本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雙相酶水解獲取寶藿苷I的方法。

背景技術(shù)：

寶藿苷I（Icariside I，又名淫羊藿次苷II）為小檗科淫羊藿屬植物淫羊藿（Epimedium brevicornum Maxim.）中的一種多羥基黃酮類單體成分，有較好的抗腫瘤和抗骨質(zhì)疏松活性，明顯優(yōu)于淫羊藿中其他黃酮苷類化合物，有被開發(fā)成具有良好療效的抗癌藥物的前景。

寶藿苷I是淫羊藿苷脫去一分子葡萄糖的產(chǎn)物（見圖1），有報道大鼠口服淫羊藿苷后在糞便和尿液中均檢出寶藿苷I，推測大鼠腸菌酶可將淫羊藿苷轉(zhuǎn)化為寶藿苷I，吸收入血的主要為寶藿苷I，亦有文獻(xiàn)報道其生物藥劑學(xué)性質(zhì)明顯優(yōu)于淫羊藿中其他黃酮類多糖苷，可能是其藥效顯著的主要原因。

寶藿苷I可以從淫羊藿植物中直接提取，然而淫羊藿中一般以淫羊藿苷形式存在，寶藿苷I的含量很低，只有約0.17 mg/g，且淫羊藿中極性相當(dāng)?shù)某煞趾芏?，分離純化較困難，產(chǎn)率較低，故單純提取分離難以滿足應(yīng)用的需求，因此目前主要是通過淫羊藿苷制備寶藿苷I。傳統(tǒng)的酸水解或堿水解反應(yīng)，反應(yīng)條件苛刻，操作復(fù)雜，不利于環(huán)境保護(hù)，且反應(yīng)徹底，使得淫羊藿苷及其他黃酮苷類成分上連接的糖全部水解，得到相應(yīng)的苷元，而不是寶藿苷I等次級苷，所以采用酸堿水解法水解淫羊藿苷或提取物制備寶藿苷I是不可行的，因此目前常采用酶解法。酶水解反應(yīng)反應(yīng)條件溫和，操作簡便，且有利于環(huán)境保護(hù)，但是酶在有機溶劑中無法發(fā)揮效應(yīng)，而淫羊藿苷在水性酶解體系中溶解度很低，限制了其與酶接觸的幾率，導(dǎo)致酶解轉(zhuǎn)化周期較長，不利于規(guī)?；a(chǎn)，長期以來相關(guān)研究者進(jìn)行了很多有益的嘗試，例如采用超聲輔助或者采用環(huán)糊精包合技術(shù)的方法促進(jìn)淫羊藿苷溶解，該類技術(shù)在一定程度上提高了轉(zhuǎn)化速率和產(chǎn)率，但仍存在以下缺點：一是酶解產(chǎn)物寶藿苷I與淫羊藿苷同時存在，酶解反應(yīng)無法進(jìn)行完全；二是操作步驟多，必須采用適當(dāng)?shù)娜軇┌褜氜杰誌從水性酶解體系中分離出來；三是酶解反應(yīng)體系中成分復(fù)雜，酶回收困難。

隨著寶藿苷I研究的深入，其活性逐漸明確，因此其制備技術(shù)也受到越來越多的重視，而適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的工藝還未有報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有寶藿苷I制備技術(shù)中操作步驟多、成本較高、得率較低、周期長等不足，提供一種基于雙相酶水解技術(shù)從淫羊藿中直接獲取寶藿苷I的方法。

本發(fā)明雙相酶水解法獲取寶藿苷I的方法，實施流程圖如圖3所示，具體按照下述步驟進(jìn)行：

（1）稱取淫羊藿苷粉，加入醋酸-醋酸鈉緩沖溶液或者磷酸鹽緩沖溶液，混勻，得到淫羊藿苷混懸液；

（2）步驟（1）所得淫羊藿苷混懸液中加入水解酶，混勻，并加入乙酸乙酯，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速后加熱，使得淫羊藿苷在雙相溶劑條件下進(jìn)行水解反應(yīng)，冷卻；

（3）分取乙酸乙酯溶液，減壓回收溶劑至干，即得寶藿苷I。

其中，步驟（1）中的淫羊藿苷是指淫羊藿苷含量為80%及以上的淫羊藿苷粗品或淫羊藿苷純品；

所述醋酸-醋酸鈉緩沖溶液的pH值介于3.5～5.5；所述磷酸鹽緩沖溶液的pH值介于3.5～5.5；

所述淫羊藿苷與緩沖溶液的比例為1 g:100～10000 mL；

步驟（2）中所述的酶為β-葡萄糖苷酶、纖維素酶或β-葡聚糖酶中的一種；

所述淫羊藿苷與酶的體積比為1:40～10:1；

所述淫羊藿苷混懸液與乙酸乙酯的體積比為1:0.5～2.5；

所述攪拌轉(zhuǎn)速為50 rpm～200 rpm，40℃～55℃加熱；

所述水解反應(yīng)時間為0.5 h～48 h。

淫羊藿植物中的淫羊藿苷含量較高，在水中溶解度較小，易溶于乙酸乙酯、丙酮等中等極性溶劑，而寶藿苷I在水中幾乎不溶，但也易溶于中等極性溶劑。本發(fā)明中的雙相酶水解法采用β-葡萄糖苷酶、纖維素酶或β-葡聚糖酶水解淫羊藿苷得到寶藿苷I；利用水性酶解體系（水相）和中等極性溶劑（有機相）相互不能混溶的原理構(gòu)筑雙相反應(yīng)體系；淫羊藿苷大部分存在于有機相，在攪拌條件下不斷進(jìn)入水相發(fā)生酶解反應(yīng)，產(chǎn)物寶藿苷I則快速轉(zhuǎn)移至有機相，促使酶解完全、快速反應(yīng)，本發(fā)明中雙相酶水解法的示意圖如圖2所示。

本發(fā)明創(chuàng)新性地將雙相體系引入淫羊藿苷制備寶藿苷I中，使有機相成為天然的原料庫和產(chǎn)品庫，而水相則為生產(chǎn)車間，解決了淫羊藿苷水溶性差導(dǎo)致的酶解慢和不完全的問題。因此本發(fā)明中的方法較現(xiàn)有方法更適合于大規(guī)模生產(chǎn)寶藿苷I。

本發(fā)明的有益效果具體闡述如下：

（1）本發(fā)明的制備方法將淫羊藿中淫羊藿苷的水解與寶藿苷I的萃取兩步合為一步，簡化操作步驟，縮短了制備周期；

（2）本發(fā)明的制備方法中雙相體系使淫羊藿苷少量且持續(xù)進(jìn)入水相，確保淫羊藿苷與酶較大的接觸程度，大大提高了轉(zhuǎn)化速率，減少制備時間；

（3）本發(fā)明雙相體系中產(chǎn)物寶藿苷I在水相中生成，快速轉(zhuǎn)移至有機相，確保反應(yīng)完全，同時可減少制備過程中副反應(yīng)的發(fā)生，提高了寶藿苷I得率；

（4）本發(fā)明的雙相體系使酶用量大大減少，降低了制備成本；

（5）本發(fā)明的制備方法可以使淫羊藿苷酶解完全，最終水相和有機相中成分簡單，減少了純化分離過程；

（6）本發(fā)明的制備方法采用酶水解淫羊藿苷獲取寶藿苷I，制備過程溫度在60℃以下，減少了原料和產(chǎn)物分解，且不使用酸堿，有機溶劑可回收再利用，因此對環(huán)境幾乎沒有污染。

附圖說明

圖1 淫羊藿苷和寶藿苷I分子結(jié)構(gòu)圖。

圖2 雙相酶水解法的示意圖。

圖3 雙相酶水解法制備寶藿苷I工藝的流程圖。

圖4 酶水解前后高效液相色譜圖。

具體實施方式

為使本技術(shù)領(lǐng)域人員更好的理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合附圖和具體實施例進(jìn)行描述。

實施例1：

稱取淫羊藿苷對照品0.1 g，加入醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（pH 3.5）200 mL，混勻，得到淫羊藿苷混懸液。上述淫羊藿苷混懸液中加入β-葡萄糖苷酶4.0 g混勻，加入100 mL乙酸乙酯，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速為200 rpm，50℃加熱反應(yīng)0.5 h，冷卻，分取乙酸乙酯溶液，減壓回收溶劑至干，即得寶藿苷I產(chǎn)品。酶水解前后高效液相色譜圖如圖4所示，可見淫羊藿苷在上述條件下已經(jīng)全部水解為寶藿苷I，得率100%。

實施例2：

稱取淫羊藿苷對照品0.1 g，加入醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（pH 5.5）1000 mL，混勻，得到淫羊藿苷混懸液，上述淫羊藿苷混懸液中加入β-葡萄糖苷酶0.5 g，混勻，加入500 mL乙酸乙酯，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速為50 rpm，40℃加熱反應(yīng)24 h，冷卻，分取乙酸乙酯溶液，減壓回收溶劑至干，即得寶藿苷I，得率98.6%。

實施例3：

稱取淫羊藿苷對照品0.1 g，加入醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（pH 5.0）200 mL，混勻，得到淫羊藿苷混懸液，上述淫羊藿苷混懸液中加入β-葡萄糖苷酶2 g，混勻，加入500 mL乙酸乙酯，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速為150 rpm，50℃加熱2 h，冷卻，分取乙酸乙酯溶液，減壓回收溶劑至干，即得寶藿苷I，得率100%。

實施例4：

稱取淫羊藿苷對照品0.1 g，加入磷酸鹽緩沖溶液（pH 5.5）200 mL，混勻，得到淫羊藿苷混懸液。上述淫羊藿苷混懸液中加入纖維素酶2.0 g混勻，加入200 mL乙酸乙酯，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速為100 rpm，50℃加熱反應(yīng)3 h，冷卻，分取乙酸乙酯溶液，減壓回收溶劑至干，即得寶藿苷I產(chǎn)品，寶藿苷I得率100%。

實施例5：

稱取淫羊藿苷提取物細(xì)粉1.0 g，加入磷酸鹽緩沖溶液（pH 4.0）100 mL，混勻，得到淫羊藿苷混懸液。上述淫羊藿苷混懸液中加入β-葡聚糖酶0.1 g混勻，加入200 mL乙酸乙酯，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速為100 rpm，55℃加熱反應(yīng)24 h，冷卻，分取乙酸乙酯溶液，減壓回收溶劑至干，即得寶藿苷I產(chǎn)品，寶藿苷I得率98.0%。

實施例6：

稱取淫羊藿苷提取物細(xì)粉1.0 g，加入磷酸鹽緩沖溶液（pH 5.0）100 mL，混勻，得到淫羊藿苷混懸液。上述淫羊藿苷混懸液中加入β-葡聚糖酶1.0 g混勻，加入250 mL乙酸乙酯，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速為50 rpm，50℃加熱反應(yīng)48 h，冷卻，分取乙酸乙酯溶液，減壓回收溶劑至干，即得寶藿苷I產(chǎn)品，寶藿苷I得率99.2%。