本發(fā)明涉及醫(yī)藥化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一類具抗腫瘤活性的甘草查爾酮A二氫吡唑類衍生物及其合成方法。
背景技術(shù)：
腫瘤是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，尋找有效安全、毒副作用小的抗腫瘤藥物一直是腫瘤藥物研發(fā)工作者孜孜以求的目標(biāo)。隨著藥物化學(xué)的發(fā)展，以二氫吡唑環(huán)為結(jié)構(gòu)母核的化合物在腫瘤治療中的作用引起廣泛關(guān)注。
二氫吡唑環(huán)是很多天然化合物和合成藥物中的核心結(jié)構(gòu)單元，作為雜環(huán)化合物中的一個(gè)重要分支，二氫吡唑類化合物因其具有高效、低毒，以及其環(huán)上取代基可以多方位的變換而在藥物領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一類具抗腫瘤活性的甘草查爾酮A二氫吡唑類衍生物及其合成方法。
本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)過(guò)程如下：
結(jié)構(gòu)通式（I）所示的化合物：
其中：R為氫基，C1-C4的烷基，C1-C4的烷氧基，取代或未取代的苯基，取代或未取代的芐基、硝基；所述的取代基為鹵素、C1-C4的烷氧基、苯氧基。
結(jié)構(gòu)通式（I）所示化合物的合成方法，以甘草查爾酮A和肼類化合物為原料，以有機(jī)堿為催化劑進(jìn)行反應(yīng)；
。
具體包含如下步驟：
（1）向反應(yīng)器中按摩爾比為1:1~1:1.5加入甘草查爾酮A和肼類化合物，加入有機(jī)溶劑混合均勻，加入有機(jī)堿催化劑，調(diào)pH至9-11， 70℃～85℃回流反應(yīng)6～12小時(shí)；
（2）將步驟（1）反應(yīng)體系的固液混合物減壓濃縮后柱層析分離純化,干燥得到目標(biāo)產(chǎn)物。
步驟（1）中所述的甘草查爾酮A與肼類化合物的摩爾比為1:1～1:1.3；有機(jī)堿催化劑為三乙胺；有機(jī)溶劑為無(wú)水乙醇；反應(yīng)溫度為80℃~85℃。
研究發(fā)現(xiàn)二氫吡唑類化合物具有消炎、止痛、抑菌、殺菌、抗高血糖、抗癌、抗凝血?jiǎng)┑人幚砘钚裕瑢Ⅳ然攵溥吝虻幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)中，有望增強(qiáng)其生物活性，提高選擇性，具有重要的理論價(jià)值和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：原料環(huán)保，生產(chǎn)成本低，操作安全性高，反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)原料利用充分，適用于工業(yè)化生產(chǎn)，解決了現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)率低的問(wèn)題，同時(shí)將吡啶環(huán)引入到甘草查爾酮A的化學(xué)結(jié)構(gòu)中，對(duì)探究甘草查爾酮A的生物活性與總結(jié)構(gòu)效關(guān)系具有重要的理論價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述。這些實(shí)施例僅是出于解釋說(shuō)明的目的，而不限制本發(fā)明的范圍和實(shí)質(zhì)。
一類具抗腫瘤活性的甘草查爾酮A二氫吡唑類衍生物及其合成方法具體包含如下步驟：
（1）向反應(yīng)器中按摩爾比為1:1~1:1.5加入甘草查爾酮A和肼類化合物，加無(wú)水乙醇混合均勻，其中溶劑體積小于反應(yīng)器容積的2/3，加入有機(jī)堿催化劑三乙胺，調(diào)pH至9-11，置于磁力攪拌器上攪拌，加熱到70℃～85℃，回流反應(yīng)6～12小時(shí)；
（2）反應(yīng)過(guò)程中使用薄層色譜追蹤，及時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)的進(jìn)行程度，待原料反應(yīng)完全后停止加熱，撤去冷凝裝置；
（3）將步驟（2）反應(yīng)體系的固液混合物減壓濃縮后柱層析分離純化,干燥得到目標(biāo)產(chǎn)物。
本發(fā)明部分優(yōu)選實(shí)施方案中的化合物結(jié)構(gòu)式如下所示：
實(shí)施例 1
4-（3-（4-羥基苯基）-1-（對(duì)甲苯基）-4,5-二氫-1H-二氫吡唑-5-基）-5-甲氧基-2-（2-甲基丁-3-烯-2-基）苯酚（1）的制備。
在反應(yīng)器中加入200mg(1mmol)甘草查爾酮A和93.87mg(1.3mmol)對(duì)甲基苯肼，加50ml無(wú)水乙醇作反應(yīng)溶劑，加0.5mL三乙胺作為催化劑，置于磁力攪拌器上攪拌，用電熱套加熱到75℃，回流反應(yīng)10小時(shí)。薄層色譜追蹤反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將上述反應(yīng)體系的固液混合物減壓濃縮后，過(guò)柱層析分離提純，干燥得到棕色結(jié)晶性粉末（135mg），總收率51.61%。
棕黃色結(jié)晶性粉末固體。1H NMR (400MHz, DMSO-d6, 300K):d 7.85 (2H, d, J=7.52Hz), 7.01(2H,d, J=7.52Hz), 6.95 (1H, s), 6.85 (2H, d, J=8.02Hz), 6.48 (2H, d, J=8.02Hz), 6.41(1H,s), 6.30(1H,q), 5,35(2H,s), 5.19 (1H, t), 5.00-4.98 (2H, m), 3.90-3,65 (2H, m), 3.83 (3H, s), 2.34 (3H, s), 1.69 (6H,s).13C NMR (75MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 160.8, 155.1, 154.7, 151.7, 148.8, 140.8, 129.3, 128.3, 125.2, 121.6, 116.0, 113.4, 111.1, 103.8, 56.1, 54.8, 40.3, 39.8, 28.6, 21.3. HRMS (ESI) for (M+H)+: calcd: 443.23, found:443.78。
實(shí)施例 2
4-（3-（4-羥基苯基）-1-（4-甲氧基苯基）-4,5-二氫-1H-二氫吡唑-5-基）-5-甲氧基-2-（2-甲基丁-3-烯-2-基）苯酚（2）的制備。
在反應(yīng)器中加入200mg(1mmol)甘草查爾酮A和106.16mg(1.3mmol)對(duì)甲氧基苯肼，加50ml無(wú)水乙醇作反應(yīng)溶劑，加0.5mL三乙胺作為催化劑，置于磁力攪拌器上攪拌，用電熱套加熱到80℃，回流反應(yīng)6小時(shí)。薄層色譜追蹤反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將上述反應(yīng)體系的固液混合物減壓濃縮后，過(guò)柱層析分離提純，干燥得到棕色結(jié)晶性粉末（127mg）, 總收率46.86%。
棕色結(jié)晶性粉末固體。1H NMR (400MHz, DMSO-d6, 300K): d 7.85 (2H, d, J=7.52Hz), 6.95 (1H, s), 6.85 (2H, d, J=7.52Hz), 6.77 (2H, d, J=7.43Hz), 6.49 (2H, d, J=7.43Hz), 6.41 (1H, s), 6.30 (1H, q), 5.35 (2H, s), 5.19 (1H, t), 5.00-4.98 (2H, m), 3.90-3.65 (2H, m), 3.83 (6H, s), 1.69 (6H, s). 13C NMR (75MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 160.8, 155.1, 154.7, 151.7, 148.8, 136.1, 129.1, 128.3, 125,2, 121.6, 116.0, 115.1, 114.5, 111.1, 103.8, 56.1, 55.8, 54.8, 40.3, 39.8, 28.6.HRMS (ESI) for (M+H)+: calcd: 459.22, found:459.55。
實(shí)施例 3
4-（1-（4-氟苯基）-3-（4-羥基苯基）-4,5-二氫-1H-二氫吡唑-5-基）-5-甲氧基-2-（2-甲基丁-3-烯-2-基）苯酚（3）的制備。
在反應(yīng)器中加入200mg(1mmol)甘草查爾酮A和96.91mg(1.3mmol) （4-氟苯基）肼，加50ml無(wú)水乙醇作反應(yīng)溶劑，加0.5mL三乙胺作為催化劑，置于磁力攪拌器上攪拌，用電熱套加熱到80℃，回流反應(yīng)8小時(shí)。薄層色譜追蹤反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將上述反應(yīng)體系的固液混合物減壓濃縮后過(guò)柱層析分離提純，干燥得到棕色結(jié)晶性粉末（114.2mg）, 總收率43.27%。
棕色結(jié)晶性粉末固體。1H NMR (400MHz, DMSO-d6, 300K): d 7.85 (2H, d, J=7.52Hz), 7.02 (2H, d, J=7.52Hz ), 6.95 (1H, s), 6.85 (2H, d, J=7.43Hz), 6.58 (2H, d,J=7.43Hz), 6.41 (1H, s), 6.30 (1H, q), 5.35 (2H, s), 5.19 (1H, t), 5.00-4.98 (2H, m), 3.90-3.65 (2H, m), 3.83 (6H, s), 1.69 (6H, s). 13C NMR (75MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 160.8, 155.7, 155.1, 154.7,151.7, 148.8, 139.4, 129.1, 128.3, 125,2, 121.6, 116.2,115.1, 111.1, 103.8, 56.1, 54.8, 40.3, 39.8, 28.6. HRMS(ESI)for(M+H)+: calcd:447.20, found:447.55。
實(shí)施例 4
4-（3-（4-羥基苯基）-1-（4-硝基苯基）-4,5-二氫-1H-二氫吡唑-5-基）-5-甲氧基-2-（2-甲基丁-3-烯-2-基）苯酚（4）的制備。
在反應(yīng)器中加入200mg(1mmol)甘草查爾酮A和117.66mg(1.3mmol) 對(duì)硝基苯肼，加50ml無(wú)水乙醇作反應(yīng)溶劑，置于磁力攪拌器上攪拌，用電熱套加熱到85℃，回流反應(yīng)10小時(shí)。薄層色譜追蹤反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將上述反應(yīng)體系的固液混合物減壓濃縮后，加水，加甲醇，冷置析晶。析晶后，過(guò)濾，濾液過(guò)柱層析，柱層析分離提純，干燥得到棕色結(jié)晶性粉末（142.25mg）, 總收率50.83%。
棕色結(jié)晶性粉末固體。1H NMR (400MHz, DMSO-d6, 300K): d 8.64 (2H, d, J=7.32Hz), 7.85 (2H, d, J=7.32Hz), 7.17 (2H, d, J=7.53Hz), 6.95 (1H, s), 6.85 (2H, d, J=7.53Hz), 6.41 (1H, s), 6.30 (1H, q), 5.35 (2H, s), 5.19 (1H, t), 5.00-4.98 (2H, m), 3.90-3.65 (2H, m), 3.83 (6H, s), 1.69 (6H, s). 13C NMR (75MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 160.8, 155.1, 154.7, 151.7, 149.9, 148.8, 136.3, 129.1, 128.3, 125,2, 124.7, 121.6, 116.0, 111.2, 103.8, 56.1, 54.8, 40.3, 39.8, 28.6. HRMS (ESI) for (M+H) +:calcd:474.20, found:474.55。
實(shí)施例 5
4-（1-（4-氯苯基）-3-（4-羥基苯基）-4,5-二氫-1H-二氫吡唑-5-基）-5-甲氧基-2-（2-甲基丁-3-烯-2-基）苯酚（5）的制備。
在反應(yīng)器中加入200mg(1mmol)甘草查爾酮A和109.55mg(1.3mmol) （4-氯苯基）肼，加50ml無(wú)水乙醇作反應(yīng)溶劑，加0.5mL三乙胺作為催化劑，置于磁力攪拌器上攪拌，用電熱套加熱到80℃，回流反應(yīng)12小時(shí)。薄層色譜追蹤反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將上述反應(yīng)體系的固液混合物減壓濃縮后，過(guò)柱層析分離提純，干燥得到棕色結(jié)晶性粉末（113.6mg）, 總收率41.52%。
棕色結(jié)晶性粉末固體。1H NMR (400MHz, DMSO-d6, 300K): d 7.85 (2H, d, J=7.52Hz), 7.27 (2H, d,J=7.52Hz), 6.95 (1H, s),6.85 (2H, d, J=7,43Hz), 6.54 (2H, d, J=7.43Hz), 6.41 (1H, s), 6.30 (1H ,q), 5.35 (2H, s), 5.19 (1H, t), 5.00-4.98 (2H, m), 3.90-3.65 (2H, m), 3.83 (6H, s), 1.69 (6H, s). 13C NMR (75MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 160.8, 155.1, 154.7, 151.7, 148.8, 141.9, 129.2, 128.3, 125.2, 121.6, 116.0, 114.9, 111.1, 103.8, 56.1, 54.8, 40.3, 39.8, 28.6. HRMS (ESI) for (M+H) +:calcd: 463.17, found:463.55。
實(shí)施例 6
4-（1-（4-溴苯基）-3-（4-羥基苯基）-4,5-二氫-1H-二氫吡唑-5-基）-5-甲氧基-2-（2-甲基丁-3-烯-2-基）苯酚（6）的制備。
在反應(yīng)器中加入200mg(1mmol)甘草查爾酮A和143.71mg(1.3mmol) （4-溴苯基）肼，加50ml無(wú)水乙醇作反應(yīng)溶劑，加0.5mL三乙胺作為催化劑，置于磁力攪拌器上攪拌，用電熱套加熱到80℃，回流反應(yīng)10小時(shí)。薄層色譜追蹤反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將上述反應(yīng)體系的固液混合物減壓濃縮后過(guò)柱層析分離提純，干燥得到棕色結(jié)晶性粉末（148.23mg）, 總收率49.43%。
棕色結(jié)晶性粉末固體。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6, 300K)：d7.85 (2H,d), 7.38 (2H,d), 6.95 (1H,s), 6.85 (2H,d),6.49 (2H,d), 6.41 (1H,s), 6.30 (1H, q, J=7.6,7.5HZ), 5.35 (2H,s), 5.19 (1H,t), 4.98-5.00 (2H,m), 3.65-3.90 (5H,m), 1.69(6H,s). 13CNMR (75MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 160.8, 155.1, 151.7, 148.8, 142.8, 132.4, 129.1, 129.0, 128.3, 125.2, 121.6, 116.0, 115.1, 113.4, 111.1, 103.4, 56.1, 54.8, 40.3, 39.8, 28.6. HRMS (ESI) for (M+H)+: calcd: 507.1205, found:507.1311。
實(shí)施例 7
4-（3-（4-羥基苯基）-1-（3-硝基苯基）-4,5-二氫-1H-二氫吡唑-5-基）-5-甲氧基-2-（2-甲基丁-3-烯-2-基）苯酚（7）的制備。
在反應(yīng)器中加入200mg(1mmol)甘草查爾酮A和117.66mg(1.3mmol) 間硝基苯肼，加50ml無(wú)水乙醇作反應(yīng)溶劑，加0.5mL三乙胺作為催化劑，置于磁力攪拌器上攪拌，用電熱套加熱到70℃，回流反應(yīng)10小時(shí)。薄層色譜追蹤反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將上述反應(yīng)體系的固液混合物減壓濃縮后，過(guò)柱層析分離提純,干燥得到棕色結(jié)晶性粉末（115.8mg）, 總收率41.38%。
棕色結(jié)晶性粉末固體。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6, 300K)：d7.85 (2H,d), 7.49-7.64 (4H,m), 6.95(1H,s), 6.85(2H,d), 6.41(1H,s), 6.30 (1H,q,J=7.4,7.3Hz), 5.35 (2H,s), 5.19 (1H,t), 5.00 (2H,m), 3.65-3.90 (5H,m), 1.69 (6H,s). 13CNMR (75MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 160.8, 155.1, 154.7, 151.7, 148.8, 144.7, 130.4, 129.1, 128.3, 125.2, 122.8, 121.6, 116.0, 112.3, 111.1, 106.4, 103.8, 56.1, 54.8, 40.3, 39.8, 28.6. HRMS (ESI) for (M+H)+: calcd: 474.1951, found：474.2004。
實(shí)施例 8
4-（3-（4-羥基苯基）-4,5-二氫-1H-二氫吡唑-5-基）-5-甲氧基-2-（2-甲基丁-3-烯-2-基）苯酚（8）的制備。
在反應(yīng)器中加入200mg(1mmol)甘草查爾酮A和24.62mg(1.3mmol) 水合肼，加50ml無(wú)水乙醇作反應(yīng)溶劑，加0.5mL三乙胺作為催化劑，置于磁力攪拌器上攪拌，用電熱套加熱到80℃，回流反應(yīng)10小時(shí)。薄層色譜追蹤反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將上述反應(yīng)體系的固液混合物減壓濃縮后，過(guò)柱層析分離提純,干燥得到棕色結(jié)晶性粉末（115.1mg）, 總收率55.26%。
棕色結(jié)晶性粉末固體。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6, 300K)：d7.85(2H,d),7.0(1H,d), 6.95(1H,s), 6.85 (2H,d), 6.41 (1H,s), 6.30 (1H, q, J=7.6, 7.5Hz), 5.35 (2H, s), 4.98-5.00 (2H,m), 3.69-3.9 (3H, m), 3.83 (3H, s), 1.69 (6H,s). 13CNMR (75MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 160.8, 155.1, 154.7, 151.7, 148.8, 129.1, 129.0, 128.3, 125.2, 121.6, 116.0, 111.1, 103.8, 56.1, 45.5, 42.9, 39.8, 28.6. HRMS (ESI) for (M+H)+: calcd:353.1787,found:353.1974。
實(shí)施例 9
4-（3-（4-羥基苯基）-1-甲基-4,5-二氫-1H-二氫吡唑-5-基）-5-甲氧基-2-（2-甲基丁-3-烯-2-基）苯酚（9）的制備。
在反應(yīng)器中加入200mg(1mmol)甘草查爾酮A和35.4mg(1.3mmol) 甲基肼，加50ml無(wú)水乙醇作反應(yīng)溶劑，加0.5mL三乙胺作為催化劑，置于磁力攪拌器上攪拌，用電熱套加熱到80℃，回流反應(yīng)10小時(shí)。薄層色譜追蹤反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將上述反應(yīng)體系的固液混合物減壓濃縮后，過(guò)柱層析分離提純,干燥得到棕色結(jié)晶性粉末（99.7mg）, 總收率46.03%。
棕色結(jié)晶性粉末固體。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 300K)：d 7.85 (2H, d), 6.95 (1H, s), 6.85 (2H, d), 6.41 (1H, s), 6.30 (1H, t), 5.35 (1H, s), 5.00 (1H, s), 4.98 (1H, s), 3.7 (1H, t), 3.83 - 3.54 (5H, m), 3.00 (3H, s), 1.69 (6H, s). 13C NMR (75MHz, DMSO-d6 ) δ (ppm): 160.8, 156.1, 155.0, 151.7, 148.8, 129.3, 129.1, 129.0, 125.2, 116.4, 116.0, 111.1, 103.8, 56.1, 54.9, 41.1, 40.4, 39.8, 28.6. HRMS (ESI) for (M+H)+: calcd:367.1943, found: 367.1978。
實(shí)施例 10
4-（1-（叔丁基）-3-（4-羥基苯基）-4,5-二氫-1H-二氫吡唑-5-基）-5-甲氧基-2-（2-甲基丁-3-烯-2-基）苯酚（10）的制備。
在反應(yīng)器中加入200mg(1mmol)甘草查爾酮A和67.73mg(1.3mmol) 叔丁基肼，加50ml無(wú)水乙醇作反應(yīng)溶劑，加0.5mL三乙胺作為催化劑，置于磁力攪拌器上攪拌，用電熱套加熱到80℃，回流反應(yīng)10小時(shí)。薄層色譜追蹤反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將上述反應(yīng)體系的固液混合物減壓濃縮后，過(guò)柱層析分離提純,干燥得到棕色結(jié)晶性粉末（98.2mg）, 總收率40.67%。
棕色結(jié)晶性粉末固體。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 300K)：d 7.85 (2H, d), 6.95 (1H, s), 6.85 (2H, d), 6.41 (1H, s), 6.3 (1H, t), 5.35 (1H, s), 5.00 (1H, s), 4.98 (1H, s), 3.9 (1H, t), 3.83-3.54 (5H, m), 1.69 (6H, s), 1.27 (9H, s). 13C NMR (75MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 160.8, 156.1, 155.0, 151.7, 148.8, 129.3, 129.1, 129.0, 125.2, 116.4, 116.0, 111.1, 103.8, 74.6, 56.1, 47.4, 41.3, 39.8, 28.6. HRMS (ESI) for (M+H)+: calcd:409.2413, found: 409.2487。
實(shí)施例 11
本發(fā)明化合物的抗腫瘤活性測(cè)試
對(duì)本發(fā)明的化合物進(jìn)行了腫瘤細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)，試驗(yàn)方法采用常規(guī)的MTT法。
細(xì)胞株選用：人肝癌細(xì)胞(HepG2)，人肺癌細(xì)胞(A-549)，人宮頸癌細(xì)胞(Hela)，人胃癌細(xì)胞(SGC-7901)，人結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT-8)。培養(yǎng)液為DMEM+15%NBS+雙抗。
樣品液的配制：用DMSO(Merck)溶解后，加入PBS(-)配成的100 μmol/L的溶液或者均勻的混懸液，然后用DMSO的PBS(-)稀釋，最終濃度分別為0.1，1，10，20，40，60，80，100 μmol/L。
將上市的抗腫瘤藥物阿糖胞苷(Ara-C)以同樣的條件配成對(duì)照品溶液。
細(xì)胞培養(yǎng)：貼壁生長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 滅活新生牛血清和青霉素、鏈霉素（各100萬(wàn)U/L）的1640培養(yǎng)液中，置于37℃，5% CO2，飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，每2～3 天傳代1 次，傳代時(shí)首先倒出培養(yǎng)液，PBS洗2次，胰酶消化后，加入新鮮的培養(yǎng)液吹打均勻，調(diào)整細(xì)胞至適當(dāng)濃度移入新的培養(yǎng)瓶中，添加培養(yǎng)液至適量。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性及IC50的測(cè)定：
實(shí)驗(yàn)原理：活細(xì)胞線粒體中脫氫酶能將黃色的MTT還原成不溶于水的藍(lán)紫色產(chǎn)物甲臜 (MTT formazan)，并沉積在細(xì)胞中，生成的量與活細(xì)胞數(shù)目成正比，而死細(xì)胞沒(méi)有這種功能。DMSO能溶解藍(lán)紫色結(jié)晶物，顏色深淺與所含的量成正比，因此用酶標(biāo)儀測(cè)定的光吸收值可反映細(xì)胞存活率。
實(shí)驗(yàn)方法：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，消化、計(jì)數(shù)，以 2×104/mL 的密度接種于 96 孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl。培養(yǎng) 24小時(shí)后，將待測(cè)化合物以0.1，1，10，20，40，60，80，100 μmol/L濃度處理細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，以含0.4% DMSO的培養(yǎng)液作對(duì)照。藥物作用 48小時(shí)后，去上清，每孔加入100 μl MTT（2-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-3，5-二苯基-2H-四唑氫溴酸鹽）(1mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng) 4小時(shí)，棄上清，每孔加入100μl DMSO，振蕩混勻，用酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)定吸光度值，采用 IC50 計(jì)算軟件求出半數(shù)抑制濃度(IC50)。
試驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)表1，其中，樣品是指相應(yīng)實(shí)施例中制備的甘草查爾酮A吡啶類衍生物，樣品編號(hào)對(duì)應(yīng)制備實(shí)施例中所得到的化合物的具體編號(hào)。
化合物8在所測(cè)試的5種細(xì)胞株中均表現(xiàn)出了良好的抗腫瘤活性，化合物2、7和9次之，在不同的細(xì)胞株中也表現(xiàn)出了良好的抗腫瘤活性。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的化合物具有良好的抗腫瘤活性，特別是部分甘草查爾酮A二氫吡唑類化合物的活性在特定細(xì)胞株中抗腫瘤活性優(yōu)于或等同于阿糖胞苷。
表1 化合物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50（單位：μmol/L）