本發(fā)明屬于分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種鑒定水稻堊白性狀的分子標(biāo)記、鑒定方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：堊白為稻米胚乳中不透明的部分，是胚乳中淀粉及蛋白質(zhì)排列不緊密形成的光學(xué)特性，堊白性狀對稻米外觀品質(zhì)、加工品質(zhì)均有負(fù)向影響。低堊白水稻品種其商業(yè)價值較高，受到育種工作者的青睞。但是目前，堊白性狀主要通過表型進(jìn)行鑒定，在育種早世代難以開展相關(guān)的選擇工作，且表型鑒定受環(huán)境條件影響較大，年度間鑒定結(jié)果不近一致，且需要耗費(fèi)大量人力及物力，在育種工作早世代時難以開展選擇工作，通過分子標(biāo)記輔助進(jìn)行低堊白稻米品種的選擇可以大大提高選擇效率，不受世代及樣品數(shù)量的限制，是改良水稻堊白性狀的最佳手段。chalk5基因作為調(diào)控秈稻腹白率的主效qtl于2014年被成功克?。谎芯繉W(xué)者亦通過全基因組關(guān)聯(lián)分析證實(shí)了chalk5基因在秈稻中的作用。chalk5基因被定位于水稻5號染色體，高堊白chalk5等位基因型與低堊白chalk5等位基因型存在2個功能性snp差異，分別為啟動子atg前-721位c-t及-485位a-t，兩個snp分離方向一致。然而，現(xiàn)有技術(shù)針對于chalk5基因，目前可供鑒定上述兩種等位基因型的功能性分子標(biāo)記缺失，致使基于chalk5基因鑒定水稻堊白性狀的分子手段難以推廣使用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供的一種鑒定水稻堊白性狀的分子標(biāo)記、鑒定方法及應(yīng)用，是目前唯一一個針對于chalk5基因構(gòu)建的pcr類型的功能性分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記能夠較好區(qū)分水稻堊白性狀的兩種等位基因型，操作簡單，耗費(fèi)較低。本發(fā)明的第一個目的是提供一種鑒定水稻堊白性狀的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記為chalk5-tpap，包括核苷酸序列如seqidno.1所示的chalk5-tpap-o-f、seqidno.2所示的chalk5-tpap-o-r、seqidno.3所示的chalk5-tpap-i-f和seqidno.4所示的chalk5-tpap-i-r。本發(fā)明的第二個目的是提供一種利用上述分子標(biāo)記鑒定水稻堊白性狀的方法，包括以下步驟：s1，提取待測水稻材料的基因組dna；s2，以s1獲得的基因組dna為模板，以chalk5-tpap-o-f、chalk5-tpap-o-r、chalk5-tpap-i-f和chalk5-tpap-i-r為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增；s3，結(jié)果判定以chalk5-tpap-o-f與chalk5-tpap-o-r結(jié)合擴(kuò)增出364bp片段作為陽性對照；當(dāng)chalk5-tpap-i-f與chalk5-tpap-o-r結(jié)合擴(kuò)增出225bp片段時，檢測材料為低堊白等位基因型t；當(dāng)chalk5-tpap-o-f與chalk5-tpap-i-r結(jié)合擴(kuò)增出194bp片段時，檢測材料為高堊白等位基因型c。優(yōu)選的，上述分子標(biāo)記鑒定水稻堊白性狀的方法，pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性30、58.4℃退火30s、72℃延伸30s-50s、35次循環(huán)；72℃延伸10min；4℃冷卻10min。本發(fā)明的第三個目的是提供一種上述分子標(biāo)記在水稻堊白性狀分子標(biāo)記輔助選育中的應(yīng)用。本發(fā)明的第四個目的是提供一種上述鑒定水稻堊白性狀的方法在水稻堊白性狀分子標(biāo)記輔助選育中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供一種鑒定水稻堊白性狀的分子標(biāo)記、鑒定方法及應(yīng)用，具有以下有益效果：本發(fā)明基于chalk5基因啟動子atg前-721位c-t的功能性snp差異，利用四引物受阻擴(kuò)增突變原理(tetra-primerarms-pcr)，設(shè)計(jì)基于pcr的功能性分子標(biāo)記chalk5-tpap，并構(gòu)建了該分子標(biāo)記的pcr擴(kuò)增體系。分子標(biāo)記chalk5-tpap是目前唯一一個針對于chalk5基因構(gòu)建的pcr類型的功能性分子標(biāo)記。分子標(biāo)記chalk5-tpap是從dna堿基的功能性多態(tài)性進(jìn)行鑒定，發(fā)明人經(jīng)過大量試驗(yàn)材料證實(shí)該分子標(biāo)記可以對chalk5基因的水稻堊白性狀的兩種等位基因型進(jìn)行直接鑒定，且準(zhǔn)確率達(dá)100％，能夠較好區(qū)分兩種等位基因型，不受環(huán)境條件的影響，鑒定操作方法簡單，耗費(fèi)較低，而其他現(xiàn)有文獻(xiàn)公開的引物分子標(biāo)記只能達(dá)到50-70％的鑒定準(zhǔn)確率；本發(fā)明的分子標(biāo)記chalk5-tpap為chalk5基因等位基因型的鑒定及相應(yīng)的分子標(biāo)記輔助選擇工作打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，適合于大范圍推廣使用。附圖說明圖1為h94材料的chalk5基因；圖2為珍汕97材料的chalk5基因；圖3為不同退火溫度組進(jìn)行pcr擴(kuò)增結(jié)果；其中，m泳道為dna標(biāo)準(zhǔn)分子量；1、3、5、7、9、11、13、15泳道分別為珍汕97材料在55.1℃、55.4℃、55.8℃、56.3℃、57.1℃、57.7℃、58.4℃、59.1℃退火溫度下的擴(kuò)增結(jié)果；2、3、4、5、10、12、14、16泳道分別為h94材料在55.1℃、55.4℃、55.8℃、56.3℃、57.1℃、57.7℃、58.4℃、59.1℃退火溫度下的擴(kuò)增結(jié)果。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但不應(yīng)理解為本發(fā)明的限制。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法，下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明提供的一種鑒定水稻堊白性狀的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記為chalk5-tpap，包括核苷酸序列如seqidno.1所示的chalk5-tpap-o-f、seqidno.2所示的chalk5-tpap-o-r、seqidno.3所示的chalk5-tpap-i-f和seqidno.4所示的chalk5-tpap-i-r。具體按照以下方法獲得：ncbi查找克隆序列：高堊白等位基因型珍汕97，kj363317；低堊白等位基因型h94，kj363318。選用啟動子atg前-721位c-t的snp進(jìn)行設(shè)計(jì)。利用在線引物設(shè)計(jì)軟件primer1進(jìn)行分子標(biāo)記設(shè)計(jì)，命名為chalk5-tpap，chalk5-tpap包括核苷酸序列如seqidno.1所示的chalk5-tpap-o-f、seqidno.2所示的chalk5-tpap-o-r、seqidno.3所示的chalk5-tpap-i-f和seqidno.4所示的chalk5-tpap-i-r，其序列信息詳見表1。seqidno.5為低堊白等位基因型h94的核苷酸序列，其中第1-28位為chalk5-tpap-o-f的結(jié)合位點(diǎn)，第337-364位為chalk5-tpap-o-r的結(jié)合位點(diǎn)，第140-165位為chalk5-tpap-i-f的無效擴(kuò)增位點(diǎn)，第165-197位為chalk5-tpap-i-r的結(jié)合位點(diǎn)。如圖1所示，圖1中snp差異位點(diǎn)用加黑斜體字母t表示，帶下劃線的字母表示引物結(jié)合位點(diǎn)，實(shí)線箭頭表示引物擴(kuò)增方向，虛線箭頭表示不能有效擴(kuò)增。seqidno.6為高堊白等位基因型珍汕97的核苷酸序列，其中第1-28位為chalk5-tpap-o-f的結(jié)合位點(diǎn)，第337-364位為chalk5-tpap-o-r的結(jié)合位點(diǎn)，第140-165位為chalk5-tpap-i-f的結(jié)合位點(diǎn)，第165-197位為chalk5-tpap-i-r的無效擴(kuò)增位點(diǎn)。如圖2所示，圖2中snp差異位點(diǎn)用加黑斜體字母c表示，帶下劃線的字母表示引物結(jié)合位點(diǎn)，實(shí)線箭頭表示引物擴(kuò)增方向，虛線箭頭表示不能有效擴(kuò)增。表1chalk5-tpap中各分子標(biāo)記序列基因標(biāo)記序列(5’-3’)chalk5chalk5-tpap-i-fagaagagagaagtgccaaggatcggtchalk5chalk5-tpap-i-rggtttttgaataaaacaactctgggtcctgchalk5chalk5-tpap-o-fgattgcatgcatcttaacagcaaagagachalk5chalk5-tpap-o-rcaaattaggtgtatctgacgcatgagca實(shí)施例1利用上述分子標(biāo)記chalk5-tpap鑒定供試水稻材料的堊白性狀，具體包括以下步驟：供試材料為chalk5基因克隆試驗(yàn)中的對照材料水稻品種珍汕97和水稻品種h94(h94與中國專利cn103382479b中述及的水稻品種h94為同一品種)，其中珍汕97攜帶高堊白等位基因型chalk5，h94攜帶低堊白等位基因型chalk5。s1，分別提取珍汕97和h94兩個材料的基因組dna，基因組dna提取采用全式金植物dna提取試劑盒進(jìn)行(操作按照試劑盒說明)。s2，以s1獲得的基因組dna為模板，以chalk5-tpap-o-f、chalk5-tpap-o-r、chalk5-tpap-i-f和chalk5-tpap-i-r為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系為10μl：包括dna0.2μl(1ng/μl)；chalk5-tpap-o-f0.3μl、chalk5-tpap-o-r0.3μl、chalk5-tpap-i-f0.2μl、chalk5-tpap-i-r0.2μl；2×tappcrmastermix(帶染料，康為世紀(jì)公司購買)5.0μl；ddh2o3.8μl。其中chalk5-tpap-o-f、chalk5-tpap-o-r為外引物，chalk5-tpap-i-f和chalk5-tpap-i-r為內(nèi)引物，上述引物的濃度均為4pmol/μl。pcr擴(kuò)增反的應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性30s、58.4℃退火30s、72℃延伸30s、35次循環(huán)；72℃延伸10min；4℃冷卻10min。反應(yīng)產(chǎn)物在5％瓊脂糖凝膠上100v電泳1h，經(jīng)溴化乙錠(ethidiumbromide，eb)染色后并于凝膠成像系統(tǒng)下觀察，記錄結(jié)果。s3，結(jié)果判定以chalk5-tpap-o-f與chalk5-tpap-o-r結(jié)合擴(kuò)增出364bp片段作為陽性對照；當(dāng)chalk5-tpap-i-f與chalk5-tpap-o-r結(jié)合擴(kuò)增出225bp片段時，檢測材料為低堊白等位基因型t；當(dāng)chalk5-tpap-o-f與chalk5-tpap-i-r結(jié)合擴(kuò)增出194bp片段時，檢測材料為高堊白等位基因型c。通過chalk5-tpap對2個對照材料的8個退火溫度組進(jìn)行pcr擴(kuò)增，其中，pcr擴(kuò)增的8個退火溫度分別為55.1℃、55.4℃、55.8℃、56.3℃、57.1℃、57.7℃、58.4℃、59.1℃，其余程序均參照實(shí)施例1的s2中記載的pcr擴(kuò)增反應(yīng)程序。不同退火溫度組進(jìn)行pcr擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示，由圖3可知，當(dāng)退火溫度為58.4℃時，電泳圖中條帶亮度區(qū)分明顯，不存在假陽性現(xiàn)象。chalk5-tpap-o-f與chalk5-tpap-o-r結(jié)合擴(kuò)增出364bp片段作為陽性對照；當(dāng)檢測材料為低堊白等位基因型h94時，chalk5-tpap-i-f與chalk5-tpap-o-r結(jié)合擴(kuò)增出225bp片段；當(dāng)檢測材料為高堊白等位基因型珍汕97時，chalk5-tpap-o-f與chalk5-tpap-i-r結(jié)合擴(kuò)增出194bp片段。由于選取的對照材料為前人研究中該基因位點(diǎn)已測序材料，證實(shí)了chalk5-tpap的有效性及準(zhǔn)確性。實(shí)施例2利用分子標(biāo)記chalk5-tpap進(jìn)行dh群體后代的基因型檢測dh群體為低堊白等位基因型水稻品種h94(父本)雜交高堊白等位基因型水稻品種秋光(母本)，由花藥培養(yǎng)而獲得的150個穩(wěn)定品系，通過標(biāo)記chalk5-tpap進(jìn)行150個穩(wěn)定品系的chalk5等位基因型鑒定，并與2012-2013年兩年堊白表型進(jìn)行對比，結(jié)果如表2所示，2012年，高堊白等位基因型水稻品共計(jì)89個，表型均為高堊白，如平均堊白粒率15.25％，平均堊白粒度8.95％；低堊白等位基因型水稻品種共計(jì)61個，表型均為低堊白，如平均堊白粒率5.06％，平均堊白粒度2.56％；2013年，高堊白等位基因型水稻品共計(jì)89個，表型均為高堊白，如平均堊白粒率14.14％，平均堊白粒度9.38％；低堊白等位基因型水稻品種共計(jì)61個，表型均為低堊白，如平均堊白粒率6.09％，平均堊白粒度1.97％。統(tǒng)計(jì)分析表明不同等位基因型后代堊白性狀差異達(dá)到極顯著水平，基因型與表型吻合，證實(shí)了標(biāo)記chalk5-tpap的準(zhǔn)確性。表2利用分子標(biāo)記chalk5-tpap檢測dh群體堊白及堊白表型對比結(jié)果注釋：標(biāo)注字母a及b代表了0.01水平上的顯著性實(shí)例2利用分子標(biāo)記chalk5-tpap進(jìn)行ril群體后代的基因型檢測ril群體為低堊白等位基因型水稻品種h94(父本)雜交高堊白等位基因型水稻品種橋科951(母本)，由單粒傳方法而獲得的110個穩(wěn)定品系，通過標(biāo)記chalk5-tpap進(jìn)行110個穩(wěn)定品系的chalk5等位基因型鑒定，并與2013-2014年兩年堊白表型進(jìn)行對比，結(jié)果如表3所示，2013年，高堊白等位基因型水稻品共計(jì)38個，表型均為高堊白，如平均堊白粒率16.32％，平均堊白粒度6.84％；低堊白等位基因型水稻品種共計(jì)72個，表型均為低堊白，如平均堊白粒率6.31％，平均堊白粒度3.12％；2014年，高堊白等位基因型水稻品共計(jì)38個，表型均為高堊白，如平均堊白粒率13.51％，平均堊白粒度7.21％；低堊白等位基因型水稻品種共計(jì)72個，表型均為低堊白，如平均堊白粒率7.09％，平均堊白粒度2.37％。統(tǒng)計(jì)分析表明不同等位基因型后代堊白性狀差異達(dá)到極顯著水平，基因型與表型吻合，證實(shí)了標(biāo)記chalk5-tpap的準(zhǔn)確性。表3利用分子標(biāo)記chalk5-tpap檢測ril群體堊白及堊白表型對比結(jié)果注釋：標(biāo)注字母a及b代表了0.01水平上的顯著性需要說明的是，本發(fā)明權(quán)利要求書中涉及數(shù)值范圍時，應(yīng)理解為每個數(shù)值范圍的兩個端點(diǎn)以及兩個端點(diǎn)之間任何一個數(shù)值均可選用，由于采用的步驟方法與上述實(shí)施例相同，為了防止贅述，本發(fā)明的描述了優(yōu)選的實(shí)施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對這些實(shí)施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實(shí)施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明進(jìn)行各種改動和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動和變型在內(nèi)。序列表<120>一種鑒定水稻堊白性狀的分子標(biāo)記、鑒定方法及應(yīng)用<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>28<212>dna<213>人工合成<400>1gattgcatgcatcttaacagcaaagaga28<210>2<211>28<212>dna<213>人工合成<400>2caaattaggtgtatctgacgcatgagca28<210>3<211>26<212>dna<213>人工合成<400>3agaagagagaagtgccaaggatcggt26<210>4<211>30<212>dna<213>人工合成<400>4ggtttttgaataaaacaactctgggtcctg30<210>5<211>364<212>dna<213>h94<400>5gattgcatgcatcttaacagcaaagagagatgcaaactcttgaagtttatcatcacagga60aaacttatgacatctacaactttgaaattgaaatatagcaagacaaatcaagtagccttt120ccaagtttcttttgacccaagaagagagaagtgccaaggatctgtatgacccagagttgt180tttattcaaaaaccaccattcgaaatgaaggtagctagatgcatgatgagggaaattttg240ttgcatgtgggtgaaccccaaagcttacctaatggcattgtccgtcagcattttcagtgc300gtccaaaccccaatgagacgcaccgtatataacttatgctcatgcgtcagatacacctaa360tttg364<210>6<211>364<212>dna<213>珍汕97<400>6gattgcatgcatcttaacagcaaagagagatgcaaactcttgaagtttatcatcacagga60aaacttatgacatctacaactttgaaattgaaatatagcaagacaaatcaagtagccttt120ccaagtttcttttgacccaagaagagagaagtgccaaggatctgcatgacccagagttgt180tttattcaaaaaccaccattcgaaatgaaggtagctagatgcatgatgagggaaattttg240ttgcatgtgggtgaaccccaaagcttacctaatggcattgtccgtcagcattttcagtgc300gtccaaaccccaatgagacgcaccgtatataacttatgctcatgcgtcagatacacctaa360tttg364當(dāng)前第1頁12