本發(fā)明涉及生物篩查領(lǐng)域，特別涉及篩查南方菜豆花葉病毒的rpa-iac方法、引物及試劑盒。

背景技術(shù)：

南方菜豆花葉病毒(southernbeanmosaicvirus,sbmv)為南方菜豆花葉病毒屬(sobemovirus)成員，自然寄主多為豆科植物，包括大豆、菜豆、綠豆、豇豆等；人工接種則可侵染赤小豆、紅花菜豆、棉豆、豌豆、蠶豆、草木樨等約12個(gè)屬23種植物。汁液接種最易傳毒。種子帶毒傳毒，菜豆種傳率1～5％，豇豆種傳率比較高，一般為5～40％。如果種子發(fā)芽，其幼苗與感病的汁液接觸或種植在靠近感病植物附近的土壤中也可傳播病毒。該病毒一旦傳入我國并定殖下來，將很難根除，會對我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成重大損失。因此，該病毒已被列入我國新修訂的植物檢疫性有害生物名單中，由于目前尚無有效的病毒防治方法，因此加強(qiáng)該病毒的檢疫篩查工作是防止這種病毒傳入的最有效的途徑之一。我國每年從國外進(jìn)口大量的大豆等植物及其產(chǎn)品，為防止該危險(xiǎn)性病毒的傳入，需要建立該病毒快速準(zhǔn)確的篩查技術(shù)。

目前篩查南方菜豆花葉病毒的方法主要包括血清學(xué)篩查、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(rt-pcr)技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光rt-pcr篩查技術(shù)等。血清學(xué)方法需要制備血清，較為繁瑣，且篩查周期長，并因南方菜豆花葉病毒存在不同株系易導(dǎo)致漏檢現(xiàn)象；rt-pcr技術(shù)需要熱循環(huán)設(shè)備；實(shí)時(shí)熒光rt-pcr技術(shù)需要昂貴的篩查設(shè)備，篩查成本較高，不適合基層和小型實(shí)驗(yàn)室推廣使用。rpa(recombinasepolymeraseamplifcation)是一項(xiàng)新型的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，其主要原理為利用重組酶和引物在模板dna上搜索到與之完全互補(bǔ)配對的序列時(shí)，在單鏈dna結(jié)合蛋白的幫組下使模板dna解鏈，引物與模板dna開始配對，并在dna聚合酶的作用下復(fù)制延伸。該方法僅需1對引物即可完成擴(kuò)增，不需要復(fù)雜的引物設(shè)計(jì)過程；只需要37℃下恒溫反應(yīng)，不需要特殊的熱循環(huán)設(shè)備；反應(yīng)時(shí)間短；擴(kuò)增產(chǎn)物有特定大小的條帶，結(jié)果易于判斷。而rpa與擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)(internalamplificationcontrol,iac)的結(jié)合使用則會有效控制假陰性的出現(xiàn)，大大提高了檢測的準(zhǔn)確性，避免了漏檢，能夠更有效的篩查防控該病毒的發(fā)生危害。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種靈敏、準(zhǔn)確、簡便和快速的基于rpa-iac技術(shù)的篩查南方菜豆花葉病毒的方法，本發(fā)明還提供了用于該方法的特異性好、靈敏度高、篩查時(shí)間短、質(zhì)控效果佳、不需要特殊的儀器和適用范圍廣的rpa-iac引物和含有該rpa-iac引物的試劑盒。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明第一方面提供了一種引物對和內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列，所述引物對包含seqidno：1所示的核苷酸序列和seqidno：2所示的核苷酸序列，所述內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列包含seqidno：3所示的核苷酸序列。

本發(fā)明第二方面提供了所述的引物對和內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列在制備篩查或輔助篩查南方菜豆花葉病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

在一優(yōu)選例中，所述制備篩查或輔助篩查南方菜豆花葉病毒的產(chǎn)品包括：制備篩查或輔助篩查待測植物樣品是否感染南方菜豆花葉病毒的產(chǎn)品，以及制備篩查或輔助篩查待測病毒是否為或候選為南方菜豆花葉病毒的產(chǎn)品。

本發(fā)明第三方面提供了一種試劑盒，包括上述的引物對和包含有上述的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒。

在一優(yōu)選例中，還包括rpa-iac恒溫?cái)U(kuò)增試劑；

在一優(yōu)選例中，所述rpa-iac恒溫?cái)U(kuò)增試劑包括來自twistdx公司的rpa擴(kuò)增試劑盒twistampbasickits所包含的試劑。

在一優(yōu)選例中，還包括植物總rna提取試劑。

在一優(yōu)選例中，所述植物總rna提取試劑包括來自天根生物科技有限公司貨號為dp432的植物總rna提取試劑盒所包含的試劑。

在一優(yōu)選例中，還包括反轉(zhuǎn)錄試劑。

在一優(yōu)選例中，所述反轉(zhuǎn)錄試劑包括來自takara的貨號為rr014a的primescriptrt-pcrkit所包含的試劑。

本發(fā)明第四方面提供了一種試劑盒在篩查或輔助篩查南方菜豆花葉病毒，或制備篩查或輔助篩查南方菜豆花葉病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

在一優(yōu)選例中，所述篩查或輔助篩查南方菜豆花葉病毒包括：篩查或輔助篩查待測植物樣品是否感染南方菜豆花葉病毒，以及篩查或輔助篩查待測病毒是否為或候選為南方菜豆花葉病毒；

在一優(yōu)選例中，所述制備篩查或輔助篩查南方菜豆花葉病毒的產(chǎn)品包括：制備篩查或輔助篩查待測植物樣品是否感染南方菜豆花葉病毒的產(chǎn)品，以及制備篩查或輔助篩查待測病毒是否為或候選為南方菜豆花葉病毒的產(chǎn)品。

本發(fā)明第五方面提供了一種篩查或輔助篩查南方菜豆花葉病毒的方法，包括使用所述的引物對和包含有上述的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒，或所述試劑盒的步驟。

在一優(yōu)選例中，所述篩查或輔助篩查南方菜豆花葉病毒包括：篩查或輔助篩查待測植物樣品是否感染南方菜豆花葉病毒；以及篩查或輔助篩查待測病毒是否為或候選為南方菜豆花葉病毒。

在一優(yōu)選例中，所述的方法包括如下步驟：

1)rpa-iac擴(kuò)增

從待測植物樣品或待測病毒中提取總rna，然后將其反轉(zhuǎn)錄成cdna，再以cdna為模板與所述的引物對和包含有上述的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒，或所述試劑盒進(jìn)行rpa-iac擴(kuò)增。

2)根據(jù)rpa-iac擴(kuò)增的結(jié)果判斷待測植物樣品是否感染南方菜豆花葉病毒，或待測病毒是否為或候選為南方菜豆花葉病毒。

在一優(yōu)選例中，所述rpa-iac擴(kuò)增的結(jié)果判斷的標(biāo)準(zhǔn)為：

若所述rpa-iac擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物僅有大小為169bp的目標(biāo)基因片段，或同時(shí)擁有大小分別為337bp、169bp的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增片段和目標(biāo)基因片段，則判定為待測植物樣品感染南方菜豆花葉病毒或待測病毒為或候選為南方菜豆花葉病毒；若所述rpa擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物只有大小為337bp的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增片段，未含有大小為169bp的目標(biāo)基因片段，則判定為待測植物樣品未感染南方菜豆花葉病毒或待測病毒不為或候選不為南方菜豆花葉病毒；若所述rpa擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物未含有大小為337bp的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增片段，同時(shí)也未含有大小為169bp的目標(biāo)基因片段，判定為反應(yīng)為假陰性，需要重新進(jìn)行篩查。

在一優(yōu)選例中，步驟1)中從待測植物樣品中提取總rna是采用天根生物科技有限公司貨號為dp432的植物總rna提取試劑盒進(jìn)行的；

步驟1)中將總rna反轉(zhuǎn)錄成cdna是采用takara的貨號為rr014a的primescriptrt-pcrkit進(jìn)行的。

在一優(yōu)選例中，所述rpa-iac擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下：

含有凍干酶粉的0.2mltwistamp反應(yīng)管

再水化緩沖液29.5μl

seqidno：1所示的引物和seqidno：2所示的引物各2μl，引物的終濃度均為0.4μmol/l

包含有seqidno：3所示的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒20ng

cdna50ng

醋酸鎂溶液2.5μl，濃度為280mmol/l

去離子水補(bǔ)足至50μl

在一優(yōu)選例中，所述rpa-iac擴(kuò)增的反應(yīng)條件如下：所述rpa-iac擴(kuò)增的溫度為37℃，時(shí)間為40min。

本發(fā)明提到的待測植物樣品，可為植物的根﹑莖﹑葉等部分的成長的植物體；而待測病毒則是一種純病毒或至少二種以上的病毒的混合。

本發(fā)明涉及的“內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增片段”是添加到pcr反應(yīng)體系中用以指示假陰性現(xiàn)象的一段人工構(gòu)建dna序列或者是一段致病菌的保守基因序列。擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)作用的主要原理是：將擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)添加到pcr反應(yīng)體系中，使之與目的基因進(jìn)行共同擴(kuò)增，如果在反應(yīng)體系中存在一些抑制因素，則擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)和目的基因的擴(kuò)增反應(yīng)都將受到抑制，從而達(dá)到指示pcr反應(yīng)假陰性的目的。

本發(fā)明的有益效果包括：

(1)本發(fā)明針對南方菜豆花葉病毒設(shè)計(jì)特異性rpa-iac引物，建立了南方菜豆花葉病毒rpa-iac篩查方法，可對南方菜豆花葉病毒進(jìn)行定性篩查。

(2)本發(fā)明涉及的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列與南方菜豆花葉病毒基因組非同源，可在確保目標(biāo)序列擴(kuò)增效率的同時(shí)有效規(guī)避篩查假陰性的發(fā)生。

(3)本發(fā)明針對南方菜豆花葉病毒僅用一對引物即可完成擴(kuò)增，省去了lamp等其它恒溫?cái)U(kuò)增方法需要的多對引物的復(fù)雜設(shè)計(jì)過程；本發(fā)明的引物擴(kuò)增只需要37℃下恒溫反應(yīng)即可，不需要特殊的熱循環(huán)設(shè)備；反應(yīng)時(shí)間僅需40min，篩查時(shí)間短；不像lamp產(chǎn)物的彌散帶，rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物根據(jù)引物設(shè)計(jì)位點(diǎn)具有特定大小的條帶，其結(jié)果易于判斷。

(4)本發(fā)明的rpa-iac擴(kuò)增引物特異性好、靈敏度高且適用范圍廣。

(5)本發(fā)明建立的南方菜豆花葉病毒rpa-iac篩查方法，靈敏、準(zhǔn)確、簡便和快速，對進(jìn)出境相關(guān)植物及產(chǎn)品檢驗(yàn)檢疫具有指導(dǎo)意義。

附圖說明

圖1是采用本發(fā)明的rpa-iac引物對多種病毒進(jìn)行特異性篩查的瓊脂糖凝膠電泳圖，共有八條泳道：其中m為markerdl1000，1為南方菜豆花葉病毒的rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物，2為菜豆莢斑駁病毒的rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物，3為大豆花葉病毒的rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物，4為南芥菜花葉病毒的rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物，5為煙草環(huán)斑病毒的rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物，6為陰性對照。

圖2是采用本發(fā)明的rpa-iac引物對南方菜豆花葉病毒進(jìn)行靈敏度篩查的瓊脂糖凝膠電泳圖，共有九條泳道：其中m為markerdl500，1-7分別為南方菜豆花葉病毒cdna的10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6稀釋度的rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物，8為陰性對照。

具體實(shí)施方式：

除非特殊說明，本發(fā)明所用術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的一般含義。

下面參考具體實(shí)施例和附圖，對本發(fā)明進(jìn)行說明，需要說明的是，這些實(shí)施例僅僅是說明性的，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供了一種rpa-iac引物對和內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列及其應(yīng)用。

rpa-iac引物的篩選方法為：針對南方菜豆花葉病毒基因組(genbank登錄號af055888.1)的保守序列，設(shè)計(jì)篩查或輔助篩查南方菜豆花葉病毒的rpa-iac引物，設(shè)計(jì)了多條rpa-iac引物后進(jìn)行了大量的篩選實(shí)驗(yàn)，綜合其特異性、靈敏度和所使用的各引物與rpa-iac擴(kuò)增試劑盒的適配性，最終篩選出特異性好、靈敏度高且適用范圍廣的一對rpa-iac引物。

此rpa-iac引物具體序列如下：

上游引物：5′-tggaagccccggccactcaatcgaggaggccc-3′(seqidno：1)；

下游引物：5′-actgtcacacctccagccgttctaagcgatggt-3′(seqidno：2)。

內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的設(shè)計(jì)和合成：為避免相近細(xì)菌的同源干擾和篩查人員的個(gè)體核酸污染，經(jīng)過綜合分析考量和反復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以高度保守的豬種屬特異性基因β-actin的部分核酸序列為基礎(chǔ)，兩端分別連接上述的上游引物的序列和下游引物的序列，形成如下所示序列大小為337bp的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列：

tggaagccccggccactcaatcgaggaggcccgttcgagaccttcaacaccccagccatgtacgtggccatccaggcggtgctgtccctgtacgcctctggccgcaccactggcatcgtgatggactccggagacggggtcacccacacggtgcccatctacgaggggtacgccctgccccacgccatcctgcgtctggacctggctggccgggacctgaccgactacctcatgaagatcctgacggagcggggctacagcttcaccaccacggccgagcgggagatcgtgcgggacatcaaggaccatcgcttagaacggctggaggtgtgacagt(seqidno：3)

上述seqidno：3中，大寫序列為添加的上述上游引物的原始序列和下游引物的反向互補(bǔ)序列，小寫序列272bp來源于genbank登錄號為dq452569.1且標(biāo)題為susscrofabetaactin(actb)gene,partialcds中489-760的一段序列，并經(jīng)過理論和實(shí)踐的同源性驗(yàn)證。

上述rpa-iac引物對和內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的合成工作，均由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。

上述rpa-iac引物對和內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列可應(yīng)用到制備篩查或輔助篩查南方菜豆花葉病毒的產(chǎn)品上，例如制備篩查或輔助篩查待測植物樣品是否感染南方菜豆花葉病毒的產(chǎn)品，或制備篩查或輔助篩查待測病毒是否為或候選為南方菜豆花葉病毒的產(chǎn)品。

實(shí)施例2

本實(shí)施例提供了一種試劑盒及其應(yīng)用，所述試劑盒包括：

(1)植物總rna提取試劑；

(2)反轉(zhuǎn)錄試劑；

(3)seqidno：1、seqidno：2(均來自實(shí)施例1)，以及含有如seqidno：3所示內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒；；

(4)含凍干酶粉管；

(5)再水化緩沖液；

(6)醋酸鎂溶液。

所述植物總rna提取試劑為來自天根生物科技有限公司植物總rna提取試劑盒(貨號:dp432)的試劑；所述反轉(zhuǎn)錄試劑為來自takara公司primescriptrt-pcrkit(貨號:rr014a)的試劑。

上述含凍干酶粉管、再水化緩沖液(rehydrationbuffer)和醋酸鎂溶液(280mmol/l)均來源于rpa擴(kuò)增試劑盒twistampbasickits(twistdx公司，貨號:tabas03kit)。

所述含有如seqidno：3所示內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒的構(gòu)建：將實(shí)施例1合成的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列連接到通用載體puc57上，得到含有如seqidno：3所示內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的陽性質(zhì)粒。具體為：采用常規(guī)t4噬菌體dna連接酶連接到通用載體puc57，并制備成陽性質(zhì)粒凍干粉。在本發(fā)明中此構(gòu)建是由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。按照拷貝數(shù)ncopies/μl＝pcr片段的質(zhì)量(g/μl)/(650g/mol×堿基數(shù))×(6.02×10²³)計(jì)算，將陽性質(zhì)粒干粉稀釋至1.83×10³copies/μl。

利用seqidno：1、seqidno：2和上述含有如seqidno：3所示內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒針對南方菜豆花葉病毒進(jìn)行rpa-iac擴(kuò)增，得到的rpa-iac目標(biāo)基因擴(kuò)增產(chǎn)物和擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)產(chǎn)物的大小分別為169bp、337bp。

實(shí)驗(yàn)證明，上述植物總rna提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑與rpa擴(kuò)增試劑盒twistampbasickits，以及其與seqidno：1、seqidno：2和含有如seqidno：3所示內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒的聯(lián)合使用，效果更加優(yōu)越，具體表現(xiàn)在特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、靈敏度高以及質(zhì)控效果佳。

上述試劑盒可應(yīng)用于篩查或輔助篩查南方菜豆花葉病毒上，例如篩查或輔助篩查待測植物樣品是否感染南方菜豆花葉病毒，或篩查或輔助篩查待測病毒是否為或候選為南方菜豆花葉病毒；還可以用來制備篩查或輔助篩查南方菜豆花葉病毒的產(chǎn)品，例如制備篩查或輔助篩查待測植物樣品是否感染南方菜豆花葉病毒的產(chǎn)品，或制備篩查或輔助篩查待測病毒是否為或候選為南方菜豆花葉病毒的產(chǎn)品。

實(shí)施例3

本實(shí)施例提供了一種篩查或輔助篩查南方菜豆花葉病毒的方法，例如篩查或輔助篩查待測植物樣品是否感染南方菜豆花葉病毒，或篩查或輔助篩查待測病毒是否為或候選為南方菜豆花葉病毒，該方法使用了實(shí)施例1的rpa-iac引物和含有上述內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒，或?qū)嵤├?的試劑盒。

上述方法包括如下步驟：

1、rna的提取及cdna的合成

采用天根生物科技有限公司的貨號為dp432的植物總rna提取試劑盒，根據(jù)其說明書提取待測植物樣品的總rna；并采用takara的貨號為rr014a的primescriptrt-pcrkit，根據(jù)其說明書將前述提取的總rna作為模板反轉(zhuǎn)錄獲得cdna，將獲得的cdna保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

2、rpa-iac擴(kuò)增

以cdna為模板，添加實(shí)施例2中含有如seqidno：3所示內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒，采用實(shí)施例1的上游引物和下游引物(序列分別為seqidno：1和seqidno：2)進(jìn)行rpa-iac擴(kuò)增，得到rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物，同時(shí)設(shè)置陰性對照(模板為超純水)。

rpa-iac擴(kuò)增體系(50μl)的配制方法如下：向含有凍干酶粉的0.2mltwistamp反應(yīng)管中加入再水化緩沖液(rehydrationbuffer)29.5μl、上游引物和下游引物(實(shí)施例1的上游引物和下游引物)各2μl(引物的終濃度均為0.4μmol/l)，含有如seqidno：3所示內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒1μl(1.83×10³copies)(來自實(shí)施例2)，模板cdna50ng，最后再加入醋酸鎂溶液2.5μl(280mmol/l)，用去離子水補(bǔ)足至50μl。

rpa-iac擴(kuò)增反應(yīng)條件：將上述rpa-iac擴(kuò)增體系充分混勻，置于37℃的金屬浴上反應(yīng)40min，得到rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物。

3、rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測

rpa-iac反應(yīng)結(jié)束后，向上述rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物中加入50μl苯酚/氯仿(1:1)溶液，充分混勻后12000rpm離心2min，取5μl上清液于1.5％瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果，并對rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序(在建立方法過程中均進(jìn)行了測序驗(yàn)證，本文不再贅述)。

所述rpa-iac擴(kuò)增的結(jié)果判斷的標(biāo)準(zhǔn)為：

若所述rpa-iac擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物僅有大小為169bp的目標(biāo)基因片段，或同時(shí)擁有大小分別為337bp、169bp的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增片段和目標(biāo)基因片段，則判定為待測植物樣品感染南方菜豆花葉病毒；若所述rpa擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物只有大小為337bp的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增片段，未含有大小為169bp的目標(biāo)基因片段，則判定為待測植物樣品未感染南方菜豆花葉病毒；若所述rpa擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物未含有大小為337bp的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增片段，同時(shí)也未含有大小為169bp的目標(biāo)基因片段，判定為反應(yīng)為假陰性，需要重新進(jìn)行篩查。

實(shí)施例4

本實(shí)施例對實(shí)施例3建立的篩查或輔助篩查南方菜豆花葉病毒的方法進(jìn)行了有效性驗(yàn)證。

步驟一：rna的提取及cdna的合成

采用天根生物科技有限公司的貨號為dp432的植物總rna提取試劑盒，根據(jù)其說明書提取感染南方菜豆花葉病毒的大豆葉片(保存于中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院)的rna；并采用takara的貨號為rr014a的primescriptrt-pcrkit，根據(jù)其說明書將前述提取的rna作為模板反轉(zhuǎn)錄獲得cdna，將獲得的cdna保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

步驟二：rpa-iac擴(kuò)增

以步驟一獲得的cdna為模板，添加含有如seqidno：3所示內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒，采用實(shí)施例1的上游引物和下游引物進(jìn)行rpa-iac擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)置陰性對照(模板為超純水)。

rpa-iac擴(kuò)增體系(50μl)的配制方法如下：向含有凍干酶粉的0.2mltwistamp反應(yīng)管中加入再水化緩沖液(rehydrationbuffer)29.5μl、上游引物和下游引物(實(shí)施例1的上游引物和下游引物)各2μl(引物的終濃度均為0.4μmol/l)，含有如seqidno：3所示內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒1μl(1.83×10³copies)(來自實(shí)施例2)，模板cdna50ng，最后再加入醋酸鎂溶液2.5μl(280mmol/l)，用去離子水補(bǔ)足至50μl。

rpa-iac擴(kuò)增反應(yīng)條件：將上述rpa-iac擴(kuò)增體系充分混勻，置于37℃的金屬浴上反應(yīng)40min，得到rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物。

步驟三：rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測

rpa-iac反應(yīng)結(jié)束后，向rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物中加入50μl苯酚/氯仿(1:1)溶液，充分混勻后12000rpm離心2min，取上清液5μl于1.5％瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果，并對rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。

結(jié)果顯示南方菜豆花葉病毒的rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物含有1條大小為169bp的條帶和1條大小為337bp的條帶，而陰性對照僅在337bp處有擴(kuò)增條帶，說明本發(fā)明的基于rpa-iac引物及rpa-iac試劑盒建立的篩查或輔助篩查南方菜豆花葉病毒的方法可以有效篩查南方菜豆花葉病毒。

實(shí)施例5

本實(shí)施例對實(shí)施例1的rpa-iac引物進(jìn)行了特異性驗(yàn)證，所用的供試材料如下：南方菜豆花葉病毒、菜豆莢斑駁病毒、大豆花葉病毒、南芥菜花葉病毒和煙草環(huán)斑病毒共5種病毒感染的大豆葉片，5種病毒如表1所示，編號依次為1、2、3、4、5。上述供試材料均保存于中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，并設(shè)陰性對照(模板為超純水)。

表1供試病毒

采用天根生物科技有限公司的貨號為dp432的植物總rna提取試劑盒，根據(jù)其說明書分別提取上述5種病毒感染的大豆葉片的rna；并采用takara的貨號為rr014a的primescriptrt-pcrkit，根據(jù)其說明書將前述提取的rna作為模板反轉(zhuǎn)錄獲得cdna。

以cdna為模板，進(jìn)行rpa-iac擴(kuò)增和rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測，rpa-iac擴(kuò)增和rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測的方法同實(shí)施例4的步驟二和步驟三。

結(jié)果分析：

結(jié)果如圖1所示，組1-組5分別對應(yīng)泳道1-5，陰性對照對應(yīng)泳道6，泳道1顯示在337bp和169bp處均有擴(kuò)增條帶，根據(jù)實(shí)施例3的判斷標(biāo)準(zhǔn)，為陽性，即順利檢出南方菜豆花葉病毒，其余泳道2-泳道6顯示只有在337bp處有擴(kuò)增條帶，根據(jù)實(shí)施例3的判斷標(biāo)準(zhǔn)，判斷為未感染南方菜豆花葉病毒，且排除了假陰性可能性，進(jìn)一步提高了結(jié)果的可靠性。綜上，上述陽性判定和陰性判定結(jié)果均準(zhǔn)確且所有組的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)均成功擴(kuò)增，由此證明本發(fā)明實(shí)施例1的引物對和內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列具有有效性、高特異性和良好指示性；進(jìn)一步的，本發(fā)明基于引物對和內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列及試劑盒建立的篩查或輔助篩查南方菜豆花葉病毒的方法能夠準(zhǔn)確的對南方菜豆花葉病毒進(jìn)行篩查。

實(shí)施例6

本實(shí)施例對實(shí)施例1的rpa-iac引物進(jìn)行了靈敏度的驗(yàn)證，其方法如下：

步驟一：cdna的獲取

參照實(shí)施例5的方法對感染南方菜豆花葉病毒的大豆葉片(保存于中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院)提取rna并反轉(zhuǎn)錄獲取cdna(濃度為50ng/μl)，并將獲取的cdna進(jìn)行梯度稀釋，分別得到稀釋度為10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6的南方菜豆花葉病毒的cdna。

步驟二：rpa-iac擴(kuò)增

分別以上述步驟一得到的稀釋度為10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6的南方菜豆花葉病毒的cdna為模板(模板量均取1μl)進(jìn)行rpa-iac擴(kuò)增和rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測，并設(shè)陰性對照(模板為超純水)。rpa-iac擴(kuò)增的方法同實(shí)施例4的步驟二。

步驟三：電泳檢測

rpa-iac擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，分別向rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物中加入50μl苯酚/氯仿(1:1)溶液，充分混勻，12000rpm離心2min，取5μl上清液于1.5％瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。rpa-iac電泳結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出，本發(fā)明的rpa-iac方法的靈敏度為10^-3稀釋度。組1-4均在169bp處有條帶且組4-8在337bp處有條帶，說明了組1-8的結(jié)果均有效且組5-組8無假陰性可能性，同時(shí)也說明本發(fā)明實(shí)施例1的引物對具有較高的靈敏度，可篩查出樣品中僅含有0.05ng的微量dna；而后進(jìn)行對應(yīng)的rpa擴(kuò)增(擴(kuò)增體系里不添加實(shí)施例2中含有如seqidno：3所示內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒，其余條件相同)，其靈敏度結(jié)果同rpa-iac擴(kuò)增，由此可知添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)并沒有降低篩查的靈敏度。

對比例1

實(shí)際上，在尋求到本發(fā)明的引物對之前，嘗試了本發(fā)明的包含有內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒(來自實(shí)施例2)與非常多的引物對組合，在本對比例中只摘取其中之若干進(jìn)行闡述，其余不予贅述，具體為：

利用實(shí)施例1的rpa-iac引物對以及用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)并選取其中排分靠前的rpa-iac引物組合1-6，用實(shí)施例3建立的篩查或輔助篩查南方菜豆花葉病毒的方法對50份大豆樣品進(jìn)行了篩查，同時(shí)用中國檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《sn/t3438-2012南方菜豆花葉病毒檢疫鑒定方法》中的方法對這50份大豆樣品進(jìn)行了南方菜豆花葉病毒的篩查，靈敏度試驗(yàn)的取樣和模板濃度梯度的設(shè)置均按照實(shí)施例6進(jìn)行，篩查結(jié)果如表2所示。

表2不同引物對篩查樣品中南方菜豆花葉病毒的結(jié)果

結(jié)果顯示：鑒于存在包含有內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒的情況下本發(fā)明引物對的篩查結(jié)果與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)篩查方法的篩查結(jié)果一致，這說明本發(fā)明引物對組合特異性強(qiáng)、靈敏度高且重復(fù)性很好，而采用引物設(shè)計(jì)軟件隨機(jī)選取的若干種rpa-iac引物對則或多或少的存在特異性不強(qiáng)、靈敏度不高、重復(fù)性不好以及干擾擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)等各種缺陷。

對比例2

本對比例提供了不同的試劑與本發(fā)明的引物對(來自實(shí)施例1)、包含有內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒(來自實(shí)施例2)組合在一起篩查南方菜豆花葉病毒時(shí)的篩查結(jié)果對比。

各種試劑與本發(fā)明的引物對和包含有內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒組合:

組合1：本發(fā)明引物對和包含有內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒+某市售植物總rna提取試劑盒1+某市售反轉(zhuǎn)錄試劑盒1+某市售rpa擴(kuò)增試劑盒1

組合2：本發(fā)明引物對和包含有內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒+某市售植物總rna提取試劑盒2+某市售反轉(zhuǎn)錄試劑盒2+某市售rpa擴(kuò)增試劑盒2

組合3：本發(fā)明引物對和包含有內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒+某市售植物總rna提取試劑盒3+某市售反轉(zhuǎn)錄試劑盒3+某市售rpa擴(kuò)增試劑盒3

本發(fā)明組合：本發(fā)明引物對和包含有內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒+來自天根生物科技有限公司貨號為dp432的植物總rna提取試劑盒所包含的試劑+來自takara的貨號為rr014a的primescriptrt-pcrkit所包含的試劑+來自twistdx公司的rpa擴(kuò)增試劑盒twistampbasickits所包含的試劑。

利用上述本發(fā)明組合篩查南方菜豆花葉病毒時(shí)，其方法采用實(shí)施例3中的方法進(jìn)行。靈敏度實(shí)驗(yàn)的取樣和模板濃度稀釋梯度的設(shè)置均按照實(shí)施例6進(jìn)行。

利用上述組合1、組合2和組合3篩查南方菜豆花葉病毒時(shí)，凡是用到市售試劑盒，均按照其說明書進(jìn)行操作進(jìn)行，其余條件均同本發(fā)明組合。同時(shí)設(shè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(見對比例1)檢測。

受檢樣品同對比例1中的50份大豆樣品。

篩查結(jié)果如表3所示。

表3不同試劑組合篩查樣品中南方菜豆花葉病毒的結(jié)果

結(jié)果顯示：本發(fā)明引物對、包含有內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒和各特定試劑的組合的篩查結(jié)果與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)篩查方法的篩查結(jié)果一致，這說明本發(fā)明引物對、包含有內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒和各特定試劑的組合所組成的試劑盒具有特異性強(qiáng)、靈敏度高且重復(fù)性好的優(yōu)勢，而在存在內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的情況下采用本發(fā)明引物對與其它隨機(jī)選取的若干試劑的組合則或多或少的存在特異性不強(qiáng)、靈敏度不高和重復(fù)性不好的各種缺陷。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

sequencelisting

<110>中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院

<120>基于rpa-iac技術(shù)篩查南方菜豆花葉病毒的方法、rpa-iac引物及試劑盒

<130>17cn

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<213>artificial

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