本發(fā)明涉及基因工程與腫瘤學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種與乳腺癌化療毒性相關(guān)的snp標(biāo)志物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

乳腺癌是一種嚴(yán)重危害女性身心健康的常見(jiàn)惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率逐年上升，全球每年有120萬(wàn)婦女患乳腺癌，50萬(wàn)婦女死于乳腺癌?；瘜W(xué)治療已與手術(shù)治療、放射治療一樣成為腫瘤治療的主要手段。隨著化療藥物的不斷更新，乳腺癌在化學(xué)治療方面已取得了令人矚目的進(jìn)展。紫杉醇類和蒽環(huán)類藥物經(jīng)過(guò)多年的臨床實(shí)踐已成為乳腺癌化療的兩大基石,廣泛用于一線和二線局部晚期以及復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療，規(guī)范的治療能明顯改善乳腺癌的預(yù)后。但在臨床實(shí)踐和研究中也發(fā)現(xiàn)，乳腺癌的化療療效、毒副反應(yīng)存在個(gè)體差異，紫杉醇單藥用于一線治療的有效率為32-62％，多西紫杉醇用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療反應(yīng)率為30-50％。

因此，從藥物遺傳學(xué)和藥物基因組學(xué)角度研究患者之間藥物敏感性的差異，尋找可靠的預(yù)測(cè)指標(biāo)，指導(dǎo)個(gè)體化治療，對(duì)于指導(dǎo)個(gè)體化治療、改善患者的預(yù)后，提高臨床用藥的有效性和安全性具有極其重要的意義。同時(shí)也為研究不同患者之間藥物敏感性方面的差異開辟了新的途徑。

研究表明，單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，snp)是引起藥物毒副反應(yīng)的重要遺傳因素。snp是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的dna序列多態(tài)性，它是人類最常見(jiàn)的可遺傳變異，在人類基因組中廣泛存在。snp表現(xiàn)出的多態(tài)性僅涉及到單個(gè)堿基的變異，表現(xiàn)是有轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失等。單核苷酸多態(tài)性為第三代遺傳標(biāo)志，人體許多表型差異、對(duì)藥物或疾病的易感性等等都可能與snp有關(guān)。目前對(duì)于不同分型乳腺癌預(yù)后、療效的預(yù)測(cè)性研究主要集中在snp水平。近年來(lái)，利用snp診斷疾病的發(fā)生發(fā)展已成為臨床和科研工作者的研究熱點(diǎn)。然而，目前還沒(méi)有將snp應(yīng)用于乳腺癌化療藥物毒性輔助診斷的報(bào)道，若能篩選出乳腺癌易感的snp作為生物標(biāo)志物，研究其在輔助診斷乳腺癌化療藥物毒性方面的作用，并研制相應(yīng)的診斷試劑盒，必將有力地推動(dòng)我國(guó)乳腺癌預(yù)后評(píng)價(jià)的現(xiàn)狀，并為化療藥物篩選、藥效評(píng)價(jià)及靶向治療開辟新的途徑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種與乳腺癌化療毒性相關(guān)的snp標(biāo)志物及其應(yīng)用，通過(guò)對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(fgfr)基因上的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)遺傳特異性的研究，提出兩個(gè)可作為輔助診斷乳腺癌化療藥物毒性的snp位點(diǎn)，以用于指導(dǎo)腫瘤化療用藥。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種與乳腺癌化療毒性相關(guān)的snp標(biāo)志物，其包括fgfr2基因上的rs2420946、fgfr2基因上的rs2981578中的至少一種。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種上述snp標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物，該特異性引物是指針對(duì)上述兩個(gè)基因多態(tài)位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能特異性擴(kuò)增出包含這2個(gè)snp位點(diǎn)中的至少一個(gè)的dna片段的引物對(duì)。特異性引物對(duì)可用常規(guī)的合成技術(shù)進(jìn)行合成。snp標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物包括rs2420946的擴(kuò)增引物、rs2981578的擴(kuò)增引物中的至少一種；其中，rs2420946的擴(kuò)增引物序列為seqidno：1和seqidno：2，rs2981578的擴(kuò)增引物序列為seqidno：3和seqidno：4。

上述snp位點(diǎn)：rs2420946和rs2981578的引物信息如下表所示：

表1.相關(guān)snp位點(diǎn)的引物信息

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種上述snp標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物在制備用于檢測(cè)或預(yù)測(cè)乳腺癌化療毒性的試劑盒中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種上述snp標(biāo)志物在制備乳腺癌化療藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種含有上述snp標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物的用于檢測(cè)或預(yù)測(cè)乳腺癌化療毒性的試劑盒。

優(yōu)選地，該試劑盒用于檢測(cè)外周血dna中的rs2420946和/或rs2981578。

優(yōu)選地，該試劑盒還可以包括pcr反應(yīng)常用的酶和試劑，如taq酶、dntp混合液、mgcl2溶液、去離子水(蒸餾水)等；還可以含有標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌贰?/p>

本發(fā)明的技術(shù)方案具體包括：

(1)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口學(xué)資料和臨床資料；

(2)基因型檢測(cè)：選擇乳腺癌化療病例，查閱已有文獻(xiàn)，找出與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)或預(yù)后相關(guān)的snp；對(duì)篩選出的snp，進(jìn)一步采用基因分型進(jìn)行檢測(cè)，找出與乳腺癌化療毒性相關(guān)的snp；

(3)乳腺癌化療毒性輔助診斷試劑盒的研制：根據(jù)乳腺癌化療病例中不同化療毒性反應(yīng)患者基因型分布頻率有顯著差異的snp開發(fā)snp乳腺癌化療毒性輔助診斷試劑盒。

具體來(lái)說(shuō)研究的實(shí)驗(yàn)方法主要包括以下幾個(gè)部分：

1.研究樣本的選擇；

(1)首次入院就診并經(jīng)病理組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診的新發(fā)乳腺癌患者，其診斷按照世界衛(wèi)生組織頒布的標(biāo)準(zhǔn)由至少兩位病理科醫(yī)生確認(rèn)；

(2)首次化療前血常規(guī)、肝腎功能檢查各項(xiàng)指標(biāo)均正常；

(3)接受4周期的環(huán)磷酰胺+多西他賽+表柔比星方案的化療；排除化療前或化療期間接受放療的乳腺癌患者；

(4)有詳細(xì)的化療2周期或3周期后血常規(guī)、肝腎功能檢查數(shù)據(jù)。

本研究共采用211例符合標(biāo)準(zhǔn)的樣本進(jìn)行研究。

2.采用可以特異性結(jié)合dna的離心吸附柱和獨(dú)特的緩沖系統(tǒng)，提取外周血基因組dna，按常規(guī)方法操作。通常能得到20-50ng/μldna，純度(紫外2600d：2800d)在1.6-2.0。

3.篩查snp：查閱已有文獻(xiàn)，篩選出已報(bào)道與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)或乳腺癌預(yù)后相關(guān)的snp位點(diǎn)。

4.單個(gè)snp的基因分型；

(1)取受試者dna樣本；

(2)設(shè)計(jì)單個(gè)snp的特異性擴(kuò)增引物；

(3)進(jìn)行pcr反應(yīng)，回收產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

5.統(tǒng)計(jì)分析方法

運(yùn)用卡方檢驗(yàn)(用于分類變量)或者studentt檢驗(yàn)(用于連續(xù)性變量)比較人口學(xué)特征、吸煙、組織類型、分期等在研究對(duì)象組間分布的差異。用logistic回歸分析中的additive模型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，計(jì)算比值比(oddsratio,or)以及它們的95％可信區(qū)間，以此評(píng)估基因位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)乳腺癌患者化療毒性的影響。

6.診斷試劑盒制備方法；

單個(gè)snp檢測(cè)后確定乳腺癌化療病例中不同化療毒性反應(yīng)患者基因型分布頻率有顯著差異的snp，作為乳腺癌化療毒性診斷的指標(biāo)。篩選出的與乳腺癌化療毒性有關(guān)的snp輔助診斷試劑盒，其包含fgfr2基因上rs2420946和/或fgfr2基因上rs2981578位點(diǎn)的特異性擴(kuò)增引物，以及taq酶、dntps等試劑。

7.臨床應(yīng)用；

利用本發(fā)明人制備的乳腺癌化療毒性輔助診斷試劑盒檢測(cè)待篩查的乳腺癌化療患者并與實(shí)際臨床檢測(cè)相比較以確定了乳腺癌化療毒性輔助診斷試劑盒的有效性。具體包括測(cè)定受試者血標(biāo)本中上述snp的特異性擴(kuò)增引物和其他檢測(cè)試劑，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者的化療反應(yīng)和預(yù)后情況，及時(shí)采用更具個(gè)體化的給藥方案提供支持。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明提供的snp標(biāo)志物作為化療毒性相關(guān)的標(biāo)志物的優(yōu)越性在于：

(1)snp是一種新型基因生物標(biāo)志物，區(qū)別于傳統(tǒng)生物標(biāo)志物，穩(wěn)定、微創(chuàng)、易于檢測(cè)，將大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，該類生物標(biāo)志物的成功開發(fā)將為化療藥物毒性的診斷和控制開創(chuàng)全新局面，為其他疾病生物標(biāo)志物的研制提供借鑒。

(2)snp試劑盒是一種系統(tǒng)、全面的診斷試劑盒，可用于化療藥物毒性反應(yīng)的輔助診斷，有助于反映乳腺癌患者對(duì)藥物毒性的易患程度，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者病情、及時(shí)采取更具個(gè)性化的防治方案提供支持。

本發(fā)明研究snp在乳腺癌化療毒性輔助診斷的應(yīng)用前景，闡述snp對(duì)于乳腺癌化療預(yù)后的影響，揭示其診斷價(jià)值。因此，本發(fā)明通過(guò)snp生物標(biāo)志物和乳腺癌化療毒性診斷試劑盒的研制和應(yīng)用，對(duì)乳腺癌化療后毒性反應(yīng)程度進(jìn)行預(yù)測(cè)，從而指導(dǎo)腫瘤化療用藥、為臨床醫(yī)生預(yù)測(cè)患者預(yù)后提供新的途徑。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步描述。以下實(shí)施例僅用于更加清楚地說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而不能以此來(lái)限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實(shí)施例一

本實(shí)施例為樣品的收集和樣品資料的整理。

發(fā)明人于2015年9月至2016年11月在上復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院(北院)收集了大量的乳腺癌化療患者血標(biāo)本，通過(guò)對(duì)樣品資料的整理，發(fā)明人從中選擇了211例符合下列標(biāo)準(zhǔn)的樣本，樣本選擇標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)首次入院就診并經(jīng)病理組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診的新發(fā)乳腺癌患者，其診斷按照世界衛(wèi)生組織頒布的標(biāo)準(zhǔn)由至少兩位病理科醫(yī)生確認(rèn)；(2)首次化療前血常規(guī)、肝腎功能檢查各項(xiàng)指標(biāo)均正常；(3)接受4周期的環(huán)磷酰胺+多西他賽+表柔比星方案的化療；排除化療前或化療期間接受放療的乳腺癌患者；(4)有詳細(xì)的化療2周期或3周期后血常規(guī)、肝腎功能檢查數(shù)據(jù)。并系統(tǒng)采集了這些樣本的人口學(xué)資料和臨床資料等情況。

實(shí)施例二

本實(shí)施例為外周血dna提取、基因型檢測(cè)及結(jié)果分析。

具體步驟為：

1)處理血液材料，取200μl血液樣品。

2)加入20μlproteinasek溶液，混勻。

3)加200μl緩沖液gb，充分顛倒混勻，56℃放置10min，其間顛倒混勻數(shù)次，溶液應(yīng)變清亮。

4)加200μl無(wú)水乙醇，充分顛倒混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。

5)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱cb3中(吸附柱cb3放入收集管中)，12000rpm(～13400×g)離心30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cb3放入收集管中。

6)向吸附柱cb3中加入500μl緩沖液gd(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，12000rpm(～13400×g)離心30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cb3放入收集管中。

7)向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw，12000rpm(～13400×g)離心30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cb3放入收集管中。

8)重復(fù)操作步驟7。

9)12000rpm(～13400×g)離心2min，倒掉廢液。將吸附柱cb3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

10)將吸附柱cb3轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加50-200μl洗脫緩沖液tb，室溫放置2-5min，12000rpm(～13400×g)離心2min，將溶液收集到離心管中。

11)測(cè)量濃度：通常能得到20-50ng/μldna，純度(紫外2600d：2800d)在1.8-2.0。

12)測(cè)序：對(duì)與乳腺癌化療藥物的毒性反應(yīng)有關(guān)的2個(gè)snp設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物；pcr擴(kuò)增結(jié)束后，取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物，1％瓊脂糖凝膠電泳，電泳30min，染色20min，然后將凝膠塊置于凝膠成像儀中觀察，根據(jù)比對(duì)marker的片段大小情況，初步判斷擴(kuò)增片段是否正確。進(jìn)而對(duì)符合要求的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化：采用mag-bindoligonucleotidepurificationkit試劑盒，并按試劑盒要求進(jìn)行操作。上樣測(cè)序：采用abi公司bigdye3.1sequencingkit試劑盒，并按試劑盒要求進(jìn)行操作；用abi公司3730型測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

13)數(shù)據(jù)分析與處理:在接受藥物化療后發(fā)生不同程度毒性的乳腺癌患者中發(fā)現(xiàn)的基因型分布頻率有顯著差異的snp。fgfr2rs2420946堿基從t突變?yōu)閏，乳腺癌患者化療毒性增加(p＝0.038，or＝2.350，95％ci＝1.047-5.276)，rs2420946堿基為c的個(gè)體化療后發(fā)生不良反應(yīng)事件機(jī)率增加(p＝0.013，or＝1.652,95％ci＝1.109-2.459),隱形模型(ccvs.ct/tt)為(p＝0.019，or＝0.513，95％ci＝0.294-0.895)；fgfr2rs2981578堿基從g突變?yōu)閍，乳腺癌患者化療毒性增加(p<0.0001，or＝53.963，95％ci＝7.164-406.486)，rs2981578堿基為a的個(gè)體化療后發(fā)生不良反應(yīng)事件機(jī)率增加(p<0.0001，or＝3.048，95％ci＝1.868-4.972),顯性模型(ggvs.ag/aa)為(p<0.0001，or＝5.570，95％ci＝2.852-10.880)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2單核苷酸多態(tài)性與乳腺癌患者不同程度化療毒性的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

實(shí)施例三

本實(shí)施例為用于檢測(cè)或預(yù)測(cè)乳腺癌化療毒性的試劑盒的制作。

snp試劑盒的制作和操作流程是基于sequenommassarray基因分型平臺(tái)檢測(cè)技術(shù)。試劑盒含有一批snp特異性擴(kuò)增引物(包括下列引物：序列為seqidno:1和seqidno:2的rs2420946擴(kuò)增引物和/或序列為seqidno:3和seqidno:4的rs2981578，詳見(jiàn)上表1)，還可以有相應(yīng)pcr技術(shù)所需的常用試劑，如：dntps，mgcl2，雙蒸水等，這些常用試劑都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，另外還可以有標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照(如確定基因型的標(biāo)準(zhǔn)品和空白對(duì)照等)。此試劑盒的價(jià)值在于只需要外周血而不需要其它組織樣品，通過(guò)最精簡(jiǎn)和特異的擴(kuò)增引物及延伸引物檢測(cè)snp，再通過(guò)snp譜評(píng)價(jià)接受藥物化療的腫瘤患者毒副反應(yīng)，不僅穩(wěn)定，檢測(cè)方便，且精確，大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，因此將此試劑盒投入實(shí)踐，可以幫助指導(dǎo)高危人群的篩檢和更有效的個(gè)體化治療。

以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院北院

<120>一種與乳腺癌化療毒性相關(guān)的snp標(biāo)志物及其應(yīng)用

<160>4

<170>patentinversion3.5

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<223>snp位點(diǎn)rs2420946的上游引物，5'-3'

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<223>snp位點(diǎn)rs2981578的上游引物，5'-3'

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<223>snp位點(diǎn)rs2981578的下游引物，5'-3'

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