.5％nh4oh)至90％ch2cl2(0.5％nh4oh)10％meoh的梯度洗脫，得到標(biāo)題化合物(1.02g，2.07mmol，93％)，為白色泡沫。質(zhì)譜(m/z)：493(m+h),¹hnmr(cd3od)δ2.09-2.20(m,2h),2.64-2.75(m,4h),3.33-3.36(m,1h),3.48-3.60(m,2h),3.69-3.75(m,1h),4.03-4.13(m,2h),6.27(s,1h),7.17-7.41(m,3h),8.19(s,2h)。

試驗

metap2和metap1的酶活性試驗

本文例舉的化合物基本上如下所述進行測試，并在人和小鼠metap2試驗中顯示出低于或等于1000nm的ic50，并且被認(rèn)為對metap2具有選擇性，其metap1值大于30μm。

使用類似于biochemistry2003,42,5035-5042中所述的方法從sf9細胞產(chǎn)生全長metap2(人和小鼠)和metap1(人)蛋白。分別在5mmmncl2和2mmcocl2存在下純化metap2和metap1，并在使用前在-78℃保存。

通過經(jīng)lc/ms監(jiān)測從底物肽(met-gly-lys-val-lys-val-gly-val-asn-gly)形成產(chǎn)物肽(gly-lys-val-lys-val-gly-val-asn-gly)，來測定本發(fā)明的化合物對人和小鼠metap2的催化活性的抑制。該反應(yīng)通常通過將酶、試驗化合物和底物(150μm)在100μl試驗緩沖液(50mmhepes、100mmnacl、50mg/mlbsa、0.17mmtriton^tmx-100，ph7.5)中孵育40分鐘來進行。通過加入200μlch3cn停止反應(yīng)后，用質(zhì)譜儀定量產(chǎn)物和剩余底物的水平。在分光光度計上用460nm的激發(fā)光和535nm的發(fā)射光通過從底物甲硫氨酸-羅丹明-甲硫氨酸形成熒光產(chǎn)物羅丹明-甲硫氨酸，來監(jiān)測人metap1的活性。該反應(yīng)通常通過將酶、試驗化合物和底物(50μm)在100μl試驗緩沖液(50mmhepes、100mmnacl、0.1％bsa、0.05％50μmcocl2)中孵育60分鐘來進行。通常使用4參數(shù)邏輯斯諦方程式從10點劑量遞增曲線來計算ic50值(提供metap2活性的50％的抑制的試驗化合物的濃度)。

人和小鼠metap2測試中實施例1的ic50低于1000nm，并且對hmetap1的ic50>30μm，證明了相對于metap1的metap2抑制選擇性。

dpp-4的酶活性試驗

純化人dpp-4((39-766)-his)和小鼠dpp-4((29-760)-his)用于試驗。試驗中hdpp-4和mdpp-4的最終濃度分別為0.04nm和0.22nm。

在envision讀板器上通過從底物gly-pro-amc(sigma,g2761)形成產(chǎn)物熒光amc(7-氨基-4-甲基香豆素氫溴酸鹽)，來監(jiān)測本發(fā)明化合物對人和小鼠dpp-4的催化活性的抑制。該反應(yīng)通常通過將酶、試驗化合物和底物(10μm)在75μl試驗緩沖液(0.01％bsa、0.1mmedta、50μmtris-hcl、0.01％triton^tm-x100、0.1mnacl，ph7.5)中孵育30分鐘來進行。通過加入25μlznso4(10mm)停止反應(yīng)后，在envision讀板器上測量熒光產(chǎn)物amc的形成，其激發(fā)波長為355nm，發(fā)射波長為460nm。通常使用4參數(shù)邏輯斯諦方程從10點劑量遞增曲線來計算ic50值。

在人和小鼠dpp-4試驗中，實施例1的ic50低于1000nm，結(jié)果示于表1中。

表1.實施例1的酶活性。

平均值+sem(n)；sem＝平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差；n＝測定次數(shù)

化合物的治療性減重效應(yīng)的測定

為了確定治療性減重效果和代謝參數(shù)的改善，將本發(fā)明的化合物在高脂肪飲食(hfd)喂養(yǎng)誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型(dio小鼠)中進行測試。在該模型中，對c57/bl6j雄性小鼠喂食60％hfd(d12492i，研究飲食)16～28周，以建立肥胖，其體重達到約50g。小鼠體重將逐漸增加至約50g，并在該肥胖狀態(tài)下保持體重。在整個研究期間，將測試化合物(通過0.5％hec加0.25％的介質(zhì)，以5ml/kg)每天口服施用于肥胖dio小鼠一次或兩次。第14天時與介質(zhì)組相比，實施例1的肥胖dio小鼠每天一次20mg/kg和60mg/kg的口服治療的劑量依賴性減重分別為約4％和17％重量損失。該數(shù)據(jù)證明了實施例1的化合物與所需減重相關(guān)，并且可以提供治療性減重效果。

小鼠中dpp-4藥物動力學(xué)試驗

為了確定metap2加dpp-4雙重抑制劑化合物的體內(nèi)dpp-4抑制作用，將化合物施用于喂食狀態(tài)的c57b/l6瘦小鼠，然后測量血漿中的dpp-4靶標(biāo)結(jié)合。

將動物稱重并按體重隨機分組。將每只小鼠通過口服管飼施用介質(zhì)或與用介質(zhì)配制的測試化合物多達3次。第一次劑量在第1天上午9點至10點施用。第二次劑量于第1天16:30～17:30施用。第三次劑量于第2天上午9點至10點施用。在最后一次劑量后、第2天下午3點終止前對小鼠禁食6小時。在第一次劑量后1小時和剛終止后收集血液樣品。使用終濃度為5mm的edta-k2作為抗凝劑。使用從血液樣品中分離的血漿測定血漿dpp-4酶活性。

通過envision讀板器，通過從底物gly-pro-amc(sigma,g2761)形成熒光amc的速率來監(jiān)測本發(fā)明中的血漿dpp-4酶活性。該反應(yīng)通常通過在40μl試驗緩沖液(0.01％bsa、0.1mmedta、50μmtris-hcl、0.01％triton^tm-x100、0.1mnacl，ph7.5)中孵育血漿(20μl)和底物(10μm)來進行。反應(yīng)在動力學(xué)模型中開始后，立即在envision板讀數(shù)器中讀取熒光信號。激發(fā)波長設(shè)定在355nm，發(fā)射波長設(shè)定在460nm。血漿dpp-4活性由反應(yīng)速度計算。將血漿dpp-4抑制百分比對介質(zhì)組中的血漿dpp-4活性(將其設(shè)定為0％抑制)進行標(biāo)準(zhǔn)化。

在試驗條件下，第一次給藥后1小時和剛終止后的實施例1的血漿dpp-4抑制分別86％和83％。該數(shù)據(jù)證明了實施例1的化合物與所需的dpp-4抑制相關(guān)，該dpp-4抑制可產(chǎn)生治療性血糖控制。