本發(fā)明涉及添加劑
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是涉及一種輔酶混合溶液。本發(fā)明還涉及一種輔酶混合溶液的制備方法。
背景技術(shù)：
：ATP是細(xì)胞重要的供能物質(zhì)和輔酶，而煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD，也稱輔酶Ⅰ或線粒體素，是細(xì)胞內(nèi)糖酵解途徑和細(xì)胞呼吸的重要細(xì)胞因子。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADP也稱輔酶Ⅱ，是合成核酸和脂肪酸的重要細(xì)胞因子。隨著綠色酶化學(xué)工程的發(fā)展，利用生物酶在體外實(shí)現(xiàn)重要化合物的合成成為現(xiàn)實(shí)，大部分酶反應(yīng)均需要輔酶的供能或質(zhì)子轉(zhuǎn)移、磷酸根轉(zhuǎn)移。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種輔酶混合溶液，它具有能夠較好促進(jìn)酶化學(xué)反應(yīng)的特點(diǎn)。本發(fā)明還公開了一種輔酶混合溶液的制備方法。本發(fā)明所采用的第一個(gè)技術(shù)方案是：輔酶混合溶液，所述輔酶混合溶液含ATP不少于50mg/ml、NAD不少于2mg/ml、NADP不少于5mg/ml，且含有NADH不少于0.5mg/mL、NADPH不少于0.2mg/mL、AMP不少于0.1mg/mL、ADP不少于0.1mg/mL。本發(fā)明所采用的第二個(gè)技術(shù)方案是：輔酶混合溶液的制備方法，依次包括以下步驟：（1）取含水量不高于50%的釀酒酵母，超聲波破碎30—120min得到破碎酵母；（2）向破碎酵母中按破碎酵母重量1.5—2.5%的重量添加腺苷，之后加熱到35—40°C形成混合料；（3）取硫酸鎂、磷酸氫二鉀、葡萄糖作為輔料，將輔料和混合料添加到水中，且采用磷酸調(diào)節(jié)PH為6.5—7.0，加熱到35—40°C后，得到第一混合液，其中，硫酸鎂、磷酸氫二鉀、葡萄糖的添加量分別為破碎酵母重量的0.15—0.25%、1.5—2.5%、4—6%，水的重量為破碎酵母重量的1—2倍；（4）繼續(xù)攪拌第一混合液30—60min后，向第一混合液中添加色氨酸，攪拌反應(yīng)30—60min得到第二混合液，其中，色氨酸的添加量按腺苷重量的5—15%；（5）靜置第二混合液20—40min，然后向第二混合液中添加純度不低于20%的NAD激酶繼續(xù)反應(yīng)25—35min得到第三混合液，其中，NAD激酶的添加量為腺苷重量的0.005—0.015%；（6）靜置第三混合液至少30min，然后用磷酸調(diào)PH為2.5—3.5得第四混合液；（7）對(duì)第四混合液進(jìn)行離心，取上清液，上清液經(jīng)過離子交換柱處理后，再依次采用低鹽洗脫、高鹽洗脫，收集全部溶液，接著經(jīng)納濾濃縮15—25倍，即得輔酶混合溶液。本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)是：能夠較好促進(jìn)酶化學(xué)反應(yīng)。本發(fā)明的輔酶混合溶液的化學(xué)成分較為合理，對(duì)酶化學(xué)反應(yīng)具有較好的促進(jìn)作用。本發(fā)明的輔酶混合溶液的制備方法利用釀酒酵母酶系添加基因工程N(yùn)ADH激酶作為工程酶系，添加原輔料轉(zhuǎn)化生產(chǎn)三磷酸腺苷ATP的同時(shí)，聯(lián)產(chǎn)含煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADP，確保得到成分合理的輔酶混合溶液。具體實(shí)施方式實(shí)施例1輔酶混合溶液的制備方法，依次包括以下步驟：（1）取含水量為20%的釀酒酵母。本實(shí)施例中，該釀酒酵母采用新鮮啤酒酵母。即，生產(chǎn)出之后，在不超過10min內(nèi)取出的啤酒酵母。對(duì)釀酒酵母進(jìn)行超聲波破碎30min得到破碎酵母。本實(shí)施例中，取100kg破碎酵母進(jìn)行后續(xù)步驟。（2）向破碎酵母中按破碎酵母重量1.5%的重量添加腺苷，之后加熱到35°C形成混合料。即，腺苷的添加量為1.5kg。（3）取硫酸鎂、磷酸氫二鉀、葡萄糖作為輔料，將輔料和混合料添加到水中，且采用磷酸調(diào)節(jié)PH為6.5，加熱到35°C后，得到第一混合液。其中，硫酸鎂、磷酸氫二鉀、葡萄糖的添加量分別為破碎酵母重量的0.15%、1.5%、4%，水的重量為破碎酵母重量的1倍。即，硫酸鎂、磷酸氫二鉀、葡萄糖的添加量分別是0.15kg、1.5kg、4kg，水為100kg。（4）繼續(xù)攪拌第一混合液30min后，向第一混合液中添加色氨酸，攪拌反應(yīng)30min得到第二混合液。其中，色氨酸的添加量按腺苷重量的5%。即，色氨酸的添加量為0.075kg。（5）靜置第二混合液20min，然后向第二混合液中添加純度為20%的NAD激酶繼續(xù)反應(yīng)25min得到第三混合液。其中，NAD激酶的添加量為腺苷重量的0.005%。即，0.000075kg。（6）靜置第三混合液30min，然后用磷酸調(diào)PH為2.5得第四混合液。（7）對(duì)第四混合液進(jìn)行離心，取上清液，上清液經(jīng)過離子交換柱處理后，再依次采用低鹽洗脫、高鹽洗脫，收集全部溶液，接著經(jīng)納濾濃縮15倍，即得輔酶混合溶液1。其中，離子交換柱處理、低鹽洗脫、高鹽洗脫、納濾濃縮均采用常規(guī)方式，不再贅述。實(shí)施例2輔酶混合溶液的制備方法，依次包括以下步驟：（1）取含水量為40%的釀酒酵母。本實(shí)施例中，該釀酒酵母采用普通釀酒酵母。對(duì)釀酒酵母進(jìn)行超聲波破碎60min得到破碎酵母。本實(shí)施例中，取100kg破碎酵母進(jìn)行后續(xù)步驟。（2）向破碎酵母中按破碎酵母重量2%的重量添加腺苷，之后加熱到37°C形成混合料。即，腺苷的添加量為2kg。（3）取硫酸鎂、磷酸氫二鉀、葡萄糖作為輔料，將輔料和混合料添加到水中，且采用磷酸調(diào)節(jié)PH為6.7，加熱到37°C后，得到第一混合液。其中，硫酸鎂、磷酸氫二鉀、葡萄糖的添加量分別為破碎酵母重量的0.2%、2%、5%，水的重量為破碎酵母重量的1.5倍。即，硫酸鎂、磷酸氫二鉀、葡萄糖的添加量分別是0.2kg、2kg、5kg，水為150kg。（4）繼續(xù)攪拌第一混合液50min后，向第一混合液中添加色氨酸，攪拌反應(yīng)50min得到第二混合液。其中，色氨酸的添加量按腺苷重量的10%。即，色氨酸的添加量為0.2kg。（5）靜置第二混合液30min，然后向第二混合液中添加純度為30%的NAD激酶繼續(xù)反應(yīng)30min得到第三混合液。其中，NAD激酶的添加量為腺苷重量的0.01%。即，0.0002kg。（6）靜置第三混合液50min，然后用磷酸調(diào)PH為3得第四混合液。（7）對(duì)第四混合液進(jìn)行離心，取上清液，上清液經(jīng)過離子交換柱處理后，再依次采用低鹽洗脫、高鹽洗脫，收集全部溶液，接著經(jīng)納濾濃縮20倍，即得輔酶混合溶液2。其中，離子交換柱處理、低鹽洗脫、高鹽洗脫、納濾濃縮均采用常規(guī)方式，不再贅述。實(shí)施例3輔酶混合溶液的制備方法，依次包括以下步驟：（1）取含水量為50%的釀酒酵母。本實(shí)施例中，本實(shí)施例中，該釀酒酵母采用新鮮啤酒酵母。即，生產(chǎn)出之后，在不超過10min內(nèi)取出的啤酒酵母。對(duì)釀酒酵母進(jìn)行超聲波破碎120min得到破碎酵母。本實(shí)施例中，取100kg破碎酵母進(jìn)行后續(xù)步驟。（2）向破碎酵母中按破碎酵母重量2.5%的重量添加腺苷，之后加熱到40°C形成混合料。即，腺苷的添加量為2.5kg。（3）取硫酸鎂、磷酸氫二鉀、葡萄糖作為輔料，將輔料和混合料添加到水中，且采用磷酸調(diào)節(jié)PH為7，加熱到40°C后，得到第一混合液。其中，硫酸鎂、磷酸氫二鉀、葡萄糖的添加量分別為破碎酵母重量的0.25%、2.5%、6%，水的重量為破碎酵母重量的2倍。即，硫酸鎂、磷酸氫二鉀、葡萄糖的添加量分別是0.25kg、2.5kg、6kg，水為200kg。（4）繼續(xù)攪拌第一混合液60min后，向第一混合液中添加色氨酸，攪拌反應(yīng)60min得到第二混合液。其中，色氨酸的添加量按腺苷重量的15%。即，色氨酸的添加量為0.375kg。（5）靜置第二混合液40min，然后向第二混合液中添加純度為40%的NAD激酶繼續(xù)反應(yīng)35min得到第三混合液。其中，NAD激酶的添加量為腺苷重量的0.015%。即，0.000375kg。（6）靜置第三混合液60min，然后用磷酸調(diào)PH為3.5得第四混合液。（7）對(duì)第四混合液進(jìn)行離心，取上清液，上清液經(jīng)過離子交換柱處理后，再依次采用低鹽洗脫、高鹽洗脫，收集全部溶液，接著經(jīng)納濾濃縮25倍，即得輔酶混合溶液3。其中，離子交換柱處理、低鹽洗脫、高鹽洗脫、納濾濃縮均采用常規(guī)方式，不再贅述。實(shí)施例4與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于：所用釀酒酵母為普通釀酒酵母。制備出輔酶混合溶液4。實(shí)施例5與實(shí)施例2的區(qū)別僅在于：所用釀酒酵母為新鮮啤酒酵母。即，生產(chǎn)出之后，在不超過10min內(nèi)取出的啤酒酵母。制備出輔酶混合溶液5。實(shí)施例6與實(shí)施例3的區(qū)別僅在于：所用釀酒酵母為普通釀酒酵母。制備出輔酶混合溶液6。效果例采用常規(guī)方式對(duì)輔酶混合溶液的成分進(jìn)行檢測，結(jié)果見下表：輔酶混合溶液1輔酶混合溶液2輔酶混合溶液3輔酶混合溶液4輔酶混合溶液5輔酶混合溶液6ATP（mg/ml）505358555153NAD（mg/ml）2.12.5222.22.1NADP（mg/ml）55.25.25.15.25.1NADH（mg/ml）0.550.610.650.50.610.55NADPH（mg/ml）0.280.300.300.20.240.22AMP（mg/ml）0.120.150.140.10.140.15ADP（mg/ml）0.150.160.180.10.130.11由上表可知，采用本發(fā)明的輔酶混合溶液的制備方法所制備的輔酶混合溶液含ATP不少于50mg/ml、NAD不少于2mg/ml、NADP不少于5mg/ml，且含有少量NADH、NADPH、AMP、ADP，可以作為酶化學(xué)反應(yīng)的輔酶溶液。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的
技術(shù)領(lǐng)域：
，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3