本發(fā)明涉及鑭系元素離子新應(yīng)用，尤其涉及一種鑭系元素離子在使pcr偏向于擴增小片段產(chǎn)物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，pcr)是現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一，可使目的dna分子的合成量呈指數(shù)增長，因此微量的遺傳物質(zhì)在數(shù)小時內(nèi)即能擴增數(shù)百萬倍達(dá)到檢測水平，進(jìn)而可進(jìn)行dna測序、分子診斷、基因分析等。然而在實際應(yīng)用中仍然存在一些難以克服的難題，如假陰性、假陽性、非特異性擴增以及片狀拖帶或涂抹帶等。為此，研究人員研發(fā)了多種多樣的pcr添加劑，有傳統(tǒng)添加劑如甲酰胺、乙酰胺、非離子去污劑、dmso、氯化四甲基銨、甜菜堿等；新型添加劑如納米金、碳納米管、氧化石墨烯等。這些添加劑側(cè)重于提高pcr的特異性和產(chǎn)物的產(chǎn)量，在一定程度上改善了pcr技術(shù)，然而在一些去除大片段特異性擴增上仍然難以奏效。例如，當(dāng)引物所在位置存在重復(fù)序列時會產(chǎn)生非靶標(biāo)的大片段擴增產(chǎn)物，這種大片段產(chǎn)物是由于模板dna中存在多個引物結(jié)合位點造成的，是特異性擴增的，但同時也是需要去除的非靶標(biāo)產(chǎn)物，在這種實例中，上述已有添加劑難以達(dá)到理想的優(yōu)化效果。鑭系元素是元素周期表中第三副族中原子序數(shù)從57到71的15種元素。鑭系元素具有未充滿的4f電子層，使得4f電子的不同排布會產(chǎn)生f-f組內(nèi)或f-d組態(tài)間的躍遷，當(dāng)4f電子在不同的能級躍遷時就會產(chǎn)生大量的能量吸收和熒光光譜的特征信息，因此被廣泛的應(yīng)用于熒光材料、稀土金屬氫化物電池材料、儲氫材料、催化材料、激光材料等。目前，尚未見報道將鑭系元素離子應(yīng)用于pcr技術(shù)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目是提供一種使pcr偏向于擴增小片段產(chǎn)物的添加劑，所述添加劑中包括鑭系元素離子，該添加劑的使用克服了目前的pcr添加劑無法去除大片段特異性擴增產(chǎn)物的難題。本發(fā)明目的之二提供鑭系元素離子(ln3+)在pcr技術(shù)中的應(yīng)用，具體的應(yīng)用方法：向pcr反應(yīng)溶液中加入ln3+，然后再進(jìn)行反應(yīng)，由于ln3+的加入，能使pcr偏向于擴增小片段產(chǎn)物。本發(fā)明目的之三提供鑭系元素離子(ln3+)在延長多輪pcr中小片段產(chǎn)物的擴增輪數(shù)中的應(yīng)用。本發(fā)明的一個實施例中提到，ln3+在轉(zhuǎn)基因玉米nk603中camv35s基因擴增中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個實施例中提到，ln3+在水稻內(nèi)參基因sps擴增中的應(yīng)用。本發(fā)明具體實施例中所使用的鑭系元素離子(ln3+)為鑭離子(la3+)、鈰離子(ce3+)、鐠離子(pr3+)或鋱離子(tb3+)。優(yōu)選的：所使用的鑭系元素離子化合物為lacl3·7h2o、cecl3·6h2o、prcl3·6h2o或tbcl3·6h2o。鑭系元素離子作為添加劑使pcr偏向于擴增小片段產(chǎn)物的應(yīng)用中，所述的ln3+用量以可產(chǎn)生優(yōu)化聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)效果的量為準(zhǔn)。優(yōu)選的：la3+為3.9-6.4μm，更優(yōu)選為4.8-5.5μm；ce3+為3.3-5.6μm，更優(yōu)選為3.5-5.1μm；pr3+為2.7-5.4μm，更優(yōu)選為2.8-5.2μm；tb3+為2.3-4.2μm，更優(yōu)選為2.4-3.9μm；μm為ln3+離子在pcr反應(yīng)液中的終濃度。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明首次將ln3+應(yīng)用于pcr技術(shù)，目的是去除pcr反應(yīng)中大片段產(chǎn)物(無論這種大片段產(chǎn)物是特異性的還是非特異性的)，只擴增小片段產(chǎn)物，提高小片段產(chǎn)物的比率；還可以延長多輪pcr中小片段產(chǎn)物的擴增輪數(shù)，彌補現(xiàn)有添加劑優(yōu)化效果的空白。此外，ln3+容易獲得，成本低廉，應(yīng)用于pcr技術(shù)操作簡便。附圖說明圖1為實施例1所用模式pcr圖解，左圖為擴增區(qū)域結(jié)構(gòu)示意，右圖為pcr產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖；圖2為不同濃度的ln3+對轉(zhuǎn)基因玉米nk603中camv35s基因擴增的優(yōu)化所得產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖3為實施例2所用模式pcr圖解，左圖為擴增區(qū)域結(jié)構(gòu)示意，右圖為pcr產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖；圖4為不同濃度的ln3+對水稻內(nèi)參基因sps擴增的優(yōu)化所得產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖5為ln3+對多輪pcr中小片段產(chǎn)物擴增的優(yōu)化效果。具體實施方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。下列實施例中試劑來源為：植物基因組總dna采用康為世紀(jì)生物科技有限公司植物dna提取試劑盒(cw0531s)提取，2×premixrtaq購自大連takara公司，引物和lacl3·7h2o、cecl3·6h2o、prcl3·6h2o、tbcl3·6h2o購自生工生物工程(上海)股份有限公司，marker為天根生化科技(北京)有限公司markeri。實施例1不同濃度的ln3+對轉(zhuǎn)基因玉米nk603中camv35s基因擴增的優(yōu)化效果camv35s基因為轉(zhuǎn)基因玉米nk603的啟動子，其序列結(jié)構(gòu)上存在增強子序列。采用國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法(引物序列為：f：gctcctacaaatgccatcattgc，r：gatagtgggattgtgcgtcatccc)擴增nk603中camv35s基因片段，該標(biāo)準(zhǔn)方法的上游引物在camv35s和增強子上均存在結(jié)合位點，該方法的產(chǎn)物共有三條，分別為195bp的小片段特異性靶標(biāo)產(chǎn)物、450bp的大片段特異性非靶標(biāo)產(chǎn)物和520bp的大片段非特異性雜帶(圖1)。在這三條產(chǎn)物中，只有195bp的小片段產(chǎn)物是檢測需要的，其余均需去除。本實施例的目的是比較未添加ln3+和添加不同量ln3+對pcr中大片段非特異性產(chǎn)物和大片段特異性非靶標(biāo)產(chǎn)物的優(yōu)化效果。(1)pcr反應(yīng)體系組成(20μl)：組分用量2×premixrtaq10μl上游引物f(10μm)1μl下游引物r(10μm)1μl模板dna(25ngμl-1)2μlln3+溶液依照實驗需求添加無菌水補足至20μl所述ln3+溶液為lacl3·7h2o、cecl3·6h2o、prcl3·6h2o和tbcl3·6h2o各自的水溶液，其在pcr反應(yīng)體系中終濃度分別為：la3+：0-7.1μm；ce3+：0-6.3μm；pr3+：0-6.0μm；tb3+：0-4.7μm。(2)pcr擴增程序為：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃30s，35個循環(huán)；72℃7min。(3)對擴增后的dna樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測：擴增結(jié)果如圖2所示，其中，各泳道所對應(yīng)的樣品如下：m：分子量標(biāo)記markeri，自下至上分別為100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp；la3+對pcr的優(yōu)化，從左向右泳道la3+終濃度依次為0、2.3、3.1、3.9、4.7、5.5、6.3和7.1μm，在終濃度為3.1μm時，520bp的大片段非特異性雜帶消失，終濃度為3.9-5.5μm時，520bp的大片段非特異性雜帶和450bp的大片段非靶標(biāo)條帶同時消失；ce3+對pcr的優(yōu)化，從左向右泳道ce3+終濃度依次為0、1.9、2.8、3.5、4.2、4.9、5.6和6.3μm，在終濃度為2.8μm時，520bp的大片段非特異性雜帶消失，終濃度為3.5-5.6μm時，520bp的大片段非特異性雜帶和450bp的大片段非靶標(biāo)條帶同時消失；pr3+對pcr的優(yōu)化，從左向右泳道pr3+終濃度依次為0、1.2、2.0、2.8、3.6、4.4、5.2和6.0μm，在終濃度為2.0μm時，520bp的大片段非特異性雜帶消失，終濃度為2.8-5.2μm時，520bp的大片段非特異性雜帶和450bp的大片段非靶標(biāo)條帶同時消失；tb3+對pcr的優(yōu)化，從左向右泳道tb3+終濃度依次為0、0.7、1.2、1.5、2.3、3.1、3.9和4.7μm，在終濃度為1.5μm時，520bp的大片段非特異性雜帶消失，終濃度為2.3-3.9μm時，520bp的大片段非特異性雜帶和450bp的大片段非靶標(biāo)條帶同時消失；由實施例1可知，ln3+不僅能去除pcr反應(yīng)的大片段雜帶，也能去除大片段的非靶標(biāo)產(chǎn)物，使得pcr只進(jìn)行小片段的靶標(biāo)產(chǎn)物擴增，從而準(zhǔn)確的對camv35s基因進(jìn)行檢測。實施例2不同濃度的ln3+對水稻內(nèi)參基因sps擴增的優(yōu)化效果使用生物學(xué)軟件oligo7.4設(shè)計擴增水稻sps基因片段的半兩重pcr，引物序列為：上游引物f：ttggcacagcaagacactcc；下游引物r1：tcgccactaactagaccatgaagac，下游引物r2：gtaatacgcaaccatgcaggg；f/r1所擴增產(chǎn)物大小為233bp，f/r2所擴增產(chǎn)物大小為386bp(圖3)。本實施例的目的是比較未添加ln3+和添加不同量ln3+對pcr中大片段靶標(biāo)產(chǎn)物的優(yōu)化效果。(1)pcr反應(yīng)體系組成(20μl)：組分用量2×premixrtaq10μl上游引物f1(10μm)1μl下游引物r1(10μm)0.5μl下游引物r2(10μm)0.5μl模板dna(25ngμl-1)2μlln3+溶液依照實驗需求添加無菌水補足至20μl所述ln3+溶液為lacl3·7h2o、cecl3·6h2o、prcl3·6h2o和tbcl3·6h2o各自的水溶液，其在pcr反應(yīng)體系中終濃度分別為：la3+：0-7.1μm；ce3+：0-6.9μm；pr3+：0-6.3μm；tb3+：0-5.1μm。(2)pcr擴增程序參照實施例1。(3)對擴增后的dna樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測：擴增結(jié)果如圖4所示，其中，各泳道所對應(yīng)的樣品如下：m：分子量標(biāo)記markeri，自下至上分別為100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp；la3+對pcr的優(yōu)化，從左向右泳道la3+終濃度依次為0、3.2、4.0、4.8、5.6、6.4和7.1μm，在終濃度為4.8-6.4μm時，386bp的大片段靶標(biāo)產(chǎn)物消失；ce3+對pcr的優(yōu)化，從左向右泳道ce3+終濃度依次為0、2.4、3.2、4.2、5.1、6.0和6.9μm，在終濃度為3.3-5.1μm時，386bp的大片段靶標(biāo)產(chǎn)物消失；pr3+對pcr的優(yōu)化，從左向右泳道pr3+終濃度依次為0、1.9、2.7、3.6、4.5、5.4和6.3μm，在終濃度為2.7-5.4μm時，386bp的大片段靶標(biāo)產(chǎn)物消失；tb3+對pcr的優(yōu)化，從左向右泳道tb3+終濃度依次為0、1.3、1.6、2.4、3.3、4.2和5.1μm，在終濃度為2.4-4.2μm時，386bp的大片段靶標(biāo)產(chǎn)物消失；由實施例2可知，ln3+能夠去除大片段的靶標(biāo)產(chǎn)物，使得pcr只進(jìn)行小片段的靶標(biāo)產(chǎn)物擴增，從而提高小片段產(chǎn)物的比率。實施例3ln3+對多輪pcr的優(yōu)化效果對實施例2中所用pcr體系進(jìn)行多輪擴增，即以上輪pcr產(chǎn)物為模板配制反應(yīng)體系進(jìn)行下一輪pcr擴增，選取終濃度為5.0μm的la3+為例驗證ln3+對多輪pcr中小片段產(chǎn)物的優(yōu)化效果(圖5)，即ln3+能延長多輪pcr中小片段產(chǎn)物擴增的輪數(shù)。(1)pcr反應(yīng)體系組成(20μl)：組分用量2×premixrtaq10μl上游引物f1(10μm)1μl下游引物r1(10μm)0.5μl下游引物r2(10μm)0.5μl上一輪pcr產(chǎn)物稀釋100倍2μlla3+溶液終濃度為5.0μm無菌水補足至20μl(2)pcr擴增程序參照實施例1，共擴增7輪。(3)對擴增后的dna樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測：擴增結(jié)果如圖4所示，其中，各泳道所對應(yīng)的樣品如下：m：分子量標(biāo)記markeri，自下至上分別為100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp；在無la3+存在時，pcr擴增至第2輪即產(chǎn)生大量彌散產(chǎn)物，特異性產(chǎn)物生成量大大減少，從第3輪開始則完全變成樣孔帶，無特異性產(chǎn)物生成；當(dāng)pcr體系中加入終濃度為5.0μm的la3+時，小片段產(chǎn)物可成功擴增至第5輪，大大延長了擴增輪數(shù)。由此可知，ln3+能促進(jìn)小片段產(chǎn)物在多輪pcr擴增時的輪數(shù)。上述雖然結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式進(jìn)行了描述，但并非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以內(nèi)。當(dāng)前第1頁12