專利名稱:核酸擴增產(chǎn)物實時檢測裝置的制作方法
技術領域:
本發(fā)明涉及對聚合酶鏈反應(polymerase chain reactin:PCR)所得多核苷酸產(chǎn)物進行實時檢測的裝置。
背景技術:
PCR是對DNA鏈進行復制的循環(huán)性酶反應,其出于以下原因能夠對作為目標的目標序列分子進行指數(shù)函數(shù)式的擴增:將在先循環(huán)中復制的PCR產(chǎn)物(核酸擴增產(chǎn)物)用作在后循環(huán)的模板。在實時 PCR中,例如使用相干的兩種熒光染料標記的序列特異性探針(TaqMan探針),用激發(fā)光照射PCR產(chǎn)物,激起熒光并測定熒光強度,從而對PCR產(chǎn)物的擴增進行實時監(jiān)測。而且,當用于定量時,對于已知樣品擴增曲線的指數(shù)函數(shù)擴增范圍設定閾值(圖7的(6)),然后計算出該閾值與擴增曲線的交點(閾值循環(huán)數(shù)Ct,圖7的(8))。當以Log值的形式來表示初期DNA量時,該閾值循環(huán)數(shù)Ct與檢測樣品的初期DNA量之間存在線性關系,可以制作出表示該線性關系的校正曲線。以該校正曲線為基準可以推知檢測樣品的初期DNA量。這樣,就能夠基于PCR的擴增速度理論進行準確的定量。在這里,由于實際的PCR效率不是100%,擴增出的PCR產(chǎn)物的濃度可以以式⑴表
/Jn ο[DNA] = [DNA]0(l+e)c....(I)[DNA]:PCR產(chǎn)物的濃度[DNA] ^:目標模板的初期濃度e:平均PCR效率c:循環(huán)數(shù)S卩,如果平均PCR效率e為100% (即,上式(I)中e=l),則PCR產(chǎn)物的濃度[DNA]為2的循環(huán)數(shù)次方,呈指數(shù)函數(shù)式地擴增。然而,在循環(huán)的初期、中期和后期,效率e逐漸降低,擴增曲線為圖7所示的狀況。圖7的橫軸為循環(huán)數(shù)、縱軸為熒光強度,循環(huán)初期以指數(shù)函數(shù)的形式擴增(圖7的(5)),循環(huán)中期以線性函數(shù)的形式擴增(圖7的(6)),而循環(huán)后期則由于平臺效應而不再擴增(圖7的(7))。而且,引起平臺效應的化學反應方面的因素如下。.dNTP和引物的水解.DNA聚合酶(生產(chǎn)模板拷貝的DNA合成酶)的熱失活.單鏈PCR片段的復性引起的引物退火效率降低 非特異性PCR產(chǎn)物的競爭因素.焦磷酸酯等PCR抑制物的積累
.DNA聚合酶的外切酶活性引起的PCR產(chǎn)物水解因此,實時PCR的前提條件是在上式(I)的關系成立的指數(shù)函數(shù)擴增范圍內進行測定(專利文獻I)。專利文獻1:特表2005-516630號公報專利文獻2:專利第2909216號公報
發(fā)明內容
發(fā)明所要解決的問題此外,作為實時PCR中使用的反應容器,一般使用稱作微孔板的具有多個孔(由凹陷構成的反應區(qū),例如96個)的容器。雖然向各孔中分加了一定初期DNA濃度的反應溶液,但由于裝置方面的下述誤差因素,反應容器的各個孔的擴增曲線存在偏差。.光學系統(tǒng)的誤差.校正溶液的濃度誤差.校正溶液的分加誤差
.反應容器的蓋或封口膜的光透過性誤差.反應容器的污染誤差.反應溶液的分加誤差這里,由于價格低廉的關系,下述方法成為給反應容器(微孔板)的孔加蓋的主流方法:在反應容器的一面的整個區(qū)上粘貼帶有粘合劑的前述封口膜。而且,激發(fā)光通過封口膜照射到各孔,PCR產(chǎn)物(反應產(chǎn)物)發(fā)出的熒光也是通過封口膜才被CCD相機等光檢測部檢測到(這些構成裝置的光學系統(tǒng))。這樣,雖然封口膜、反應容器本體構成了熒光強度測定方面的光學系統(tǒng)的重要要素,但是,這些均屬易耗品,很難指望它們具有均一且高精度的光學性能。圖4為光檢測部所檢測到的PCR前的反應容器的實際圖像。從整體來看,反應容器的孔的周圍是黑色的,但是,作為背景的該圖像各像素的亮度(背景熒光強度)卻并非一定,如該圖的(I)中所示,由于光學系統(tǒng)的污染、雜散光(迷走光)等出現(xiàn)了斑點。如果開始PCR反應,則該斑點會如圖5的⑵中所示那樣,與孔部分的圖像(圖5中顯示為圓形的96個圖像)重疊,而被孔本體的熒光強度拉長。因而,傳統(tǒng)上,首先準備未裝入DNA的空反應容器,對于各個孔,分別測定空孔狀態(tài)的熒光強度,將其作為標準校正值進行存儲。然后,通過進行如下的校正處理,進行這樣的光學系統(tǒng)的校正,所述校正處理為:從實際熒光強度的測定值中減去存儲的校正值。然而,歸因于空反應容器污染的誤差是各反應容器固有的,存在的問題是:當使用被認定為標準的來自其它空反應容器的校正值時,在測定值方面會產(chǎn)生誤差。此外,在專利文獻2中,使用第2熒光信號對第I熒光信號進行修正,然而,除了本來必須測定的發(fā)出第I熒光的溶液之外,還必須再加上發(fā)出參照用的第2熒光的溶液,這樣不但操作復雜,而且成本激增。此外,必須非常高精度地分注發(fā)出第2熒光的溶液并高精度地進行測定,才能有效果。此外,還存在的問題是:為測定第2熒光必須安裝特殊的濾光器(光學7 ^ ),還有獲取和處理數(shù)據(jù)需要相當長的時間,例如每次測定均需要交替使用發(fā)出第I熒光溶液用濾光器和發(fā)出第2熒光溶液用濾光器。
本發(fā)明是為了解決這些傳統(tǒng)技術上的問題而完成的,其目的是提供一種核酸擴增產(chǎn)物實時檢測裝置,該核酸擴增產(chǎn)物實時檢測裝置能夠有效地排除或降低裝置上的誤差因素,而不使用用于修正的第2熒光信號。解決問題的方法權利要求1的發(fā)明的裝置對多個反應區(qū)實施溫度循環(huán),對各反應區(qū)中的來自核酸擴增產(chǎn)物的熒光強度進行實時檢測,其中,通過檢測得自反應區(qū)的熒光測定值[DNA]raw和得自該反應區(qū)附近的反應區(qū)外區(qū)域的熒光測定值[DNA]bg、并從熒光測定值[DNA]raw中減去熒光測定值[DNA]bg來確定該反應區(qū)的熒光強度[DNA]real。權利要求2的發(fā)明的裝置,其特征在于:在上述發(fā)明中,熒光測定值[DNA]bg為得自反應區(qū)附近的多個反應區(qū)外區(qū)域的熒光測定值的簡單平均、或者經(jīng)過指定加權后的平均值。權利要求3的發(fā)明的裝置,其特征在于:在上述各發(fā)明中,在每次檢測熒光測定值[DNA] raw時,檢測熒光測定值[DNA]bg,從該熒光測定值[DNA] raw中減去熒光測定值[DNA]bg,這樣來確定熒光強度[DNA]real。權利要求4的發(fā)明的裝置對多個反應區(qū)實施溫度循環(huán),實時檢測各反應區(qū)中的來自核酸擴增產(chǎn)物的熒光強度,其中,對于每個溫度循環(huán)的從各反應區(qū)得到的熒光強度[DNA]η(第η個循環(huán)的熒光強度),使用該熒光強度[DNA]n的最大值或與之相關的值[DNA]max進行標準化,對于使用該標準化的熒光強度[DNA]nN繪制的擴增曲線的指數(shù)函數(shù)擴增區(qū)設定閾值Th,由此來計算出閾值循環(huán)數(shù)Ct。權利要求5的發(fā)明·的裝置,其特征在于:在上述發(fā)明中,通過用每個反應區(qū)的熒光強度[DNA]n除以下述值來計算出熒光強度[DNA]nN,其中,所述值為:最大值或與之相關的值[DNA]max、或者將[DNA]max加上作為比較對象的反應區(qū)共有的值而得的值。權利要求6的發(fā)明的裝置,其特征在于:在權利要求4或權利要求5中,從各反應區(qū)的熒光強度[DNA]η及最大值或與之相關的值[DNA]max中減去指數(shù)函數(shù)擴增區(qū)以前的熒光強度[DNA]base,這樣來繪制擴增曲線。發(fā)明的效果本發(fā)明中,在對多個反應區(qū)實施溫度循環(huán)、實時檢測來自各反應區(qū)中的核酸擴增產(chǎn)物的熒光強度的核酸擴增產(chǎn)物實時檢測裝置中,檢測得自反應區(qū)的熒光測定值[DNA]raw和得自該反應區(qū)附近的反應區(qū)外區(qū)域的熒光測定值[DNA]bg,從該熒光測定值[DNA]raw中減去熒光測定值[DNA]bg,由此來確定該反應區(qū)的熒光強度[DNA]real,因此,對于每個反應區(qū),能夠分別獲得該反應區(qū)的核酸擴增產(chǎn)物固有的熒光強度[DNA] real,其中扣除了歸因于該反應區(qū)及其周圍的光透過性誤差、污染、雜散光的背景熒光強度。這樣一來,可以實現(xiàn)準確的擴增曲線的制作和定量化。這種情況下,不需要使用第2熒光信號,因此,不會造成成本增加或操作困難,數(shù)據(jù)的獲取和處理所需的時間也會縮短。在權利要求2的發(fā)明中,在上述發(fā)明的基礎上,熒光測定值[DNA] bg為得自反應區(qū)附近的多個反應區(qū)外區(qū)域的熒光測定值的簡單平均、或者進行了指定加權后的平均值,因此,可以更準確地計算出背景熒光強度,高精度地進行熒光強度[DNA]real的確定。在權利要求3的發(fā)明中,在上述各發(fā)明的基礎上,在每次檢測熒光測定值[DNA]raw時,檢測熒光測定值[DNA]bg,并且從該熒光測定值[DNA] raw中減去熒光測定值[DNA]bg,這樣來確定熒光強度[DNA]real,因此,即使反應中背景熒光強度有變化,一般也可以實時且精度良好地獲得核酸擴增產(chǎn)物固有的熒光強度[DNA] real。權利要求4的發(fā)明中,在對多個反應區(qū)實施溫度循環(huán)、實時檢測來自各反應區(qū)中的核酸擴增產(chǎn)物的熒光強度的核酸擴增產(chǎn)物實時檢測裝置中,對于每次所述溫度循環(huán),測定從各反應區(qū)得到的熒光強度,第η次溫度循環(huán)的從各反應區(qū)得到的熒光強度記作熒光強度[DNA]n,對于每一個熒光強度[DNA]n,使用這些熒光強度[DNA] η的最大值或與之相關的值[DNA]max進行標準化,對于使用該標準化的熒光強度[DNA]nN繪制的擴增曲線的指數(shù)函數(shù)擴增區(qū)設定閾值Th,由此計算出閾值循環(huán)數(shù)Ct,因此,可以校正光學系統(tǒng)的誤差、校正溶液的濃度誤差、校正溶液的分加誤差、反應溶液的分加誤差等裝置方面的誤差因素等引起的各反應區(qū)熒光強度的偏差,并使之降低,能夠計算出高準確度的閾值循環(huán)數(shù)Ct。權利要求5的發(fā)明中,在上述的基礎上,通過用每個反應區(qū)的熒光強度[DNA]n除以下述值來計算出熒光強度[DNA]nN,其中,所述值為:最大值或與之相關的值[DNA]max、或者將其加上作為比較對象的對反應區(qū)而言共有的值而得的值,這樣抑制了標準化的效果,充分確保了閾值處的校正效 果,使循環(huán)中期至后期的擴增曲線與實際數(shù)據(jù)相近似,能夠容易地對裝置方面誤差因素以外的因素引起的數(shù)據(jù)的行為進行把握。在權利要求6的發(fā)明中,在權利要求4或權利要求5的基礎上,從各反應區(qū)的熒光強度[DNA]n及最大值或與之相關的值[DNA]max中減去指數(shù)函數(shù)擴增區(qū)以前的熒光強度[DNA]base,來繪制擴增曲線,因此,能夠把握來自反應區(qū)的核酸擴增產(chǎn)物本身的熒光強度狀況,而排除反應區(qū)的反應溶液本身發(fā)出的熒光的強度。
圖1:本發(fā)明的實施方式的實時檢測裝置的結構圖。圖2:構成圖1的實時檢測裝置的反應檢測裝置的豎直剖面圖。圖3:圖2的反應檢測裝置的水平剖面圖。圖4:顯示反應容器的背景熒光強度狀態(tài)的圖。圖5:顯示反應后的熒光強度狀態(tài)的圖。圖6:顯示反應后的熒光強度狀態(tài)的另一個圖。圖7:某個孔的DNA擴增曲線。圖8:全部孔的DNA擴增曲線。圖9:對圖8的數(shù)據(jù)進行了標準化時的DNA擴增曲線。圖10:對圖8的數(shù)據(jù)進行了不完全標準化時的DNA擴增曲線。圖11:構成圖1的實時檢測裝置的處理裝置的功能區(qū)塊圖。
_0] 發(fā)明的
具體實施例方式以下,基于附圖對本發(fā)明的實施方式進行詳述。實施方式I圖1為本發(fā)明實施方式的實時檢測裝置R的結構圖,圖2為構成圖1的實時檢測裝置R的反應檢測裝置I的豎直剖面圖,圖3為反應檢測裝置I的水平剖面圖。本發(fā)明的實時檢測裝置R包括反應檢測裝置I和處理裝置C,所述處理裝置C包括對來自反應檢測裝置I的檢測數(shù)據(jù)進行實時處理的計算機。
實施方式的反應檢測裝置I是這樣的裝置:其在對作為反應樣品的染色體DNA進行擴增的同時,通過光學測定方法對與該擴增相關的反應狀態(tài)進行檢測。該反應檢測裝置I具備上面形成有反應室4的本體3、以及設置于該反應室4的后方、本體3的上面的反應檢測部5。而且,該反應室4中設置有由鋁等傳熱材料形成的反應區(qū)塊(反応7'口 'y ^ )6。該反應區(qū)塊6中形成有用于保持反應容器7的多個保持穴8,所述反應容器7具有多個孔7A..,所述孔7A..的內部收納有由DNA (目標模板:λ DNA等)、各種試劑、作為基質的溶液等混合而成的反應溶液。在本實施方式中使用的反應容器7是微孔板,其中,一體式地形成有縱向12個X橫向8個共96個作為反應區(qū)的孔7Α..,各孔7Α..通過連接壁(孔7Α(反應區(qū))外的區(qū)域、即反應區(qū)外區(qū)域)連接。而且,作為反應容器,孔并非僅限于一體化成形的制品,其還可以由多根管構成。此外,該孔7Α的個數(shù)并不限于此,除此之外,還可以由例如384個一體式地構成,其操作性好。此外,反應容器7的各孔7Α,其上面形成有開口,該上面開口貼合有密封材料( '>一> )制的蓋9,以阻止因溫度處理而引起的反應溶液的蒸發(fā)。此外,在本實施方式中,熒光強度檢測是透過該蓋9進行檢測的,因此使用光透過性的合成樹脂材料。而且,在該本體2內具有對反應區(qū)塊6進行加熱、冷卻的佩爾捷元件10。而且,通過利用未圖示的控制裝置對該佩爾捷元件10進行溫度控制,對反應區(qū)塊6循環(huán)式地進行加熱、冷卻,這樣,可以對反應容器7的各孔7Α內的DNA (反應樣品)進行培養(yǎng)(擴增)。在從設置于本體2后端上面的反應檢測部5到另一端(本實施方式中是形成有反應室4的本體2前端上方)的范圍內設置暗室結構部12。該暗室結構部12的前面向前方開放,而且,在該前面開口形成向前下方傾斜的所述擋蓋2,并使該擋蓋2開閉自如。而且,該擋蓋2的結構使其可以通過在暗室結構部12的前方即本體3上面前部到該暗室結構部12內后部的范圍內形成的軌道部件13前后移動,當處于移動至后方的狀態(tài)時,該擋蓋2被收納于暗室結構部12內。而且,在該擋蓋2內,在該擋蓋2閉合的狀態(tài)下,與反應室4的反應區(qū)塊6相對地一體設置按壓部件15,該按壓 部件15可以自由移動,其用于將反應容器7按在反應區(qū)塊6。該按壓部件15是由導熱性良好的鋁材等構成的板材,其上與各孔7Α的上面相對應地形成多個透孔(透孔)。而且,在該按壓部件15的上面一側(上側)設置有作為光學透鏡的菲涅耳透鏡21。該菲涅耳透鏡21通常是在平面上形成有多個溝,以此來折射、放大(拡大)入射光。此時,菲涅耳透鏡21在折射、放大入射光時,具有將入射光收斂為平行或接近平行的狀態(tài)并使之透過的光學特性,由此,入射光在進行投射時,處于將各光路的離散加以修正后的狀態(tài)。另一方面,在反應區(qū)塊6的上方,在構成封閉反應室4的前上方的擋蓋2的反應室
4一側的面上,設置有反射板22。本實施方式中的反射板22由鏡子等構成,所述鏡子等由平板構成,具體而言,其將后述的光源燈23發(fā)出的光反射(屈曲)向菲涅耳透鏡21。其它方面,在反應檢測部5內具備:光源燈23、具備多個帶通濾光器(克里斯欣森濾光器,> K M ” ”)的濾器裝置35、反射板26、CXD相機27以及轉動濾器裝置35的濾器驅動裝置28。光源燈23是這樣的燈,其根據(jù)反應液內的作為檢測對象的DNA產(chǎn)物的量照射光,所述光包含用于從該反應溶液激發(fā)熒光的激發(fā)光,其通常使用鹵素燈。反射板26將從光源燈23照射的指定波長的光反射成指定角度,使其射向反射板22 (反射板22 偏光 43 )。此外,該反射板26具有透過指定熒光的性質。在本實施方式中,從配置在反應檢測部5側部的光源燈23發(fā)出的光通過該反射板26被反射向前方,該光源燈23的光照射到反射板22。濾器裝置35是通過將多種帶通濾光器呈輪狀配置而構成的裝置,其在濾器驅動裝置28的驅動下轉動,從而選擇指定帶通濾光器,使其處于光源燈23與反射板26之間或反射板22與相機27之間。而且,在圖中,位于光源燈23與反射板26之間的是帶通濾光器24,位于反射板22與相機27之間的是帶通濾光器25。帶通濾光器24是具有如下性質的濾光器:在光源燈23發(fā)出的光成分中,其僅允許由反應溶液激發(fā)熒光所需波長的光透過;通過該濾器24的光為用于由反應溶液的特定成分激發(fā)出熒光的激發(fā)光。帶通濾光器25是具有如下性質的濾光器:通過反射板22而由反應容器7的各孔7Α內的反應溶液激發(fā)出的熒光及反射光中,其只允許指定的所熒光成分透過;這里,該熒光以外的反射光被遮蔽。相機27是對透過帶通濾光器25的熒光進行檢測的裝置,用該相機27檢測到的熒光圖像被輸入所述控制裝置從而送達處理裝置C,這樣來分析各反應溶液的濃度即擴增量。而且,在帶通濾光器24、25方面,根據(jù)作為檢測對象的反應溶液以及與之對應使用的熒光染料的種類,可以任意地確定這些帶通濾光器24、25的組合,并有選擇地使用。通過以上的結構,所述控制裝置控制所述佩爾捷元件10,實施熱變性步驟:將反應區(qū)塊6的保持穴8所保持的反應容器7內的反應溶液加熱到例如+95°C的熱變性溫度,使反應溶液熱變性。接著,控制裝置控制佩爾捷冷卻元件10,將反應區(qū)塊6冷卻到例如+60°C,進行收納于反應容器7內的熱變性 后的反應溶液中的DNA的退火步驟和延伸步驟??刂蒲b置以該熱變性步驟、退火步驟、延伸步驟為I個循環(huán),反復多次例如40次,由此進行利用PCR法的DNA等的培養(yǎng)(擴增)。在該培養(yǎng)過程中或該培養(yǎng)結束時,反應檢測部5定期地(例如在一個循環(huán)結束后)實施檢測行為,以檢測反應容器7內的反應溶液中DNA的擴增狀態(tài)。檢測行為中,首先,光源燈23照射的光經(jīng)由帶通濾光器24到達反射板26。帶通濾光器24僅允許光源燈23發(fā)出的光中的激發(fā)熒光所需波長的光、即激發(fā)光透過。該激發(fā)光由于反射板26而從暗室結構部12內通過,照射向反射板22方向,而且,由于反射板22,該激發(fā)光的照射方向朝向與反應區(qū)塊6相對設置的菲涅耳透鏡21,S卩,由上自下照射。照射到該菲涅耳透鏡21的激發(fā)光,由于該透鏡21的光學特性而對光進行聚焦,使入射角度改變?yōu)榕c收納于反應區(qū)塊6的反應容器7的各孔7A平行或接近平行的角度。這樣一來,透過該透鏡21的激發(fā)光經(jīng)由形成于按壓部件15的各透孔,以平行或接近平行的入射角度入射到各孔7A。以平行或接近平行的角度入射到各孔7A內的激發(fā)光,照射預先添加了指定熒光染料的孔7A內的DNA,由此,發(fā)出與PCR產(chǎn)物的量相應的熒光。產(chǎn)生的熒光以及來自其它PCR產(chǎn)物的反射光同樣經(jīng)由形成于按壓部件15的各透孔及菲涅耳透鏡21到達反射板22。此后,到達反射板22的熒光及其它反射光,在該反射板22的作用下,在暗室結構部12內沿基本水平方向形成光路,同時經(jīng)由與該反射板22對向設置的帶通濾光器25到達相機27。而且,這種情況下,由于擋蓋2的封閉,暗室結構部12內成為暗室,從而可以抑制突光裳減等不良事件。此時,由于反射板26由能夠透過熒光的材料構成,因此透過該反射板26的反射光及熒光會照射到帶通濾光器25。帶通濾光器25方面,如上所述,根據(jù)該濾器25的種類,只有指定熒光能夠透過,因此只有指定熒光會照射到設置于其后方的相機27。而且,在相機27,對接受的熒光進行拍攝,由此來檢測反應容器7的各孔7A內PCR產(chǎn)物的熒光狀態(tài)。然后,該檢測到的與各PCR產(chǎn)物的熒光狀態(tài)相關的檢測數(shù)據(jù)(圖4 圖
6所示圖像數(shù)據(jù))被從控制裝置輸送至處理裝置C,通過該處理裝置C的分析,能夠檢測各樣品的濃度,即DNA等的擴增量。由于各孔7A的位置與圖像的位置的關系是事先已知的,因此,通過求出孔7A的圖像的各像素的亮度,能夠分別測定孔7A的熒光強度,能夠由該熒光強度把握PCR產(chǎn)物的量。如圖11所示,處理裝置C包括運算處理部(CPU) 31、存儲裝置(存儲手段)32、鍵盤(或鼠標等輸入裝置)33、顯示器(輸出裝置)34、打印機(輸出裝置)36、外部存儲裝置37等,所述運算處理部(CPU) 31對由反應檢測裝置I輸送的檢測數(shù)據(jù)進行處理,所述存儲裝置(存儲手段)32與所述運算處理部31連接,所述外部存儲裝置37例如FDXD、DVD、存儲器等。由反應檢測裝置I輸送的檢測數(shù)據(jù)存儲于存儲裝置32,由運算處理部31來進行后述的處理,從而在顯示器34等上顯示輸出。下面,對該處理裝置C中的檢測數(shù)據(jù)處理程序進行說明。圖5、圖6為由反應檢測裝置I輸送至處理裝置C的檢測數(shù)據(jù)的圖像。各圖像中,顯現(xiàn)白色的96個圓形圖像分別為孔7A內的PCR產(chǎn)物發(fā)出的熒光。而且,在實施方式中,以SYBR Premix Ex Taq(注冊商標)為基礎,由PCR正向引物、PCR反向引物、模板(作為初期值投入的λ DNA)和dH20來調制反應溶液。此外,圖5、圖6中,上半部分的48個孔7A內分加了 0.2pg/μ L濃度的反應溶液(X組),下半部分的48個孔7Α內分加了加倍濃度即0.4pg/ μ L的反應溶液(Y組)。而且,溫度循環(huán)為40次。反應開始后,隨著溫度循環(huán)次數(shù)的增加,熒光強度相應于DNA的擴增量增加。描繪該過程的就是前述圖7的擴增曲線。該擴增曲線是分別對各孔7Α得到的,其顯示于顯示器34 (圖8)。然后,如果使用鍵盤(鼠標)33對指數(shù)函數(shù)擴增區(qū)(圖7的(5))設定閾值Th(圖7的(11)),則在該圖中可以讀出此時的循環(huán)數(shù)Ct (閾值循環(huán)數(shù)Ct)為24.5。該閾值循環(huán)數(shù)Ct與檢測樣品的初期DNA量之間存在相關關系,能夠制作出反映該線性關系的校正曲線。運算處理部31以該校正曲線為基礎推算檢測樣品的初期DNA量。這樣,可以基于PCR的擴增速度論進行準確的定量。(A)排除裝置方面的誤差因素如前述,在反應開始前反應檢測裝置I的相機27所拍攝的圖像數(shù)據(jù)中,各像素的亮度并非一定,如圖4的(I)所示,由于光學系統(tǒng)的污染、雜散光等會出現(xiàn)斑點。在反應進行中,則該斑點會如圖5的(2)中所示那樣,與孔7Α的圖像重疊,而被孔7Α固有的熒光強度拉長。因而,在處理裝置 C的運算處理部31中,為了求出孔固有的熒光強度,實施以下處理。即,例如,對于圖6中右數(shù)第2 二列上數(shù)第二行(Bll)的孔7Α,測定該Bll的孔7Α(圖6的(4))的熒光測定值[DNA]rawBll,存儲于存儲裝置32。接著,測定該Bll的孔7A附近的連接壁部分中周圍4點的熒光測定值[DNA]bgl、[DNA]bg2、[DNA]bg3、[DNA]bg4,求出這4點的熒光測定值的平均值(背景熒光測定值),存儲于存儲裝置32。然后,通過像式(2)那樣從熒光測定值[DNA]rawBll中減去該平均值,計算出Bll的孔7A固有的熒光強度[DNA]realBlο[DNA] realBl 1= [DNA] rawBll- (([DNA]bgl+ [DNA] bg2+ [DNA] bg3+ [DNA] bg4) /4) ...(2)在每次進行突光測定值[DNA] raw的檢測時,對于全部96個孔分別實施該處理,確定全部的孔7A固有的熒光強度[DNA]real。這樣一來,對于各孔7A(反應區(qū))分別得到了該孔7A的DNA產(chǎn)物固有的熒光強度[DNA] real,其中已經(jīng)扣除了由該孔7A及其周邊的光透過性的誤差或污染、以及雜散光等引起的背景熒光測定值[DNA]bg。因此,可以實現(xiàn)準確的擴增曲線的制作與定量化。此時,沒有必要使用在傳統(tǒng)方案中說明的第2熒光信號,而僅依靠處理裝置C中的運算處理即可完成,所以不會造成成本提高或操作性下降,能夠縮短獲取及處理數(shù)據(jù)所需的時間。而且,在實施方式中,測定孔7A的周圍4點的熒光測定值[DNA]bgl、[DNA]bg2、[DNA]bg3、[DNA]bg4,并將其平均值從熒光測定值[DNA]raw中扣除,但并不限于此,取I點,或者取2點或3點的平均均是可以的。只是像實施方式那樣使用4點的平均值的話,能夠更準確地計算出背景熒光強度,高精度地確定熒光強度[DNA]real。此外,實施方式中采用的是孔7A周圍4點熒光測定值的簡單平均,但并 不限于此,也可以考慮污染狀態(tài)的斑點,在對各點分別進行指定加權后,再進行平均。此外,反應前和反應后,背景熒光強度的變化(漂移,K U 7卜)并不明確。然而,在實施方式中,每次檢測熒光測定值[DNA]raw時,檢測熒光測定值[DNA]bgl [DNA]bg4,從熒光測定值[DNA]raw中減去熒光測定值[DNA]bgl [DNA]bg4的平均值,來確定熒光強度[DNA]real,因此,即使反應中背景熒光強度發(fā)生變化,通常也能夠實時地、精度良好地得到DNA產(chǎn)物固有的熒光強度[DNA]real。(B)標準化 I接著,圖8顯示了全部96個孔7A的擴增曲線。橫軸為溫度循環(huán)數(shù),縱軸為熒光強度。如前述,在圖5、圖6上半部分的X組與下半部分的Y組中,分加的反應溶液存在濃度差異,由此看來,如果是固有的話,反應曲線應該出現(xiàn)2條線。此外,閾值循環(huán)數(shù)Ct也應該為2個點。然而,由于前述光學系統(tǒng)的誤差、校正溶液的濃度誤差、校正溶液的分注誤差或反應溶液的分注誤差等裝置上的誤差因素,各孔7A的擴增曲線出現(xiàn)離散(〃 9 4 ),閾值循環(huán)數(shù)Ct也像⑶、(9)那樣出現(xiàn)了多個(離散)。因而,運算處理部31基于從鍵盤(鼠標)33的指定選擇指令,進行數(shù)據(jù)的標準化。即,運算處理部31使用按溫度循環(huán)數(shù)η確定并存儲于存儲裝置32中的熒光強度[DNA] η (第η個溫度循環(huán)的固有熒光強度[DNA] real)、每個孔7Α的熒光強度的最大值[DNA]max (到第η個溫度循環(huán)為止的熒光強度[DNA]real中最大的一個,存儲于存儲裝置32)、以及作為比較對象的孔7A(實施方式中是全部孔7A)共有的值Z,通過式(3)的運算,獲得標準化的熒光強度[DNA]nN。[DNA] nN= [DNA] n/ ([DNA] max+Z)...(3)
通過該處理,將各孔7A的熒光強度標準化。圖9為Z=O的情況。通過該標準化可以校正降低各孔7A的由裝置上的誤差因素引起的熒光強度離散,因此,與圖8的情況相比,X組、Y組各自的閾值循環(huán)數(shù)Ct的離散有所降低。由此,可以高準確度地計算出閾值循環(huán)數(shù)。而且,在圖9中,為了使整體尺度為合適的值,將[DNA]nN乘以一個全部孔共有的值來表不。(C)標準化 2這里,作為在循環(huán)后期的平臺區(qū)熒光強度出現(xiàn)離散的因素,除了上述裝置上的誤差因素之外,還會因化學反應的離散而發(fā)生。而且,關于該因素,可以認為其并非成比例地影響指數(shù)函數(shù)擴增區(qū)的熒光強度。即,有些情況下,使平臺效應的區(qū)域的熒光強度不完全一致是比較好的。這種情況下,使用鍵盤(鼠標)33使式(3)的Z的值增大。圖10顯示了 Z=20000時的各個孔7A的擴增曲線。使Z的值增大會弱化標準化的效果。然而,在圖10中可知:特別是從循環(huán)中期到后期的擴增曲線的行為與實際熒光強度的行為(圖8)相近似。另一方面,可以充分確保了閾值處的校正效果。這樣一來,抑制了標準化的效果,充分確保了閾值處的校正效果,而且使從循環(huán)中期到后期的擴增曲線與實際數(shù)據(jù)近似,可以容易地把握由裝置誤差因素以外的因素引起的數(shù)據(jù)的行為。這里,在進行這樣的不完全標準化時,可以如式(4)那樣確定Z的值。Z= a [DNA] max+ β...(4)α、β為各孔7Α共有的系數(shù)。此外,運算處理部31使用熒光強度的移動平均數(shù)來計算前述的最大值[DNA]max。這是因為熒光強度[DNA]real實際上呈現(xiàn)鋸齒(V - )狀。然而,作為用于標準化的最大值,可以使用該鋸齒的峰·值,也可以使用該峰值的例如90%等數(shù)值(這些都是與最大值相關的值)。(D)基線的校正這里,圖8的(10)為循環(huán)初期其反應結果的水平無法檢測的區(qū),但,由于孔7A內的反應溶液本身自始發(fā)出一定的熒光,所以該區(qū)中通常熒光強度也并非為O。因而,基于來自鍵盤(鼠標)33的指示,運算處理部31進行基線的校正。S卩,運算處理部31以循環(huán)初期的區(qū)(10)的各孔7A的熒光強度的平均值[DNA]base為基線,從前述[DNA]n及[DNA]max中減去該平均值后,進行上述標準化處理。圖9、圖10中,初期熒光強度為零0,這是因為進行了該處理([DNA]base可以使用[DNA]n的最小值)。這樣一來,能夠把握來自PCR產(chǎn)物本身的熒光強度的狀況,其中,排除了孔7A內的反應溶液本身發(fā)出的熒光的強度。而且,不言自明的是,上述實施方式所示的物質、量、數(shù)并非僅限于此。
權利要求
1.一種核酸擴增產(chǎn)物實時檢測裝置,該裝置對多個反應區(qū)實施溫度循環(huán),實時檢測來自各反應區(qū)中的核酸擴增產(chǎn)物的熒光強度,其中, 檢測從所述反應區(qū)得到的熒光測定值[DNA]raw、以及從該反應區(qū)附近的反應區(qū)外區(qū)域得到的熒光測定值[DNA]bg,并從所述熒光測定值[DNA]raw中減去所述熒光測定值[DNA]bg,由此來確定該反應區(qū)的熒光強度[DNA]real。
2.權利要求1的核酸擴增產(chǎn)物實時檢測裝置,其中,所述熒光測定值[DNA]bg為從所述反應區(qū)附近的多個反應區(qū)外區(qū)域得到的熒光測定值的簡單平均、或者進行了指定加權后的平均值。
3.權利要求1或權利要求2的核酸擴增產(chǎn)物實時檢測裝置,其中,在每次檢測所述熒光測定值[DNA] raw時,檢測所述熒光測定值[DNA]bg,并從該熒光測定值[DNA]raw中減去熒光測定值[DNA ]bg,由此來確定所述熒光強度[DNA]real。
全文摘要
本發(fā)明提供一種核酸擴增產(chǎn)物實時檢測裝置,其能夠有效地排除或降低裝置方面的致誤差因素,而無需使用用于修正的第2熒光信號。對多個孔(7A)實施溫度循環(huán),并實時檢測來自各孔(7A)中的核酸擴增產(chǎn)物的熒光強度。檢測得自孔(7A)的熒光測定值[DNA]raw、以及得自該孔(7A)鄰近周邊的連接壁的熒光測定值[DNA]bg,通過從熒光測定值[DNA]raw中減去熒光測定值[DNA]bg來確定該孔(7A)的熒光強度[DNA]real。
文檔編號C12M1/34GK103232936SQ201310077508
公開日2013年8月7日 申請日期2007年3月1日 優(yōu)先權日2006年3月6日
發(fā)明者玉置裕一, 巖間明文, 園田泰亮 申請人:松下健康醫(yī)療器械株式會社