發(fā)明背景

本發(fā)明涉及新的化合物、制備新的化合物的方法及它們的用途。

背景技術：

從美國專利號3,202,657和美國專利號3,394,109中已知噁噻嗪樣化合物。

本領域仍然需要新的化合物和制造這種化合物的方法來提供具有更強的抗腫瘤和抗微生物活性、低毒性和副作用及腫瘤或微生物細胞對處理的抵抗力更低的化合物。

技術實現(xiàn)要素：

根據本發(fā)明，揭示了新的噁噻嗪樣化合物、制造新的噁噻嗪樣化合物的方法及它們的用途。

附圖說明

圖1以圖形方式顯示ln-229細胞的細胞毒性測定中，本發(fā)明的一個實施方式的抗腫瘤活性。

圖2以圖形方式顯示sw480(人結腸腺癌)細胞的細胞毒性測定中，本發(fā)明的一個實施方式的抗腫瘤活性。

圖3a-3c用?；橇_定和牛磺胺(tt)處理后，小鼠sma560的體膠質瘤細胞中誘發(fā)的細胞毒性。在24h(圖3a)和48h(圖3b)的處理后，評估細胞毒性。在較低的圖(圖3c)給出了?；橇_定(34.6μg/ml)和?；前?19.3μg/ml)的ec50值。數(shù)據以三個獨立實驗的平均值±sd表示。

圖4為?；橇_定和?；前?tt)在小鼠sma560的膠質瘤癌癥干細胞(csc)中誘發(fā)的細胞毒性。數(shù)據以平均值±sd表示。

圖5a-5c為在用牛磺羅定(圖5a)和?；前?tt)(圖5b)或替莫唑胺(圖5c)處理24h后，從四個多形性成膠質細胞瘤(gbm)患者(gbm#3、#4、#5和#6)分離的腫瘤干細胞中誘發(fā)的細胞毒性。數(shù)據以平均值±sd表示。

圖6為根據本發(fā)明制作的化合物2244的ftir光譜。

圖7為根據本發(fā)明制作的化合物2250的ftir光譜。

圖8顯示了多細胞胰腺腫瘤(panctui或bxpc-3)球體的球體毒性測定的結果，其中把對照的、?；橇_定處理的(500μm)或化合物2250處理的(1000μm)樣品處理48小時(標號a的列)且過濾以測試殘余聚集物(標號b的列)的穩(wěn)定性。

圖9a和9b表示panctui多細胞球體培養(yǎng)物cd133含量的facs分析結果。

圖10a顯示了用對照物或?；橇_定處理后的miapaca2腫瘤體積。圖10b顯示了用對照物或化合物2250處理后的miapaca2腫瘤體積。圖10c顯示了用對照物或?；橇_定處理后的panctui腫瘤體積。圖10d顯示了用對照物或化合物2250處理后的panctui腫瘤體積。

圖11a是用對照物、?；橇_定或化合物2250處理時，觀察15天的胰腺原發(fā)腫瘤(bo70)移植瘤模型。圖11b是用對照物、?；橇_定或化合物2250處理時，觀察23天的胰腺原發(fā)腫瘤(bo70)移植瘤模型。

具體實施方式

根據某些實施方式，本發(fā)明涉及噁噻嗪樣化合物及其衍生物和制備噁噻嗪樣化合物及其衍生物的方法。

根據本發(fā)明某些實施方式的噁噻嗪樣化合物及其衍生物具有抗腫瘤活性、抗微生物活性和/或其他活性。

根據本發(fā)明某些實施方式的噁噻嗪樣化合物及其衍生物提供制造具有抗腫瘤活性、抗微生物活性和/或其他活性的化合物的有利方法。某些實施方式中，噁噻嗪樣化合物及其衍生物尤其在治療對象如人類患者的癌癥和腫瘤的方法中有用。因此，在本發(fā)明的某些實施例中，還涉及使用本文所述化合物治療癌癥和腫瘤的方法。癌癥如包括成膠質細胞瘤、膠質瘤、神經母細胞瘤，星形細胞瘤的中樞神經系統(tǒng)癌癥和癌性腦膜炎、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、間皮瘤、黑色素瘤、腎癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、食管癌、膀胱癌、宮頸癌、賁門癌、膽囊癌、皮膚癌、骨腫瘤、頭部和頸部的癌癥、白血病、淋巴瘤、淋巴肉瘤、腺癌、纖維肉瘤及其轉移，例如，是根據本發(fā)明某些實施方式考慮治療的疾病?？顾幠[瘤，例如抗多藥腫瘤(mdr)，在使用本發(fā)明化合物的某些實施例中也有用，包括如實體瘤、非實體瘤和淋巴瘤的抗藥腫瘤。目前認為，任何腫瘤細胞都可以使用本文描述的方法進行治療。

腫瘤干細胞(也被稱為癌癥干細胞(cscs))被認為是術后形成轉移和腫瘤再生的主要因素。

在某些實施方式中，本發(fā)明的化合物尤其用于對象的腫瘤干細胞的治療。

在某些實施方式中，本發(fā)明的化合物尤其用于對象的成膠質細胞瘤腫瘤干細胞的治療。

在某些實施方式中，本發(fā)明通過氧化應激、細胞凋亡和/或抑制在腫瘤部位新血管生長(抗血管生成和抗管腔化)，從而殺死腫瘤細胞和/或cscs，或抑制其生長。殺死腫瘤細胞和/或cscs的一個主要作用機制是氧化應激。腫瘤細胞和/或cscs還可以根據本發(fā)明通過細胞凋亡殺死。在血液濃度較低時，根據本發(fā)明的化合物通過抗血管生成作用和抗管腔化作用，有效抑制腫瘤細胞的生長，從而這些化合物在姑息治療中有用。

本發(fā)明的噁噻嗪樣化合物及其衍生物在血流中的代謝比?；橇_定和牛磺胺慢得多。因此，可以對患者進行此類化合物的低劑量給藥，以獲得類似的效果。

意外的發(fā)現(xiàn)，在暴露于?；橇_定幾分鐘內，腫瘤細胞通過如下那樣啟動凋亡性細胞死亡程序而反應：

1.牛磺羅定對腫瘤細胞的原發(fā)性損害是活性氧簇(ros)的增加，這是熒光測量的。

2.作為主要步驟的通過?；橇_定引入的氧化應激由如下的發(fā)現(xiàn)來支持：通過添加如谷胱甘肽或n-乙酰半胱氨酸等還原劑，可以防止?；橇_定的抗腫瘤作用。

3.提高的ros對腫瘤細胞線粒體造成的損害導致其膜電位的喪失和細胞凋亡誘導因子的釋放(aif)。

4.aif易位到細胞核并啟動促凋亡基因的表達，從而導致質膜起泡、染色質凝聚和dna斷裂，這是細胞凋亡的標志。

5.與正常細胞相比，腫瘤細胞對氧化應激非常敏感。這解釋了?；橇_定針對除了正常細胞之外的廣泛的腫瘤細胞的作用。

在某些實施方式中，本發(fā)明的化合物也可用于治療對象(如人類患者)的微生物感染。根據某些實施方式可以治療的微生物感染包括細菌感染、真菌感染和/或病毒感染。

癌癥患者易患免疫功能低下，這導致特別是在手術期間和/或手術后易患微生物感染。

在某些實施方式中，本發(fā)明化合物用于治療對象中的成膠質細胞瘤。

在某些實施方式中，本發(fā)明化合物用于治療對象中的金黃色葡萄球菌感染。

在某些實施方式中，本發(fā)明化合物用于根據本發(fā)明來治療對象中的mrsa。

在某些實施方式中，本發(fā)明化合物用于根據本發(fā)明來治療對象中的大腸桿菌。

在某些實施方式中，本發(fā)明化合物用于根據本發(fā)明來治療對象中的幽門螺桿菌(h.pylori)和/或對象中的與幽門螺桿菌有關的一種或多種癌癥。

在某些實施方式中，本發(fā)明化合物用于根據本發(fā)明來治療對象中的hiv。

在某些實施方式中，根據化學式i的化合物根據本發(fā)明而使用，其中r是h、烷基等，如甲基、乙基、丙基(例如異丙基)、苯甲基等。

在某些實施方式中，根據本發(fā)明制備和/或使用新化合物2250(四氫1,4,5-噁噻嗪-4-二氧化物或1,4,5-噁噻嗪烷(oxathiazan)-4-二氧化物)。根據本發(fā)明制備的化合物2250的ftir光譜如圖8所示。

在某些實施方式中，根據本發(fā)明制備和/或使用新化合物2245。

化合物2250預防和治療胃腫瘤(包括由幽門螺桿菌引起的或與其有關的腫瘤)或因轉移到胃而形成的腫瘤。

化合物的量取決于腫瘤的大小。在一個實施方式中，本發(fā)明包括用外科手術縮小腫瘤大小并用一種或多種化合物治療。該化合物可在手術前、手術期間或手術后給藥來減小腫瘤。根據本發(fā)明的化合物可以用任何合適的方法給藥，包括但不限于，通過凝膠、膠囊、片劑、iv(靜脈給藥)、ip(復膜內給藥)和/或直接給藥到腫瘤。

凝膠可以包含例如2-4％(例如，3％)的本發(fā)明的活性化合物(如化合物2250)，可以單獨的或與牛磺羅定/?；前?其也可以單獨給藥或存在)組合，且可以局部給藥。這種凝膠可以用來治療皮膚和口腔的腫瘤，包括口腔和皮膚的鱗狀細胞腫瘤。這種凝膠也可以通過栓劑給藥至陰道、或通過注射器給藥，用于治療宮頸癌或宮頸發(fā)育不良。本發(fā)明可包括帶有活性化合物的栓劑的組合。

口服給藥的固體劑型包括膠囊、片劑、丸劑、粉末和顆粒。此類固體劑型中，提供的組合物混有至少一種惰性的、醫(yī)藥上可接受的賦形劑和/或填料(fillers)或填充劑(extenders)(如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸)、粘合劑(如羧甲基纖維素、海藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯膠)、保濕劑(例如，甘油)、崩解劑(如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉、褐藻酸、某些硅酸鹽和碳酸鈉溶液)、溶解阻滯劑(solutionretardingagents)(如石蠟)、吸收促進劑(如季銨化合物)、潤濕劑(如鯨蠟醇和單硬脂酸甘油酯)、吸收劑(如高嶺土、膨潤土)、潤滑劑(如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉)及其混合物。如果是膠囊、片劑和丸劑的情況，劑型可包括緩沖劑。

本公開的化合物，特別是化合物2250，已發(fā)現(xiàn)在水中極易溶解。在某些實施方式中，不需要pvp來增加溶解度。例如，3.2％的溶液2250是等滲的。相對于牛磺羅定，這是意想不到的優(yōu)勢。

本發(fā)明的化合物(如化合物2250(有或沒有?；橇_定和/或?；前?)在外科腫瘤學中非常有用，因為該化合物不妨礙傷口愈合。其他抗腫瘤藥物的給藥必須延遲到在術后的多達五周或更長時間，因為其他此類抗腫瘤藥物阻礙傷口愈合并促進吻合口漏?？梢允褂帽景l(fā)明的化合物(如化合物2250)避免這種問題，該化合物可在手術期間和術后立即進行給藥，無傷口愈合問題或滲漏問題。

相似類型的固體組合物可以用作軟和/或硬填充的明膠膠囊中的填料，所述軟和/或硬填充的明膠膠囊使用賦形劑像諸如乳糖或牛奶糖以及高分子量的聚乙二醇等。片劑、糖衣丸、膠囊、丸劑和顆粒的固體劑型可以用包衣和殼體(如腸溶包衣和制藥領域熟知的其他包衣)制備。它們可以可選的包含乳濁劑，且可以為這樣的組合物，它們只在或優(yōu)先地在腸道的某一部分釋放所提供的一種或多種組合物，且可選地是以延遲方式釋放?？梢允褂玫那度虢M合物的實施例包括聚合物和蠟。相似類型的固體組合物可以作為填料用于軟和/或硬填充的明膠膠囊中，所述膠囊使用諸如乳糖或牛奶糖以及高分子量的聚乙二醇等這樣的賦形劑。

在某些實施方式中，膠囊可以包括含有羥丙基甲基纖維素(hpmc)、明膠和魚明膠中的一種或多種的賦形制劑。在某些實施方式中，膠囊可含有化合物2250與牛磺羅定和/或?；前返慕M合。膠囊可以可選的進一步包括番茄紅素、鞣花酸(多酚)、姜黃素、胡椒堿、飛燕草素、白藜蘆醇、異硫氰酸酯(如蘿卜硫素)、辣椒素和蓽茇酰胺中的一種或多種。

本發(fā)明的活性化合物，如化合物2250，可以與諸如吉西他濱的化合物組合。這種組合可用于治療癌癥，如胰腺癌。?；橇_定和/或牛磺胺也可以與吉西他濱組合以治療例如胰腺癌。

在一些實施方式中，營養(yǎng)癌癥預防和治療的產品可以只包含100-500mg化合物2250或100-500mg化合物2250與100-500mg?；橇_定和/或牛磺胺的組合，以及下列中的一種或多種：番茄紅素(例如，20-200mg)、鞣花酸(多酚)、姜黃素、胡椒堿(20-200mg)、飛燕草素、白藜蘆醇、異硫氰酸酯(如蘿卜硫素)、辣椒素和蓽茇酰胺。

意外地發(fā)現(xiàn)，這些化合物可以在手術期間和手術后立即使用，因為這些化合物不像其他化療劑那樣抑制傷口愈合。

意外地發(fā)現(xiàn)，?；橇_定、?；前泛蛧f噻嗪樣化合物及其衍生物能殺死腫瘤干細胞，這在化療制劑中是非常不尋常的，并且可能是未知的。典型的化療制劑，如果對腫瘤干細胞有效，一般只在非常高的劑量下有效，這對人類患者的毒性極高。

意外地發(fā)現(xiàn)，殺死腫瘤干細胞的牛磺羅定和/或?；前返膭┝恳葰⑺滥[瘤細胞所需的劑量低。

意外地發(fā)現(xiàn)，噁噻嗪樣化合物及其衍生物在人體血液中具有的半衰期明顯低于牛磺羅定和?；前贰Ｒ虼?，這些化合物從患者的血流中清除得不那么快，從而有效地延緩了機體清除機制導致的藥物效力的喪失。

意外地發(fā)現(xiàn)，當直接應用到組織中時，某些噁噻嗪樣化合物及其衍生物減少了燒灼感，而不像在用?；橇_定治療的患者中觀察到的那樣的灼燒感。

意外地發(fā)現(xiàn)，噁噻嗪樣化合物及其衍生物具有特別有利的包括以下的性質的組合：高水溶性、靈活多樣的給藥途徑(包括口服和靜脈注射)、長的穩(wěn)定性和半衰期，并且燒灼感的副作用降低。

因此，化合物2250在人體血液中的半衰期大于24小時，這顯著高于?；橇_定的半衰期，在使用相同的測試時，?；橇_定的半衰期被認為是約30分鐘。

在一個實施方式中，本發(fā)明包括通過用化合物2250給患者給藥來治療患者，導致給藥約5分鐘內，化合物2250達到基線血液濃度。該方法包括將患者中化合物2250的血液濃度維持在基線血液濃度的大約80％持續(xù)約20小時。

在一個實施方式中，本發(fā)明包括將患者中的抗腫瘤化合物的血液濃度維持在患者的基線血液濃度的大約80％持續(xù)約20小時，其是通過每日一次將日劑量的化合物2250進行給藥以維持基線血液濃度的80％的血液濃度。

日劑量可以是約0.1g到約100g，例如，約5g到30g。日劑量可以通過可口服給藥的組合物的形式給藥。日劑量可以以膠囊、片劑或醫(yī)藥上可接受的溶液的形式給藥。日劑量可以以含有濃度為約0.01至約3％w/v的化合物2250的形式給藥。日劑量可以以濃度為約0.01μg/ml到約1000μg/ml的化合物2250的形式給藥，日劑量可以以含有一種或多種增溶劑(例如，多元醇)的形式給藥。

在一些實施方式中，該化合物可以在組合物中以濃度約0.01至約1000μg/ml給藥。在一些實施方式中，該化合物可以在組合物中以濃度約1至約100μg/ml給藥。在一些實施方式中，該化合物可以在組合物中以濃度約10至約50μg/ml給藥。該組合物也可以包括約0.01至約1000μg/ml、約1至約100μg/ml或約10至約50μg/ml的?；橇_定和/或?；前?。

在一些實施方式中，該化合物可以在組合物中以濃度約0.01至約3％給藥。在一些實施方式中，該化合物可以在組合物中以濃度約0.1至約2.5％給藥。在一些實施方式中，該化合物可以在組合物中以濃度約1％至約2％給藥。該組合物還可以額外地包括約0.01至約3％、約0.1至約2.5％或約1至約2％的?；橇_定和/或牛磺胺。

在一個實施方式中，噁噻嗪樣化合物及其衍生物可以作為與?；橇_定和/或?；前返穆?lián)合治療進行給藥來殺死腫瘤干細胞。根據這種實施方式，意外地發(fā)現(xiàn)，該聯(lián)合治療殺死腫瘤干細胞所需的劑量要低于殺死正常腫瘤所必須的劑量。

在某些實施方式中，噁噻嗪樣化合物及其衍生物可以與維生素d3一起給藥，這導致該化合物抗腫瘤作用的增加。

在一個實施方式中，該化合物以0.1g至約100g、約1g至約80g約2g至約50g或約5g至約30g的總日劑量向對象給藥。

該化合物的有效劑量是在0.1-1000mg/kg范圍內、優(yōu)選150-450mg/kg/天的范圍內、最優(yōu)選300-450mg/kg/天的范圍內的劑量單位。

如本文使用的，術語純指的是相對于雜質和污染物至少約80％純的物質。在一些實施方式中，術語純指的是相對于雜質和污染物至少約90％純的物質。在某些實施方式中，術語純指的是相對于雜質和污染物至少約95％純的物質。在一些實施方式中，術語純指的是相對于雜質和污染物至少約99％純的物質。在一些實施方式中，術語純指的是相對于雜質和污染物至少約99.5％純的物質。

在某些實施方式中，本發(fā)明的化合物、組合物和方法包含微粉化化合物的用途。在一些實施方式中，本文使用的術語“微粉化”指的是粒度在約0.005到100微米范圍內。在某些實施方式中，本文使用的術語“微粉化”指的是粒度在約0.5到50微米范圍內。在某些實施方式中，本文使用的術語“微粉化”指的是粒度在約1到25微米范圍內。例如，藥物粒度可以是約1、5、10、15、20或25微米。

在某些實施方式中，本發(fā)明的化合物、組合物和方法包含納米粒子的用途。如本文使用的，術語“納米粒子”指直徑小于1000納米(nm)的任何粒子。在一些實施方式中，納米粒子的直徑小于300nm。在一些實施方式中，納米粒子的直徑小于100nm。在一些實施方式中，納米粒子的直徑小于50nm，例如在約1nm到50nm之間。適合注射或輸液的制劑可包括含有一種或多種增溶劑(如葡萄糖等多元醇)的等滲溶液來提供化合物濃度增加的溶液。這種溶液在ep253662b1中已被描述。溶液可以用林格溶液或乳酸林格溶液來呈現(xiàn)等滲。這種溶液中的化合物的濃度可以在1-60g/升的范圍內。

在某些實施方式中，制造本發(fā)明化合物的示例性的化合物和方法包括如下：

該化合物可以是結晶形式，例如，在醇、酮、酯或其組合中結晶和/或重結晶之后。例如，本發(fā)明的化合物可從如乙醇等醇中結晶或重結晶。

本發(fā)明的示例性的化合物包括如下：

已經發(fā)現(xiàn)，當使用納米粒子的形式時，所要求保護的發(fā)明的化合物達到更高的血液水平。在一個實施方式中，本發(fā)明僅包括單獨的化合物2250或包括其與牛磺羅定和/或?；前返慕M合。例如，本發(fā)明包括封裝在膠囊中的本發(fā)明化合物的納米粒子。

在某些實施方式中，本發(fā)明還涉及上述化合物的衍生物，該化合物的衍生物具有例如所述化合物的如本文描述的活性，例如，所述活性的至少25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％或更多。

在某些實施方式中，本發(fā)明還涉及包含本文描述的化合物的組合物，包括所述化合物的醫(yī)藥上可接受的溶液，以及可口服給藥的組合物，如含有所述組合物的膠囊和片劑。

在某些實施方式中，本發(fā)明的化合物可以通過適當?shù)姆椒?例如在溶液中，如局部的、系統(tǒng)的(例如通過靜脈輸注)等)給對象或患者給藥。

2250的合成

約70-80℃在真空中升華

起始原料：

羥乙基磺酸

乙烯磺酸酐(carbysulfat)、?；撬?、?；撬狨０?、

尤其是半胱氨酸、羥乙基磺酸

合成1

i.

a.通過二價碳基硫酸鹽合成羥乙基磺酸

b.通過?；撬岷铣闪u乙基磺酸

通過半胱氨酸、?；撬岬纳锘瘜W合成

●

●

化學合成

●環(huán)氧乙烷與重亞硫酸鹽

ii.羥乙基磺酸酰胺

a.

b.乙烯磺酸酐+nh3

2250可能的替代化學合成步驟

a)氨磺酸

b)多聚甲醛，六亞甲基四胺

(六亞甲基四胺、甲醛胺(formine)、烏洛托品)

c)

d)

e)

f)

g)

h)

2250和2255的幾個可選地合成步驟

i.起始原料2250/2255

a.

b.乙烯磺酸酐+h2o

從環(huán)氧乙烷+亞硫酸氫鈉合成羥乙基磺酸鈉

ii.胺與乙烯磺酸酐的反應

iii.

示例性合成方案

i.2244的合成

將2.15g純1907溶解在100ml乙酸乙酯中，且用0.5g活性炭負載的鈀催化。該溶液在室溫和大氣壓力條件下氫化。該氫化作用約15小時后完成且氫的吸收量是450ml。該氫化作用被清除3次，每次使用氮，且然后將該反應混合物通過助濾劑(硅藻土)過濾。將透明無色的乙酸乙酯溶液在旋轉蒸發(fā)器中濃縮和干燥。

產量：1.25g，用晶體化的2244種晶。

熔點：42-44℃。

ir：對應于2244，純度99.3％。

ii.2244的合成

將5g(0.023mol)的2264/1907在回流條件下在50ml濃鹽酸中煮沸3小時，然后冷卻至室溫，在分離漏斗中用30ml二氯甲烷分離。水相在旋轉蒸發(fā)器中蒸發(fā)并干燥。留下黃色油狀物，在將2244晶體種晶后緩慢結晶。

ir對應于物質2244。

從乙酸乙酯中重結晶。

獲得0.7g(24％)。

熔點：44-45℃。

熔點：44-45℃。

ir對應于參照物質。

iii.2244的合成

其中ph是苯基基團。

將230mg2269溶解在2mlnaoh(1n)中且用回流冷凝器沸騰回流15分鐘。清液冷卻至20℃并用鹽酸酸化。得到的沉淀物在真空中濾出并干燥。

產量：110mg。

熔點：114-116℃。

ir顯示99％苯甲酸為副產品。

將酸性溶液濃縮以在旋轉蒸發(fā)器上干燥，且將固體用乙酸酯煮沸。將乙酸乙酯溶液過濾并在真空中濃縮至干燥。

重量：110mg。油被油污染且2244(羥乙基磺酸酰胺)的ir峰是不潔的。

該110mg在乙酸酯中重結晶。

產量：65mg，熔點：43-45℃，

ir對應于52％的2244。

iv.2244的合成

其中ph是苯基基團。

將1.15g2269溶解在10mlnaoh(1n)中且沸騰回流15分鐘。清液冷卻至20℃并用鹽酸酸化。得到的沉淀物在真空中濾出并干燥。

產量：0.5mg。

熔點：114-116℃。

ir顯示82％苯甲酸副產物為對照品。水解不完全。

將酸性溶液濃縮以在旋轉蒸發(fā)器上干燥，且將固體用乙酸酯煮沸。將乙酸乙酯溶液過濾并在真空中濃縮至干燥。

重量：0.8g。油被油污染且2244(羥乙基磺酸酰胺)的ir峰是不潔的。

該0.8g在乙酸酯中重結晶。

產量：160mg，熔點：43-45℃

ir對應于26％的2244。

v.2244的合成

215g0.1mol2264和1000ml濃鹽酸(約36％)在回流下一起煮30分鐘。該2264分解了且有一層油層。將反應混合物冷卻并轉移至分液漏斗里，在這里將該油從水相中分離出來。將溶有羥乙基磺酸酰胺(2244)的酸性水溶液在50℃下，在旋轉蒸發(fā)器中濃縮至幾乎干燥。將黃色油殘渣放在冰箱中過夜，32.3克清潔的晶體在真空中被濾出。熔點43-45℃。ir：在氧中具有以下波數(shù)的峰655.82、729.12、844.85、898.86、947.08、1003.02、1060.88、1134.18、1236.41、1288.49、1317.43、1408.08、1572.04、3105.5、3209.66、3313.82和3427.62cm^-1，如圖7所示。

母液濃縮至完全干燥。

vi.2244的合成

21.5g0.1mol2264和100ml濃鹽酸(約36％)在回流下一起煮30分鐘。油層形成且將反應混合物在分液漏斗中冷卻，在這里將該油從水相中分離出來。羥乙基磺酸酰胺(2244)被溶解在酸性水溶液中并與二氯甲烷一起振動2次，該二氯甲烷被分離，且酸性水溶液在50℃下，在旋轉蒸發(fā)器中濃縮至干燥。熔點：41-43℃。產物分析表明，通過ir，對應于99.8％的2244。

蒸餾實驗：

在高真空中被蒸餾出12.3g：

外部溫度內部溫度真空

190-210℃183-186℃0.1mm

重量：9.3g油，該油脂室溫下是固體。熔點：43-45℃。

vii.2244的合成

將2.0g純化合物1907溶解在200ml乙酸酯中，并加入0.5g鈀/活性炭，且該將混合物在100℃熱壓處理并在50℃氫化。運行6小時后，將反應混合物冷卻過夜，然后過濾，在真空中濃縮到干燥。

重量：1.7g油—添加ch2cl2并振動，然后停止—然后吸取并過濾得到結晶固體，重量：0.6g，熔點約40℃。

為了分析，添加了兩倍的乙酸酯0.2g來結晶。熔點43-44℃。

viii.2244的合成

將2.0g純化合物1907溶解在100ml乙酸乙酯中，然后加入0.5克鈀/活性炭。然后在室溫和大氣壓下對混合物進行氫化。約15小時后終止氫化。氫的吸收量約為450ml。然后將氫氣排出3次并用氮氣沖洗，然后每個反應混合物通過硅藻土(硅藻土celite)過濾。透明無色的溶液乙酸乙酯在旋轉蒸發(fā)器上蒸發(fā)至干燥。

重量：1.25g油，添加2244晶體后結晶。

熔點：42-44℃。

ir：對應于99.3％的2244。

ix.2250的合成

將1.2g純2245溶解于150ml乙酸，在60℃下完全溶解。加入0.3g活性炭負載的鈀，并在75℃下攪拌，然后該化合物在大氣壓力下氫化。

7天后停止氫化作用。氫的吸收量約為480ml。

除去氫氣并用氮氣清洗3次。

然后通過助濾劑在70℃(硅藻土)將反應混合物過濾。將透明溫暖的冰乙酸溶液冷卻到室溫并將白色晶體吸取并過濾。

重量：0.74g，熔點：225-227℃

ir：2245對應于起始物料。

母液在旋轉蒸發(fā)器上濃縮至干燥。

重量：用乙酸乙酯萃取0.38g不純物質。

溶液被濃縮。

乙酸乙酯可溶性部分：升華得到的半固體物質；

得到0.15g從幾滴水中重結晶的半固態(tài)物質。

產量：70mg，熔點：95-98℃。

ir對應于98％的2250。

x.固體2-苯甲醚乙烷磺酸鈉的高產量的1步合成

10.5g2-溴乙烷磺酸鈉添加到110ml苯甲基乙醇和1.15g苯甲醇鈉的溶液中。

然后將混合物在回流下煮沸四次。然后將混合物在真空中濃縮至干燥，且然后用乙醇煮沸三次。將酒精過濾后濃縮至干燥。

產量是9.8g并經uv和ir確認。

通過在乙醇中煮沸生成的2-苯甲醚乙烷磺酸鈉、過濾，然后冷卻該溶液使純2-苯甲醚乙烷磺酸鈉從溶液中結晶出來得到純晶體。

xi.2250的合成

6.3g乙烯基磺酰胺(從2258中)，50ml濃縮甲酸和1.1g多聚甲醛在回流中結合2小時來產生化合物2250。然后，將透明的酸性溶液在旋轉蒸發(fā)器上濃縮來干燥。

殘渣為5.9g淡黃色、類似蜂蜜的糖漿。

ir：乙烯基磺酰胺和2250的混合物，2克升華了，且得到了少許晶體。

升華半固體：ir：對應于98％的2250。

xii.乙烯基磺酰胺的合成

將甲酰羥乙基磺酸氯化物(formylisethionicchloride)置于50ml氯仿中和置于350ml磺化燒瓶中并冷卻至-10℃。然后引入25％的氨氣。氨氣引入后，氯仿/nh3的重量為5g。從-3℃到2℃，將該混合物緩慢攪拌。

向9.0g蒸餾的2249，逐滴添加20ml氯仿。nh4cl立即沉淀。

然后在真空下濾出氯化銨，并將透明的氯仿溶液在旋轉蒸發(fā)器中濃縮直至干燥。

產量：6.3g透明的、稀油。

ir：對應于96％的ch2＝ch-so2-nh2(乙烯基磺酰胺)

xiii.2261的合成

稱量300g(1.26mol)2260放入帶有kpg-攪拌器的750ml多頸燒瓶。

415ml三氯乙烯+三氯氧磷(在10％pocl3中，密度相當于約1.47)和150ml三氯氧磷和5.7mldmf攪拌加熱到105℃。允許該混合物反應5小時。

在真空下將固體過濾且在水泵真空下蒸餾液體。濾餅用乙酸乙酯沖洗。蒸餾出三氯乙烯和三氯氧磷后，將洗滌乙酸轉移到燒瓶中，并也蒸餾。

收集到250g(1.07mol-85％)黃色液體。ir對應于2261。

xiv.2250和2255的合成：

xv.化合物2250及其相關化合物的新合成方案：

起始原料：

3-羥基丙烷-1-磺酸

3-羥基-丙烷--磺酸-γ-磺內酯(1,3-丙烷磺內酯)

3-羥基-丙烷-2-磺酸

2-羥基-丙烷-1-磺酸

化合物(四氫-噁噻嗪-二氧化物)：

化學中間體

保護基團：氯化芐

保護基團：氯甲酸苯甲酯

xvi.前體化合物的合成

合成：

將83.9g乙烯基磺酸鈉加入到400ml的苯甲醇溶液中，加入0.5g鈉(催化量)。混合物在攪拌下加熱到150℃且大部分乙烯基磺酸鈉進入溶液。3小時后，將混合物冷卻過夜，且有厚的固體結晶。將該固體在真空過濾，且然后懸浮于乙醇中、過濾并干燥。

產量：94.0g，ir：對應于期望的化合物(純度61.2％)。

xvii.1905的合成

將60克乙烯基磺酸鈉加入到1000ml的苯甲醇和0.5g鈉的溶液中。然后，將全部混合物在回流下攪拌并加熱。約3小時后，將過量的苯甲醇蒸餾并真空下去除，然后將其余的用乙醇煮沸。將該乙醇溶液過濾、濃縮、結晶至約1/2，得到37.3g的黃色棉絮狀物質。

該方法也可以用250g乙烯基磺酸鈉和2升苯甲醇如上所述處理重復，約208克被結晶。

該方法也可以用100g乙烯基磺酸鈉和1升苯甲醇如上所述處理重復，約105克被結晶。

該方法也可以用200g乙烯基磺酸鈉，如上所述處理重復，約130克被結晶。

xviii.1906的合成

將6.7g1905(重結晶)加入到50ml亞硫酰氯和1ml二甲基甲酰胺中。鈉鹽立即溶解，混合物加熱到40-50℃，20℃和真空下放置過夜直到濃縮。產量：9.8g，將其加入到50mlnaoh2n并充分攪拌。將該naoh溶液用chcl3洗滌，然后用濃鹽酸搖勻來沉淀并用na2so4捕捉、然后干燥和蒸餾。

用208g1905與1000ml亞硫酰氯和10ml二甲基甲酰胺混合重復該方法。將混合物回流且將過量的亞硫酰氯蒸餾掉直到干燥。產量為250g，如上處理。

xix.1907的合成

9.8g1906溶于氯仿(chcl3)(濁)中并在150ml濃氨水中的一部分中濃并攪拌。攪拌持續(xù)3小時，同時加熱至40-50℃，然后該混合物在真空下干燥并濃縮。

產量：3.1g深色的油

將該3.1g深色的油加入到50mlnaoh2n并充分攪拌。將該naoh溶液用chcl3洗滌，然后用濃鹽酸搖勻來沉淀并用na2so4捕捉、然后干燥和蒸餾。

產量：2.5g油

為了分析，在160℃下將0.5g的樣品冷凝，變成固體并從乙酸乙酯/苯中結晶3次。

熔點：75-76℃

分子式：c9h13no3s

mw：215.2

計算的：c＝50.23％、h＝6.09％、n＝6.51％、s＝14.86％

實際的：c＝50.14％、h＝6.15％、n＝6.35％、s＝14.79％

xx.1908的合成

將1.2g1907溶解于200ml乙酸乙酯中，并加入0.4g鈀活性炭。將該混合物在氫化釜中在100℃和50℃下氫化4小時。在室溫下，將混合物留下，在壓力下度過周末。然后將乙酸乙酯溶液過濾并在真空下干燥。

產量：1.1g油。

xxi.1908的合成

將2克1907溶解在200ml乙酸乙酯中并加入0.5g鈀/鈀/木炭。該混合物在高壓釜中在100℃和50℃下氫化。6個小時后，留下反應混合物冷卻過夜，然后過濾并在真空下蒸餾，直到其干燥成殘油。

產量：1.7g油。

加入ch2cl2、攪動并靜置、結晶，且在真空下抽吸來分離。重量：0.6g，熔點約40℃。

分析：

0.2g從乙酸乙酯中重結晶2次。

熔點：43-44℃

分子式：c2h7no3s

原子量：125

計算的：c＝19.22％、h＝5.65％、n＝11.21％、s＝25.65％

實際的：c＝19.20％、h＝5.67％、n＝11.07％、s＝25.73％

xxii.1909的合成

將19.9克1906溶解在100ml氯仿并加入23克純芐胺和200ml純氯仿的溶液。隨即，芐胺鹽酸鹽沉淀且反應混合物變暖。然后將混合物回流且將鹽酸鹽化合物通過吸取分離，然后將透明的chcl3母液放進真空干燥。

產量：27g黃色透明的油緩慢變成固體。

將該27g溶解于約20ml毫升乙酸乙酯并將n-己烷(適量)加入使該溶液變得接近渾濁。該混合物置于寒冷之中過夜，然后它結晶了。

產量：9.2g，熔點：50-53℃

為了分析，將1g在n-己烷中重結晶三次。熔點56-57℃。

xxiii.2260的合成

將0.675mol羥乙基磺酸鈉鹽(100.0g))和2.02mol氯化芐(233ml)混合在750ml帶有kpg-攪拌器的多頸燒瓶中。將該混合物在內部溫度70℃(外部溫度95℃)下加熱，然后用一小時將三乙胺(120ml)逐滴加入，然后外部溫度提高并維持到125℃。隨后，外界溫度提高到140℃，且內部溫度上升到130℃。固體聚集在攪拌器上，但又回到了懸浮狀態(tài)。鹽酸蒸汽散發(fā)。

將三乙胺30ml逐滴加入，然后再反應1.5小時。粘稠的黃色懸濁液形成。將該產物冷卻到內部溫度50℃，然后將300ml水加入并劇烈攪拌20分鐘，并將該混合物轉移到2l分液漏斗。然后，用100ml水沖洗燒瓶。

合并水相用280ml二氯甲烷洗滌兩次。

水相在40℃保存，同時將kcl加入到溶液中直至飽和(約130gkcl)。將該混合物通過凹槽過濾器過濾并儲存在冰箱中過夜。

將剩余的固體提取并干燥，得到30.85g，產率17.9％。

ir：oh帶是存在的，類似于前驅體。

將母液再次用kci處理并儲存(在35-40℃)在冰箱中過夜。

將來自用kcl的第二沉淀的固體濾出并干燥，得到60g＝34.9％且ir對應于期望產物。

固體1：用150mletoh煮沸并趁熱過濾。

通過用kcl重復沉淀、煮沸和結晶，得到32g的產物，產率為19％。

xxiv.2256的合成

40g牛磺酸酰胺鹽酸鹽、18g亞硝酸鈉和300ml蒸餾水在回流下一起煮沸直到沒有更多的氣體生成。然后，將透明的黃色溶液冷卻到50℃。

將30ml1nnaoh加入10.5g乙醛。將透明的黃色溶液留下在真空下干燥過周末。結果是得到銹紅色的蜂蜜樣殘渣，重量為37.6g，其用乙醇萃取。將乙醇溶液過濾并在旋轉蒸發(fā)器上濃縮來干燥。將得到的稠油殘渣用乙酸乙酯溶解。將該乙酸乙酯溶液過濾并濃縮。

這得到30.7g像銹一樣的顏色的稠油。從稠油中分離白色晶體。熔點約114-116℃

ir光譜確認得到的化合物具有化合物2256的結構：

在某些實施方式中，由本領域已知的實驗室玻璃器皿組成的升華裝置，可用于升華技術，以提純根據本發(fā)明的化合物。在某些實施方式中，將升華容器在真空和減壓下加熱。該化合物揮發(fā)和在冷卻的表面凝結為純化的化合物，留下了不揮發(fā)的殘渣的雜質。該冷卻的表面常常以冷的手指的形式出現(xiàn)。加熱停止并釋放真空后，升華的化合物可以從冷卻的表面收集。

在一個實施方式中，可以制備取代衍生物化合物2250?；衔?250的取代衍生物包括：

其中r可以是h或烷基或芳基。在某些實施方式中，r是c1到c6烷基。在某些實施方式中，r是甲基。

在某些實施方式中，化合物2250的衍生物是根據以下反應方案制備的：

亞牛磺酸

在一個實施方式中，本公開內容包括通過給有需要的對象施用腫瘤干細胞殺死有效量的?；橇_定、?；前芳捌浠旌衔飦須⑺滥[瘤干細胞的方法。?；橇_定和/或牛磺胺的腫瘤干細胞殺死有效量少于殺死腫瘤細胞所需的?；橇_定和/或牛磺胺的量。

在一些實施方式中，將?；橇_定、?；前芳捌浠旌衔镌谀[瘤干細胞殺死組合物中以約0.01到約500μg/ml的濃度給藥。在一些實施方式中，將?；橇_定、?；前芳捌浠旌衔镌谀[瘤干細胞殺死組合物中以約0.1到約100μg/ml的濃度給藥。在一些實施方式中，將牛磺羅定、牛磺胺及其混合物在腫瘤干細胞殺死組合物中以約10到約50μg/ml的濃度給藥。0.01μg/ml的?；橇_定有效地殺死體外組織培養(yǎng)中的腫瘤干細胞。

在一些實施方式中，將?；橇_定、牛磺胺及其混合物在腫瘤干細胞殺死組合物中以約0.001到約2％的濃度給藥。在一些實施方式中，將?；橇_定、?；前芳捌浠旌衔镌谀[瘤干細胞殺死組合物中以約0.01到約1.5％的濃度給藥。在一些實施方式中，將牛磺羅定、牛磺胺及其混合物在腫瘤干細胞殺死組合物中以約0.1到約1％的濃度給藥。

在一個實施方式中，將牛磺羅定、?；前芳捌浠旌衔镆约s0.01g到約50g、約0.1g到約30g、約0.5g到約10g或約1g到約5g的總日劑量給藥到有需要的對象來殺死腫瘤干細胞。

殺死腫瘤干細胞的?；橇_定、牛磺胺及其混合物的有效劑量是在約每天0.01-500mg/kg范圍內的劑量單位，優(yōu)選的是每天1-100mg/kg的劑量單位，最優(yōu)選的是每天5-50mg/kg的劑量單位。

在另一個實施方式中，本公開內容包括通過向對化合物有需要的對象給藥來殺死腫瘤干細胞的方法，該化合物選自如下化合物：

其中每個r獨立地為h、烷基或芳基，

這可以與牛磺羅定和/或?；前方Y合使用。這種技術提供了使用至少兩種具有不同半衰期的化合物殺死腫瘤干細胞的方法，從而擴大由此獲得的藥代動力學效應。在一個實施方式中，化合物2250可以與?；橇_定和/或牛磺胺結合使用。

實施例：

實施例1：

化合物2250抗腫瘤效應

介紹

基于牛磺羅定作為強有力的抗腫瘤劑的認識，geistlichpharma合成了類似物2250。

材料和方法

化合物2250和2％牛磺羅定(taurolidin)的溶液由本發(fā)明的受讓人，沃爾胡森(wolhusen)的蓋思特利制藥公司(geistlichpharmaag)，提供。

細胞系：人膠質瘤細胞系ln-229以及人結腸腺癌細胞系sw480如之前描述的那樣使用(rodak等.2005)。

細胞毒性試驗：分離的ln-229細胞接種在96孔板中100μl培養(yǎng)基中，密度是每孔10⁴個細胞。大約24小時后，當細胞達到70-80％融合時，更換培養(yǎng)基液并開始用化合物#2250(4–1000μg/ml)、?；橇_定(4–1000g/ml)或標準培養(yǎng)基處理。為每個樣品制備三份培養(yǎng)物。在25℃溫育24小時后，對剩余的貼壁存活細胞用之前描述的(rodack等.2005)結晶紫進行染色。通過測量在540nm處的吸光度測定細胞活力。將結果表達為殺滅率，其由100％細胞存活和百分比細胞存活的差給出。ec50值對應于引起50％細胞死亡的濃度。

結果

陽性對照：用?；橇_定溫育人成膠質細胞瘤細胞(ln-229)24小時后，用ec50＝45μg/ml測定濃度依賴的細胞毒性(表1、圖1)，該ec50值對應于用該細胞系(rodack等.2005)獲得的之前結果。

2250的測試：當將2250在與?；橇_定相同的實驗條件下溫育，觀察到相似的濃度依賴性細胞活力損失。引起細胞死亡的半最大濃度ec50＝50μg/μl(表1、圖1)。

sw480細胞的細胞毒性結果如圖2所示。

討論

化合物2250代表尋找?；橇_定型的新型抗腫瘤藥物的新的途徑。生物學上，該化合物像牛磺羅定一樣有效?；瘜W上，該化合物顯示與?；橇_定明顯不同的特征。通過醚-氧取代nh基團，避免了?；橇_定的雙環(huán)結構?；衔?250是單環(huán)結構和封閉結構的牛磺胺類似物。

機械地，結果表明，?；橇_定的抗腫瘤活性不太可能是由于甲氧基衍生物的形成，因為2250缺乏甲氧基基團。該化合物導致腫瘤細胞的起泡。

總結

化合物2250顯示出強力的體外抗腫瘤的活性，如人類膠質母細胞瘤細胞(細胞系ln-229)測定的那樣。其效力(ec50＝45μg/ml)與在相同細胞系進行測試的牛磺羅定(ec50＝50μg/ml)相當。

表1：2250和?；橇_定對ll-229成膠質細胞瘤細胞的細胞毒性

在次重復中測量所述值且od是在540nm的吸光度加減標準差(sd)。

實施例2：

對該新化合物2250(四氫1,4,5-噁噻嗪-4-二氧化物)進行了測試并發(fā)現(xiàn)其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有非常高的抗菌活性。對金黃色葡萄球菌的抗菌活性是?；前返募s兩倍高。

實施例3：

在穿孔板測試中，對化合物2250進行了測試并發(fā)現(xiàn)其對抗mrsa系188、189、193、194和195的活性很高。

通過顯示抗菌和抗腫瘤活性的組合，化合物2250特別適合腫瘤外科。

實施例4：

對每個本文鑒定的化合物2250、2255、2245、a1、a3、b1、b2或b3，進行對本文鑒定的癌癥的癌癥細胞系的測試，并且發(fā)現(xiàn)這些化合物對此類細胞系具有活性。

實施例5：

將每個本文所鑒定的化合物2250、2255、2245、a1、a3、b1、b2或b3，給患有本文鑒定的癌癥的患者給藥，并發(fā)現(xiàn)其對治療此類癌癥是有效的，并且在患者中使用安全。每種所述化合物與維生素d3、其衍生物、代謝物或類似物一起使用，發(fā)現(xiàn)所述組合增加了化合物的抗腫瘤效果。

實施例6：

通過gc,pyeunicamseries204fid，在體外測量在37℃下，化合物2250在人類新鮮血液的半衰期。

基準值：49.0ppm

1小時后：50.6ppm

2小時后：47.6ppm

3小時后：38.6-39.0ppm.

因此，化合物2250在人體血液中的半衰期大于24小時，這顯著高于牛磺羅定的半衰期，使用相同的測試，牛磺羅定的半衰期被認為是約30分鐘。

實施例7：

組織樣本是從新診斷的whoiv級的高級別腦膠質瘤患者(54±10歲的中年)中選取的，該組織樣本被機械地切碎、酶促地消化且游離細胞被過濾。將分離的腫瘤細胞培養(yǎng)成體細胞。通過在神經球條件(使用神經培養(yǎng)基)下從小鼠sma560的膠質瘤細胞系或從剛分離的人成膠質細胞瘤細胞中形成的神經球分離癌癥干細胞(cscs)。

細胞毒性試驗

如之前描述的(rodak等，j.neurosurg.102，1055-1068，2005)，將體膠質瘤腫瘤細胞用?；橇_定或?；前放囵B(yǎng)24小時或48小時。將cscs培養(yǎng)7天且隨后暴露于?；橇_定、?；前坊蛱婺虬?4小時。將剩余數(shù)量的貼壁細胞染色(結晶紫或alamar藍)并通過測量吸光度(540nm)定量。細胞的存活被表達為相對于在未經處理的對照培養(yǎng)物中的細胞數(shù)量的存活的細胞的百分數(shù)。結果以％殺死率表示或以作為半最大細胞毒性所需的劑量的ec50給出。

結果

牛磺羅定和?；前穼碜孕∈蟮陌┌Y細胞和癌癥干細胞的細胞毒性

小鼠sma560膠質瘤細胞系用于提供腫瘤體細胞和cscs。用各種濃度的?；橇_定和?；前?6.25、12.5、25、50、100、200μg/ml)溫育sma560體細胞后，24小時和48小時溫育后，細胞毒性被測定。對?；橇_定和?；前罚l(fā)現(xiàn)在24小時和48小時的溫育(圖3a、b)之間，具有明顯的劑量依賴性的細胞毒性，效力沒有明顯的區(qū)別。對?；橇_定的ec50值是34.6μg/ml且對牛磺胺的ec50值是19.3μg/ml(圖3c)。

小鼠csc從sma560膠質瘤細胞系中生成并培養(yǎng)7天。該cscs以用上述相同濃度的?；橇_定和?；前诽幚聿⒃?4小時后測定細胞毒性。如圖4所示，牛磺羅定和?；前范硷@示劑量依賴性細胞毒性，牛磺羅定對小鼠csc的ec50值是12.5μg/ml且?；前穼π∈骳sc的ec50值是10μg/ml。這些值首次證明對csc，牛磺羅定和?；前肥怯行У?。

牛磺羅定和?；前穼υ趶乃膫€不同的患者分離的人類csc中誘導細胞死亡。

cscs是從在四個患者中切除的成膠質細胞瘤組織中分離出來的。將相同范圍的濃度的?；橇_定和?；前啡缟蠎们以谂c藥物溫育24小時后測量細胞毒性。所有四個測試的成膠質細胞瘤cscs(gbm#3、#4、#5和#6)對?；橇_定和牛磺胺相似的敏感(圖5a、b)。?；橇_定的平均ec50值是13±2μg/ml，?；前返膃c50值是11±1.4μg/ml(表2)。在這些實驗中，比較了施用濃度范圍5μm到1000μm的牛磺羅定和?；前放c替莫唑胺(tim)的細胞毒性能力(圖2c)。tmz的平均ec50值是68.5±26μg/ml(圖2)。有趣的是，這個濃度比患者中測量的tmz(13.7μg/ml)血清峰水平高得多(portnow等,clincancerres15,7092-7098,2009)。

結果顯示牛磺羅定和?；前房梢杂行筩scs且這個發(fā)現(xiàn)建立在來自兩個物種小鼠和人類的膠質瘤cscs。

小鼠cscs是從小鼠膠質瘤細胞系(sma560)中生成的。明顯的，基于ec50值，與對應的膠質瘤體細胞相比，該cscs甚至對?；橇_定和牛磺胺更加敏感(對?；橇_定，約3倍和對?；前罚?倍)(圖3、4)。

自四個人類成膠質細胞瘤患者新分離的人類cscs，對?；橇_定和牛磺胺都同樣高度化學敏感。細胞毒性的ec50值分別是13±2ug/ml和11±1.4μg/ml(表2)。這些值表明，與對應的小鼠csc類似，人csc比人類成膠質細胞瘤體細胞(顯示50μg/ml范圍內的ec50值)對?；橇_定和?；前犯舾?約3到4倍)(rodak等,j.neurosurg.,102,1055-68,2005)。

表2：在來源于四個成膠質細胞瘤患者的癌癥干細胞(csc)中，由?；橇_定(tau)、?；前?tt)或替莫唑胺(tmz)引起的細胞毒性。ec50(μg/ml)＝與體外沒有處理的對照培養(yǎng)物相比，導致50％細胞死亡的藥物濃度。

實施例8：

對牛磺羅定和?；前窚y試對抗來源于小鼠膠質瘤細胞系的癌癥干細胞和人類癌癥干細胞。發(fā)現(xiàn)?；橇_定和牛磺胺對的小鼠膠質瘤細胞系(對?；橇_定ec50＝13±2μg/mi、對?；前積c50＝10μg/ml)以及新分離自四個成膠質細胞瘤患者的人癌癥干細胞(對?；橇_定ec50＝μg/mi、對?；前積c50＝11±1.4μg/ml)具有強的抗腫瘤活性。

實施例9：

對胰腺干細胞樣多細胞球體培養(yǎng)物的抗腫瘤作用。

多細胞球體是由生長在三維結構的腫瘤細胞組成，該三維結構模擬真正的腫瘤的生長、微環(huán)境條件和干細胞樣的特征。多細胞腫瘤球體(mcts)模型彌補了許多在單層培養(yǎng)物中看到的不足。在200–500μm尺度的球體發(fā)展氧化學梯度，營養(yǎng)素和代謝產物，同時具有類似腫瘤的形態(tài)和功能特征。因此，使用mcts模型的試驗允許對藥物的滲透進行評估，并且與單層培養(yǎng)物相比，該試驗在體內的成功是更加可預測的。mcts試驗是在標準單層和體內腫瘤之間的中等復雜程度的腫瘤模型系統(tǒng)。

將胰腺腫瘤細胞(panctu-1、bxpc-3、miapaca-2、aspc1)和胰腺原發(fā)腫瘤細胞(bo80)接種于特殊干細胞培養(yǎng)基中的超低粘附板里。

胰腺腫瘤細胞(aspc1、miapaca-2、panctui、bxpc-3)和胰腺原發(fā)腫瘤細胞(bo80)在單層培養(yǎng)培養(yǎng)物中生長，然后在特殊干細胞培養(yǎng)基條件下，接種于超低粘附板來形成多細胞球體并通過細胞過濾器來排除聚集物。

用腫瘤細胞系aspc-1、bxpc-3和hct-116中用750-1000μm的化合物2250實現(xiàn)細胞活力的半最大抑制。這些作用與那些在膠質瘤細胞系ln-229中觀察到的相似。細胞死亡的誘發(fā)是由于細胞凋亡和壞死(最可能是壞死性凋亡)。結果發(fā)現(xiàn)，加入還原劑n-乙酰半胱氨酸可防止這種程序性細胞死亡并且沒有涉及半胱天冬酶。因此，具有氧化還原導向的作用機制。

化合物2250抑制抑制胰腺腫瘤細胞(aspc-1、bxpc-3和hct-116)的生長，半最大濃度為300μm，這比引起細胞毒性所需的濃度低得多。

如圖8所示，將多細胞的胰腺腫瘤(panctui或bxpc-3)球體作為對照、?；橇_定處理的(500μm)或化合物2250處理的(1000μm)樣品測試48小時(a列)。處理結束后，每個細胞懸浮液再次通過45μm細胞過濾器，以分析殘余聚集體的穩(wěn)定性(b列)。

圖9a和9b顯示了panctui多細胞球體培養(yǎng)物cd133的含量的facs分析結果。cd133是熟知的并得到確認的干細胞的標志。結果表明，與生長在單層培養(yǎng)中的panctui相比，在胰腺癌panctui的多細胞球體培養(yǎng)物中cd133陽性細胞數(shù)量富集10倍(b)。同型igg用作陰性對照(a)。結果說明?；橇_定和化合物2250對像多細胞球體培養(yǎng)物的胰腺干細胞具有抗腫瘤的作用。

實施例10

?；橇_定和化合物2250作為惡性胰腺癌中的抗腫瘤制劑的體內研究。

在裸鼠(nmri-foxn1nu/nu)上分析?；橇_定和化合物2250的作用。將1x10⁷個腫瘤細胞(panctu-i和miapaca2)皮下注射到脅部。動物被隨機分為三組：對照組；用?；橇_定(trd)腹膜(i.p.)處理的組和用化合物2250(ndtrlt)腹膜(i.p.)處理的組。

在處理開始之前，腫瘤生長到200mm³大小。在交替日，小鼠用500mg/kg體重(bw)處理。

如圖10a所示，與對照組相比，?；橇_定的給藥明顯降低了miapaca2的腫瘤體積(約2倍)。

如圖10b所示，與對照組相比，化合物2250的給藥明顯降低了miapaca2的腫瘤體積(約3倍)。

如圖10c所示，與對照組相比，牛磺羅定的給藥明顯降低了panctui的腫瘤體積(約3倍)。

如圖10d所示，與對照組相比，化合物2250的給藥明顯降低了panctui的腫瘤體積(約2倍)。

應用的牛磺羅定和化合物2250劑量在研究中顯示出對小鼠沒有毒性作用。在全部兩個腫瘤細胞系模型中，腫瘤生長得到了明顯的降低。

與對照組相比，從第9天起(panctui)和第11天起(miapaca2)腫瘤的生長(體積)明顯下降。500mg/kg劑量(i.p.)的耐受性良好，沒有明顯的毒性跡象。

如圖11a所示，觀察胰腺原發(fā)性腫瘤(bo73)的異種移植模型15天并發(fā)現(xiàn)與對照組相比，?；橇_定的給藥稍稍縮小了相對腫瘤體積，且與對照組相比，化合物2250進一步縮小了相對腫瘤體積。然而，腫瘤體積的差異沒有統(tǒng)計學意義，這可能是因為研究時間短，腫瘤生長緩慢。圖11b中，觀察胰腺原發(fā)性腫瘤(bo73)的異種移植模型23天，與對照組相比，?；橇_定和化合物2250的給藥大大縮小了相對腫瘤體積。

?；橇_定和/或化合物2250的給藥，例如腹腔內給藥，抑制了體內腫瘤生長。