專利名稱：：A型尼曼-皮克病的基因治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及治療影響腦和內(nèi)臟的疾病如A型尼曼-皮克病的組合物和方法。
發(fā)明內(nèi)容一組稱為溶酶體貯積癥(lysosomalstoragediseases,LSD)的代謝性疾病包括超過40種遺傳疾病，其中許多涉及不同溶酶體水解酶的遺傳缺陷。表1列出了有代表性的溶酶體貯積癥和相關(guān)的缺陷酶。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>溶酶體貯積癥缺陷酶沃耳曼氏綜合征*酸性脂肪酶*影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)LSD的標(biāo)志性特征是溶酶體中代謝物的異常積累，其導(dǎo)致在核周體中形成大量膨脹的溶酶體。對(duì)LSD治療的主要困難(相對(duì)于肝特異性酶病的治療而言)在于需要在多個(gè)單獨(dú)的組織中逆轉(zhuǎn)溶酶體貯積病變。有些LSD可通過靜脈輸注缺失的酶有效的治療，稱為酶替代療法(enzymereplacementtherapy,ERT)。例如，僅有內(nèi)臟病的戈謝1型病人對(duì)重組葡萄糖腦苷脂酶(Cerezyme,GenzymeCorp.)的ERT有良好反應(yīng)。然而，患有影響CNS的代謝病的病人(例如2型或3型戈謝病)并不完全對(duì)靜脈內(nèi)ERT有反應(yīng)，因?yàn)樘娲副谎X屏障(BBB)阻止而不能進(jìn)入腦。此外，早期試圖通過直接注射蛋白將替代酶引入腦的行為部分受限，這是由于局部高濃度酶的毒性以及腦實(shí)質(zhì)中擴(kuò)散率有限(Partridge,PeptideDrugDeliverytotheBrain,RavenPress,1991)。另外，可能會(huì)產(chǎn)生抗酶替代療法中使用的輸注的酶的抗體。該抗體可能沒有臨床意義，也可能導(dǎo)致超敏反應(yīng)或降低治療蛋白的生物利用度。Hunley,T.E.etal.(2004)Pediatrics114(4):e532-e535。例如，KakkisE.etal.(2004)PNAS101(3):829-834報(bào)道在粘多糖貯積癥I型(mucopolysaccharidosisI，MPSI)犬模型中已經(jīng)觀察到抗體對(duì)溶酶體貯積癥酶替代療法的不利作用。在MPS疾病包括MPSI、MPSVI和MPSVII的其他動(dòng)物模型中，他們也報(bào)道了相似的結(jié)果。降低這些蛋白引起的免疫應(yīng)答可能是合乎需要的。誘導(dǎo)抗原特異性耐受是降低這樣的免疫應(yīng)答的可能的方法，但是據(jù)報(bào)道難以實(shí)現(xiàn)。基因療法是剛出現(xiàn)的治療影響CNS的疾病，包括LSD的治療方式。在認(rèn)可的動(dòng)物模型中人們己經(jīng)獲得用基因療法治療A型尼曼-皮克病(Neimann-PickTypeA，NPA)的有希望的結(jié)果。Dodgeetal.(2005)PNAS102(49):18722-17827。NPA是由酸性鞘磷脂酶(acidsphingomyelinase,ASM)活性缺陷引起的溶酶體貯積癥。ASM活性的缺失導(dǎo)致溶酶體鞘磷脂(sphingomyelin,SPM)的積累，繼發(fā)的代謝缺陷如異常膽固醇代謝，進(jìn)而導(dǎo)致包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervous7system,CNS)的器官系統(tǒng)的細(xì)胞功能缺失。SchuchmanandDesnick,TheMetabolicandMolecularBasesofInheritedDisease,McGraw-Hill,NewYork,pp.3589-3610和Horinouchietal.(1995)Nat.Genet.10:288-293。本發(fā)明提供包括下述步驟的方法將有效量的含有編碼免疫原轉(zhuǎn)基因的病毒載體給予哺乳動(dòng)物的肝組織，然后將有效量的含有編碼免疫原轉(zhuǎn)基因的第二病毒載體給予哺乳動(dòng)物的腦。本發(fā)明也提供治療哺乳動(dòng)物A型尼曼-皮克病的方法，包括下述步驟將有效量的含有編碼酸性鞘磷脂酶多肽轉(zhuǎn)基因的病毒載體給予哺乳動(dòng)物的肝組織，然后將有效量的含有編碼酸性鞘磷脂酶多肽轉(zhuǎn)基因的第二病毒載體給予所述哺乳動(dòng)物的腦，由此治療哺乳動(dòng)物的A型尼曼-皮克病。本發(fā)明也提供使哺乳動(dòng)物的腦對(duì)預(yù)先選定的免疫原耐受的方法和組合物，其首先通過轉(zhuǎn)基因全身性投遞有效量的該免疫原然后將有效量的該免疫原給予哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明也提供使哺乳動(dòng)物的腦對(duì)酸性鞘磷脂酶多肽耐受的方法和組合物，其通過首先向該哺乳動(dòng)物的肝投遞有效量的編碼該多肽的轉(zhuǎn)基因然后將有效量的編碼該多肽的轉(zhuǎn)基因給予所述哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明也提供改善患有NPA的哺乳動(dòng)物中A型尼曼-皮克病(NPA)相關(guān)癥狀的方法和組合物，其通過使用編碼酸性鞘磷脂酶多肽的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)該哺乳動(dòng)物的肝后再使用有效量的該轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)所述哺乳動(dòng)物的腦組織來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)將部分通過下述說明來(lái)陳述，部分可通過本說明書而理解，或可通過實(shí)施本發(fā)明而得知。圖1:圖示了向小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)給予轉(zhuǎn)基因的不同位點(diǎn)。圖2:圖示了作為健康的量度的受治療小鼠的體重。從6周齡開始測(cè)量(處理從第四周開始)。在6至36周(全身性注射該轉(zhuǎn)基因后2至32周)期間所有組與未處理ASMKO小鼠比較。圖注*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;ns(不顯著)。圖3:圖示了作為運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的量度的加速滾輪測(cè)試(AcceleratingRotarodtest)的結(jié)果。測(cè)量在10周齡開始(處理從第四周開始)。在10至36周(全身性注射該轉(zhuǎn)基因后6至32周)期間所有組與未處理ASMKO小鼠比較。圖注*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;ns(不顯著)。圖4:圖示了作為運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的量度的搖擺滾輪測(cè)試(rockingrotarodtest)的結(jié)果。測(cè)量在10周齡開始(處理從第四周開始)。在10至36周(全身性注射該轉(zhuǎn)基因后6至32周)期間所有組與未處理ASMKO小鼠比較。圖注*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;ns(不顯著)。圖5:圖示了作為認(rèn)知功能恢復(fù)量度的Barnes迷宮測(cè)試(BarnesMazetest)的結(jié)果。測(cè)量在17周齡開始(處理從第四周開始)。在17至33周(全身性注射該轉(zhuǎn)基因后13至29周)期間所有組與未處理ASMKO小鼠比較。圖注*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;ns(不顯著)。圖6:圖示了ASM聯(lián)合基因治療延長(zhǎng)了ASMKO小鼠的壽命。ASMKO小鼠壽命中位數(shù)為34周。接受全身性轉(zhuǎn)基因的小鼠壽命中位數(shù)為45周(p<0.0001)。接受顱內(nèi)轉(zhuǎn)基因的小鼠的壽命中位數(shù)為43周(p〈0.0001)。100%的接受顱內(nèi)和全身性轉(zhuǎn)基因的小鼠壽命為54周。圖7A至圖7D:圖示了處理和未處理小鼠的循環(huán)中的抗hASM抗體水平。圖注*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001。圖7E顯示了隨時(shí)間的血清中人ASM蛋白水平。圖8A至圖8F:圖示了處理和未處理小鼠腦中鞘磷脂水平。圖9A至圖9D:圖示了處理和未處理小鼠各種內(nèi)臟中鞘磷脂水平。具體實(shí)施方式貫穿本公開，許多出版物、專利和公布的專利說明書通過確定的引用以供參考。這些出版物、專利和公布的專利說明書所揭示的內(nèi)容通過引用并入本公開，以更全面的公開本發(fā)明所涉及領(lǐng)域的狀況。定義-除非另有說明，本發(fā)明的實(shí)施將使用免疫學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和重組DNA的常規(guī)技術(shù)，這些均屬于本領(lǐng)域的技術(shù)。參見，例如Sambrook，F(xiàn)ritschandManiatis，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版(1989);CurrentProtocolsInMolecularBiology(F.M.Ausubeletal.eds.，(1987));MethodsInEnzymology系歹U(AcademicPress,Inc.):Per2:APracticalApproach(M.J.MacPherson，B.D.HamesandG.R.Tayloreds.(1995)),HarlowandLaneeds.，(1988)ANTIBODIES,ALABORATORYMANUALAndANIMALCELLCULTURE(R.I.Freshneyed.(1987))。此處所用的一些術(shù)語(yǔ)有如下定義的意義。如說明書和權(quán)利要求中所用，除非上下文明確指明，單數(shù)形式"一個(gè)"、"一種"和"所述的"都包含復(fù)數(shù)范圍。例如，術(shù)語(yǔ)"一種細(xì)胞"包括多種細(xì)胞，包括其混合物。術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"和"寡核苷酸"可互換地使用，是指任何長(zhǎng)度的核苷酸(脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物)的聚合形式。多核苷酸可有任何三維結(jié)構(gòu)和執(zhí)行任何功能，包括已知的或未知的。下述的為多核苷酸的非限定性例子基因或基因片段(例如，探針、引物、EST或SAGE標(biāo)簽)、外顯子、內(nèi)含子、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)移RNA、核糖體RNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、支鏈多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離DNA、任何序列的分離RNA、核酸探針和引物。多核苷酸可包含修飾核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸類似物。對(duì)核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾，如果有的話，可在聚合物組裝之前或之后給予。核苷酸序列可被非核苷酸成分中斷。多核苷酸可在聚合后進(jìn)一步修飾，如通過與標(biāo)記成分接合。該術(shù)語(yǔ)也指雙鏈和單鏈分子。除非另有說明或必要時(shí)，本發(fā)明為多核苷酸的任何實(shí)施方案包括雙鏈形式和己知的或預(yù)測(cè)的構(gòu)成該雙鏈形式的兩條互補(bǔ)單鏈形式的每一條。多核苷酸由四種核苷酸堿基的特定序列組成腺嘌呤(A);胞嘧啶(C);鳥嘌呤(G);胸腺嘧啶(T);和當(dāng)多核苷酸為RNA時(shí)尿嘧啶(u)針對(duì)鳥嘌呤。因此，術(shù)語(yǔ)"多核苷酸序列"是多核苷酸分子的字母代表形式。這種字母代表形式可輸入到具有中央處理器的龜腦的數(shù)據(jù)庫(kù)中以及用于生物信息學(xué)應(yīng)用如功能基因組學(xué)和同源性檢索。"基因"是指包含至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄和翻譯后能夠編碼特定多肽或蛋白質(zhì)的開放讀碼框(ORF)的多核苷酸。任何此處描述的多核苷酸序列可用來(lái)鑒定其相關(guān)基因的更大片段或全長(zhǎng)編碼序列。分離更大片段序列的方法是本領(lǐng)技術(shù)人員已知的。"基因產(chǎn)物"或換句話說"基因表達(dá)產(chǎn)物"是指在基因轉(zhuǎn)錄和翻譯后產(chǎn)生的氨基酸(例如肽或多肽)。術(shù)語(yǔ)"多肽"和術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)"可互換地使用，在其最大意義上是指兩個(gè)或更多個(gè)亞單位氨基酸、氨基酸類似物或擬肽(peptidomimetics)的化合物。亞單位可通過肽鍵連接。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，亞單位可通過其他鍵連接，例如酯鍵、醚鍵等。此處所用術(shù)語(yǔ)"氨基酸"是指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D和L型旋光異構(gòu)體、氨基酸類似物和擬肽。具有三個(gè)或更多個(gè)氨基酸的肽，如果肽鏈短，通常稱為寡肽。如果肽鏈長(zhǎng)，通常稱為多肽或蛋白質(zhì)。"在轉(zhuǎn)錄控制下"是本領(lǐng)域熟知的術(shù)語(yǔ)，是指多核苷酸序列，通常是DNA序列的轉(zhuǎn)錄，依賴于其可操作地連接到對(duì)轉(zhuǎn)錄起始起作用或促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的元件。"可操作地連接"是指元件以允許其發(fā)揮功能的排列方夂在一起(juxtaposition)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"包括"指組合物和方法包括所述成分，但是并不排除其他成分。當(dāng)用于定義組合物和方法時(shí)，術(shù)語(yǔ)"基本由……組成"指排除對(duì)組合具有任何基本重要性的其他組分。因此，如本文所定義的，基本由組分組成的組合物將不排除來(lái)源于分離和純化方法的微量污染物和藥學(xué)上可接受的載體如磷酸鹽緩沖鹽水、防腐劑等。"由……組成"意味著排除超過痕量成分的其它成分和用于給予本發(fā)明的組合物的實(shí)質(zhì)性的方法步驟。使用這些過渡術(shù)語(yǔ)定義的實(shí)施方案也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。術(shù)語(yǔ)"分離的"意思為與細(xì)胞的或其他組分分離，其中多核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體或其一個(gè)或多個(gè)片段(fragment(s))在天然狀態(tài)下通常與之相連。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，分離的多核苷酸從其在天然或原始環(huán)境下通常相連的3'和5'連續(xù)核苷酸中分離，例如在染色體上。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說，顯然非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體或其一個(gè)或多個(gè)片段不需要"分離"以將其從其天然存在的對(duì)應(yīng)物中區(qū)別開來(lái)。此外，"濃縮的"、"隔離的(separated)"或"稀釋的"多核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體或其一個(gè)或多個(gè)片段與其天然存在的對(duì)應(yīng)物區(qū)別在于濃度或每體積的分子數(shù)目大于"濃縮的"或小于"分散的"其天然存在的對(duì)應(yīng)物的濃度或每體積的分子數(shù)目。與天然存在的對(duì)應(yīng)物在一級(jí)序列或例如在糖基化模式上有區(qū)別的多核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體或其一個(gè)或多個(gè)片段不一定以其分離的形式存在，因?yàn)樗鼈兣c天然存在的對(duì)應(yīng)物的區(qū)別在于一級(jí)序列或，可替代的，在于其他特征，如糖基化模式。因此，非天然存在的多核苷酸與分離的天然存在的多核苷酸分開，作為獨(dú)立的(separate)實(shí)施方案提供。細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)與從天然產(chǎn)生蛋白質(zhì)的真核細(xì)胞中分離的天然存在的蛋白質(zhì)分開，作為獨(dú)立的實(shí)施方案提供。此處所用的"基因投遞(genedelivery)"、"基因轉(zhuǎn)移"等是指將外源多核苷酸(有時(shí)稱為"轉(zhuǎn)基因")導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，而不論使用何種導(dǎo)入方法。導(dǎo)入方法包括多種熟知的技術(shù)，如載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(通過，例如病毒感染/轉(zhuǎn)染或許多其他基于蛋白質(zhì)或脂質(zhì)的基因投遞復(fù)合物)以及促進(jìn)投遞"裸"多核苷酸的技術(shù)(如電穿孔、"基因槍"投遞和多種用于導(dǎo)入多核苷酸的其他技術(shù))。導(dǎo)入的多核苷酸可在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地或瞬時(shí)地維持。穩(wěn)定地維持典型地需要該導(dǎo)入的多核苷酸或者包含與宿主細(xì)胞相容的復(fù)制起始或者整合到宿主細(xì)胞的復(fù)制子中，如染色體外復(fù)制子(例如質(zhì)粒)或核或線粒體染色體。本領(lǐng)域已知許多能夠介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的載體。"基因投遞載體(genedeliveryvehicle)"定義為任何能夠攜帶插入的多核苷酸到宿主細(xì)胞中的分子?；蛲哆f載體的例子為脂質(zhì)體，生物相容的聚合物，包括天然聚合物和合成聚合物；脂蛋白；多肽；多糖；脂多糖；人工病毒包膜；重組酵母細(xì)胞，金屬顆粒；和細(xì)菌或病毒，如桿狀病毒、腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒、噬菌體、柯斯質(zhì)粒、質(zhì)粒、真菌載體和其他本領(lǐng)域中使用的典型重組載體，其在多種真核和原核宿主中表達(dá)已被描述，可用于基因治療以及簡(jiǎn)單蛋白表達(dá)。"病毒載體"定義為包括將要投遞到宿主細(xì)胞中的多核苷酸的重組產(chǎn)生的病毒或病毒顆粒，體內(nèi)(invivo)的、離體的(exvivo)或體外(invitro)的。病毒載體的例子包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、甲病毒載體等。甲病毒載體，如基于塞姆利基森林病毒(SemlikiForestvirus)的載體和基于辛德畢斯病毒(Sindbisvirus)的載體，也被開發(fā)用于基因治療和免疫治療。見SchlesingerandDubensky(1999)Curr.Opin.Biotechnol.5:434-439禾口Yingetal.(1999)Nat.Med.5(7):823-827。在通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的方面，載體構(gòu)建體(construct)是指包含逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組或其部分和治療基因的多核苷酸。此處所用的"逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移"或"逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)"具有相同的意思，是指通過病毒進(jìn)入細(xì)胞和將其基因組整合到宿主細(xì)胞基因組從而使基因或核酸序列穩(wěn)定地轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中的過程。病毒可通過其正常的感染機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞或通過修飾從而結(jié)合到不同宿主細(xì)胞表面受體或配體以進(jìn)入細(xì)胞。此處所用的"逆轉(zhuǎn)錄病毒載體"是指能夠通過病毒或類似病毒進(jìn)入機(jī)制將外源核酸導(dǎo)入細(xì)胞的病毒顆粒。在通過DNA病毒載體，如腺病毒(Ad)或腺伴隨病毒(AAV)介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的方面，載體構(gòu)建體是指包含病毒基因組或其部分和轉(zhuǎn)基因的多核苷酸。腺病毒(adenoviruses,Ads)是一組有相對(duì)詳細(xì)描述的同源病毒，包括50種以上的血清型。參見例如WO95/27071。腺病毒易于生長(zhǎng)并且不需要整合到宿主基因組中。也構(gòu)建了重組腺病毒來(lái)源的載體，特別是那些降低了重組可能性和產(chǎn)生野生型病毒的載體。參見例如WO95/00655和WO95/11984。野生型AAV具有整合到宿主細(xì)胞基因組中的高侵染性和特異性。參見HermonatandMuzyczka(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6466-6470和Lebkowskietal.(1988)Mol.Cell.Biol.8:3988-3996。重組AAV載體也是本領(lǐng)域已知的。參見例如WO01/36620A2。包含啟動(dòng)子和可將多核苷酸可操作的連接進(jìn)去的克隆位點(diǎn)的載體是本領(lǐng)域熟知的。這樣的載體能夠體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄RNA并可通過商業(yè)途徑獲得，其來(lái)源如Stratagene(LaJolla，CA)禾卩PromegaBiotech(Madison,WI)。為使表達(dá)和/或體外轉(zhuǎn)錄最佳，可能需要去除、添加或改變克隆的5'和/或3'非翻譯部分以排除額外的、潛在的不合適的替代翻譯起始密碼子或其他可干擾或降低表達(dá)的序列，無(wú)論是在轉(zhuǎn)錄水平還是在翻譯水平?？商娲?，可在起始密碼子5'后緊接著插入一致性的核糖體結(jié)合位點(diǎn)以提高表達(dá)。基因投遞載體也包括一些非病毒載體，包括DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物、重組酵母細(xì)胞和靶向病毒蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體。也包括定向抗體或其片段的脂質(zhì)體可用于本發(fā)明的方法中。為提高向細(xì)胞的投遞，本發(fā)明的核酸分子或蛋白質(zhì)可結(jié)合(conjugate)到結(jié)合例如TCR、CD3或CD4的細(xì)胞表面抗原的抗體或其一個(gè)或多個(gè)結(jié)合片段(bindingfragment(s))。術(shù)語(yǔ)"基因組顆粒(gp)"或"基因組當(dāng)量(genome叫uivalents)"在與病毒滴度有關(guān)的地方使用時(shí)，是指含有重組AAVDNA基因組的病毒體(virion)數(shù)，而不論其侵染性或功能性。特定載體制劑中的基因組顆粒數(shù)可通過如此處實(shí)施例中，或例如Clarketal.(1999)Hum.GeneTher.10:1031-1039中和Veldwijketal.(2002)Mol.Ther.6:272-278中描述的方法進(jìn)行測(cè)定。術(shù)語(yǔ)"感染單位(iu)"、"感染顆粒"或"復(fù)制單位"在與病毒滴度有關(guān)的地方使用時(shí)，是指通過感染中心測(cè)定，也稱為復(fù)制中心測(cè)定所測(cè)量的感染性載體顆粒數(shù)，該測(cè)定如例如在McLaughlinetal.(1988)J.Virol.62:1963-1973中描述的。術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(tu)"在與病毒滴度有關(guān)的地方使用時(shí)，是指導(dǎo)致功能轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物產(chǎn)生的如通過功能測(cè)定所測(cè)量的感染性載體顆粒數(shù)，i亥測(cè)定如在Xiaoetal.(1997)Exp.Ne腦biol.144:113-124或在Fisheretal.(1996)J.Virol.70:520-532(LFU測(cè)定)中描述的。術(shù)語(yǔ)"治療"、"治療有效劑量"及其相關(guān)詞是指導(dǎo)致預(yù)防或延遲受試者發(fā)病或改善受試者癥狀或獲得期望的生物學(xué)效果的化合物的量，該生物學(xué)效果如神經(jīng)病理學(xué)糾正，例如，與溶酶體貯積癥相關(guān)的細(xì)胞病理學(xué)，如此處或Walkley(1998)BrainPathol8:175-193中所描述的。術(shù)語(yǔ)"治療糾正"指產(chǎn)生預(yù)防或延緩發(fā)病或者減輕患者癥狀的糾正程度。有效量可通過本領(lǐng)域熟知的方法和如下述部分中描述的進(jìn)行確定。'-.'"組合物"意為活性試劑和另一種惰性的(例如可檢測(cè)的試劑或標(biāo)記)或活性的如佐劑的化合物或組合物的組合。"藥物組合物"意為包括活性試劑和惰性的或活性的載體的組合，以使得該組合物適于體外、體內(nèi)或離體的診斷或治療用途。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的載體"包括任何標(biāo)準(zhǔn)的藥物載體，例如磷酸鹽緩沖鹽水、水和乳劑，如油/水或水/油乳劑，以及各種類型的濕潤(rùn)劑。組合物也可包括穩(wěn)定劑和防腐劑。對(duì)于載體、穩(wěn)定劑和佐劑的實(shí)例；參見Martin,Remington'sPharm.Sci.,15thEd.(MackPubl.Co.,Easton(1975))。"有效量"為足以達(dá)到有益或所需結(jié)果如預(yù)防或治療的量。有效量可通過一次或更多次給藥、應(yīng)用或劑量來(lái)給予。"受試者"、"個(gè)體"或者"患者"在本文可互換使用，是指脊椎動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人。哺乳動(dòng)物包括但不限于鼠、猿、人、農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物、競(jìng)技動(dòng)物和寵物。"對(duì)照"為在實(shí)驗(yàn)中為對(duì)比的目的使用的另外的受試者或樣品。對(duì)照可為"陽(yáng)性"或"陰性"。例如，當(dāng)實(shí)驗(yàn)的目的為確定基因改變的表達(dá)水平與疾病相關(guān)時(shí)，一般優(yōu)選使用陽(yáng)性對(duì)照(具有上述改變并且表現(xiàn)出該疾病特征性癥狀的受試者或從該受試者中獲得的樣品)和陰性對(duì)照(缺少改變的表達(dá)和該疾病臨床癥狀的受試者或從該受試者中獲得的樣品)。通過病毒載體的基因治療給予蛋白能夠感染有絲分裂后神經(jīng)元。病毒載體用于向CNS投遞基因的綜述見Davidsonetal.(2003)NatureRev.4:353-364。腺伴隨病毒(AAV)在CNS基因治療中有用，因?yàn)樗鼈兓緹o(wú)毒、無(wú)免疫原性、具有親祌經(jīng)性和能在CNS中維持表達(dá)(Kaplittetal.(1994)Nat.Genet.8:148-154;Bartlettetal.(1998)Hum.GeneTher.9:1181-1186;禾卩Passinietal.(2002)J.Neurosci"22:6437-6446)。如此處所證明的，轉(zhuǎn)基因在動(dòng)物腦中表達(dá)導(dǎo)致對(duì)該轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的免疫應(yīng)答。見圖7A。申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)向已經(jīng)對(duì)轉(zhuǎn)基因耐受的哺乳動(dòng)物CNS給予該轉(zhuǎn)基因增強(qiáng)了療效。因此，一方面本發(fā)明提供使哺乳動(dòng)物的腦對(duì)預(yù)先選定的免疫原耐受的方法，該方法通過在向該哺乳動(dòng)物的CNS給予所述的預(yù)先選定的免疫原之前將有效量的該預(yù)先選定的免疫原全身性給予該哺乳動(dòng)物。如本文使用，術(shù)語(yǔ)"使……耐受"意為降低對(duì)免疫原的免疫應(yīng)答。術(shù)語(yǔ)"免疫原"應(yīng)包括任何初次引起免疫應(yīng)答(T細(xì)胞或B細(xì)胞介導(dǎo)的)的試劑。如Ziegler等人(2004)所證實(shí)的，在給予編碼肝特異性增強(qiáng)子/啟動(dòng)子控制下的轉(zhuǎn)基因的重組AAV載體之后，在肝中該轉(zhuǎn)基因的表達(dá)導(dǎo)致對(duì)該表達(dá)的轉(zhuǎn)基因的抗體應(yīng)答降低。本方法適用于任何哺乳動(dòng)物，因此，所述的"哺乳動(dòng)物"包括但不限于鼠、猿、人、農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物、競(jìng)技動(dòng)物和寵物。在一個(gè)特別的方面，所述的哺乳動(dòng)物為認(rèn)可的A型和B型尼曼-皮克病動(dòng)物模型的ASKMO小鼠。Hori腿chietal.(1995)Nat.Genetics10:288-293;Jinetal.(2002)J.Clin.Invest.109:1183-1191;和Otterbach(1995)Cell81:1053-1061。A型尼曼-皮克病(NPA)歸類于溶酶體貯積癥，為遺傳性的神經(jīng)代謝異常，特征是遺傳性的酸性鞘磷脂酶缺陷(ASM,鞘磷脂膽堿磷酸水解酶，EC3丄3.12)。功能性ASM蛋白的缺乏導(dǎo)致整個(gè)腦部神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)的溶酶體內(nèi)鞘磷脂底物的積累。這導(dǎo)致核周體內(nèi)大量膨脹溶酶體的形成，是A型NPD的標(biāo)志性特征和主要的細(xì)胞表型。膨脹溶酶體的存在與正常的細(xì)胞功能的丟失和進(jìn)行性的神經(jīng)變性過程相關(guān)，其導(dǎo)致受影響的個(gè)體在幼童時(shí)期死亡(TheMetabolicandMolecularBasesofInheritedDiseases,eds.Scriveretal"McGraw-Hill,NewYork,2001，pp.3589-3610)。次級(jí)細(xì)胞表型(例如其他代謝異常)也與此疾病相關(guān)，特別是溶酶體分隔中膽固醇的高水平積累。鞘磷脂對(duì)膽固醇有強(qiáng)的親和性，其導(dǎo)致ASMKO小鼠和人類患者溶酶體中大量的膽固醇的分離。Leventhaletal.(2001)J.Biol.Chem.，276:44976-44983;Slotte(1997)Subcell.Biochem.28:277-293;和Vianaetal.(1990)J.Med.Genet.27:499-504。在一個(gè)具體的方面，全身性給藥的位點(diǎn)為哺乳動(dòng)物的肝?？墒褂萌魏谓o藥方法，其例子在下面提供。全身性給予轉(zhuǎn)基因后，轉(zhuǎn)基因被給予到哺乳動(dòng)物的CNS，特別是顱內(nèi)直接給予到哺乳動(dòng)物的腦，更特別的給予位點(diǎn)選自腦干、海馬、紋狀體、延髓、腦橋、中腦泡(mesencephalon).小腦、中腦、丘腦、下丘腦、大腦皮質(zhì)、枕葉、顳葉、頂葉或額葉。在一個(gè)實(shí)施方案中，特異的給予至小腦的小腦深部核團(tuán)。如上所述，給予編碼多肽或蛋白的轉(zhuǎn)基因到哺乳動(dòng)物，以最終使用任何適當(dāng)?shù)幕蜣D(zhuǎn)移方法投遞該多肽或蛋白，其例子如上所述，以及如美國(guó)專利6,066,626所述。在一個(gè)方面，該轉(zhuǎn)基因編碼ASM。人ASM的基因組和功能cDNA序列已經(jīng)公布，例如在美國(guó)專利5,773,278和6,541,218中)。在表1中鑒定了其他涉及CNS的適當(dāng)?shù)牡鞍酌庖咴?。病毒載體是有用的基因轉(zhuǎn)移載體。在一個(gè)特別實(shí)施方案中，病毒載體選自腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、牛痘、皰疹病毒、桿狀病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒。適當(dāng)?shù)腁AV載體在美國(guó)專利6,066,626和PCT公布WO01/36620A2全文中公開。修飾的載體，如第9欄，第14到66行中描述的，也可以使用。適當(dāng)?shù)难逍桶ǖ幌抻贏AV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8。AAV載體可為重組或雜交AAV載體，例如一種選自AAV2/1、AAV2/5、AAV2/7、AAV2/8、AAV1/2、AAV1/3、AAV1/5、AAVl/7或AAV1/8的，血清型載體，其中該命名是指ITR來(lái)源的血清型/衣殼來(lái)源的血清型。例如，AAV2/5載體包括AAV2血清型ITR和AAV5血清型衣殼。通過給予包含產(chǎn)生多肽的轉(zhuǎn)基因的病毒載體，向哺乳動(dòng)物投遞有效量的該多肽。在一個(gè)方面，包含轉(zhuǎn)基因的病毒載體投遞到肝，在投遞到肝之后，立即將包含所述轉(zhuǎn)基因的病毒載體投遞到CNS。在一個(gè)替代實(shí)施方案中，給予CNS的后一病毒載體在該多肽己經(jīng)在哺乳動(dòng)物中表達(dá)了有效時(shí)間從而使該哺乳動(dòng)物對(duì)所述的多肽產(chǎn)生耐受之后進(jìn)行。這可隨所治療的病人、所投遞的多肽和所期望的療效而變化。適當(dāng)?shù)臅r(shí)間進(jìn)程以及在后向CNS給予的次數(shù)由主治醫(yī)生決定。為確定哺乳動(dòng)物是否對(duì)多肽耐受，可用所述的多肽攻毒(challenge)該哺乳動(dòng)物來(lái)確定上述攻毒是否產(chǎn)生抗該多肽的免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答可通過在攻毒后測(cè)定抗該多肽的抗體滴度來(lái)確定。當(dāng)與適當(dāng)?shù)膶?duì)照相比時(shí)，攻毒后降低的或不顯著的抗體滴度可能表明耐受狀態(tài)。在哺乳動(dòng)物中測(cè)定和產(chǎn)生抗體應(yīng)答，用抗原或免疫原攻毒哺乳動(dòng)物以及確定抗體滴度的方法是本領(lǐng)域熟知的。該哺乳動(dòng)物產(chǎn)生耐受的適當(dāng)時(shí)間也可通過確定在受試者中產(chǎn)生所述耐受的有效表—達(dá)時(shí)間來(lái)選擇。'然后所選定的時(shí)間可應(yīng)用于本方法，而不必分別測(cè)試每個(gè)患者。17在一個(gè)實(shí)施方案中，后一病毒載體向CNS的給予在投遞到肝的病毒載體編碼的多肽的表達(dá)檢測(cè)到之后進(jìn)行。多肽表達(dá)的檢測(cè)可通過任何本領(lǐng)域已知的方法完成，該方法的例子包括但不限于分子的(通過檢測(cè)mRNA)或免疫的(通過檢測(cè)蛋白表達(dá))或生物化學(xué)的(通過檢測(cè)多肽活性，如酶活性，如果存在這樣的活性的話)。替代地，后一次給予可在第一次給予的數(shù)小時(shí)或數(shù)天或數(shù)星期之后。多次CNS給予到多CNS位點(diǎn)的用途也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因而，在本發(fā)明的一個(gè)具體方面，提供使哺乳動(dòng)物腦對(duì)酸性鞘磷脂酶多肽耐受的方法。該方法在向哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織(CNS)給予有效量的編碼多肽的轉(zhuǎn)基因之前向該哺乳動(dòng)物的肝給予有效量的編碼該多肽的轉(zhuǎn)基因。在本發(fā)明的另一個(gè)特別方面，提供改善患有NPA的哺乳動(dòng)物的A型尼曼-皮克病(NPA)相關(guān)癥狀的方法。該方法需要向該哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)給予有效量的編碼酸性鞘磷脂酶多肽的轉(zhuǎn)基因，其中所述的給予在向該哺乳動(dòng)物的肝組織全身性給予有效量的該轉(zhuǎn)基因之后，從而在所述的CNS給予之前，哺乳動(dòng)物產(chǎn)生對(duì)該多肽抗原特異性免疫應(yīng)答的能力被消除或顯著降低了。在另一方面，本發(fā)明提供改善患有NPA的哺乳動(dòng)物的A型尼曼-皮克病(NPA)相關(guān)癥狀的方法。所述的癥狀包括但不限于體重減輕或惡病質(zhì)、運(yùn)動(dòng)功能喪失、認(rèn)知功能喪失和過早死亡。該方法需要向哺乳動(dòng)物的肝組織給予有效量的包含編碼酸性鞘磷酯酶多肽轉(zhuǎn)基因的病毒載體，然后向哺乳動(dòng)物的CNS給予有效量的包含該轉(zhuǎn)基因的病毒載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，投遞所述病毒載體的CNS區(qū)域?yàn)槟X。仍是在另一方面中，本發(fā)明提供治療患有NPA的哺乳動(dòng)物的A型尼曼-皮克病(NPA)的方法，該方法通過向哺乳動(dòng)物的肝組織給予有效量的包含編碼酸性鞘磷脂酶多肽的轉(zhuǎn)基因的AAV病毒載體，然后向該哺乳動(dòng)物的CNS投遞有效量的包含編碼酸性鞘磷脂酶多肽的轉(zhuǎn)基因的AAV載體，由此治療該哺乳動(dòng)物的NPA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，投遞所述病毒載體的CNS區(qū)域?yàn)槟X。此處所用的術(shù)語(yǔ)'"治療(treating)"、"治療(treatment)"等意思為獲得所需的治療的、藥理學(xué)的和/或生理的效果。所述的效果從完全或部分預(yù)防疾病或其病征或癥狀來(lái)說，可以是預(yù)防的效果，和/或從部分或完全治療病癥和/或由該病癥導(dǎo)致的有害作用來(lái)說，可以是治療的效果。"治療"也覆蓋對(duì)任何哺乳動(dòng)物病癥的處理，包括預(yù)防傾向于患病癥但尚未診斷確定患有該病癥的受試者病癥的發(fā)生，例如，對(duì)疾病的遺傳標(biāo)簽檢測(cè)呈陽(yáng)性的患者；抑制病癥，即阻止其進(jìn)展；或減輕或改善病癥，例如引起病癥的消退，該病癥例如NPA病。此處所用的"治療"進(jìn)一步包括全身性改善與病變相關(guān)的癥狀和/或延緩癥狀的發(fā)病(onset)。"治療"的臨床和亞臨床證據(jù)隨病變、個(gè)體和治療而變化。在一些實(shí)施方案中，本方法包括給予攜帶有預(yù)先選定的免疫原或轉(zhuǎn)基因的AAV載體，從而轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物在選定的位點(diǎn)以治療水平表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，組合物的病毒滴度至少(a)1.5、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25、3.5、4.0、4.55、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(每次注射x1011基因組拷貝(gc);(b)1.5、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25、3.5、4.0、4.5、5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25或50(xl09tu/ml);或(c)1.5、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25、3.5、4.0、4.5、5、6、7、8、8.4、9、9.3、10、15、20、25、或50(xlO"感染單位[iu]/ml).顱內(nèi)給藥可在腦的任何區(qū)，在給予多于一個(gè)顱內(nèi)投遞時(shí)可包括多個(gè)區(qū)。這樣的位點(diǎn)包括，例如腦干(延髓和腦橋)、中腦泡、中腦、小腦(包括小腦深部核團(tuán))、間腦(丘腦、下丘腦)、端腦(紋狀體、中腦、大腦皮質(zhì)，或皮質(zhì)內(nèi)枕、顳、頂或額葉)。顱內(nèi)注射位點(diǎn)的具體例子示于圖1。對(duì)于人腦結(jié)構(gòu)的鑒定，參見例如TheHumanBrain:Surface,Three-DimensionalSectionalAnatomyWithMRI,andBloodSupply,2nded.,eds.Deuteronetal"SpringerVela,1999;AtlasoftheHumanBrain，eds.Maietal"AcademicPress;1997;禾口Co-PlanarSterotaxicAtlasoftheHumanBrain:3-DimensionalProportionalSystem:AnApproachtoCerebralImaging,eds.Tamaracketal.,ThymeMedicalPub.,1988。對(duì)于鼠月畝結(jié)構(gòu)的鑒定，參見例如TheMouseBraininSterotaxicCoordinates,2nd19ed.,AcademicPress,2000。假如需要，能將人類大腦結(jié)構(gòu)和其他哺乳動(dòng)物的大腦的相似結(jié)構(gòu)聯(lián)系起來(lái)。例如，大多數(shù)哺乳動(dòng)物，包括人類和嚙齒類，顯示了相似的內(nèi)嗅區(qū)-海馬體投射的組織結(jié)構(gòu)(topographicalorganization)，具有投射至海馬體背側(cè)或者中隔的內(nèi)嗅皮層外側(cè)和內(nèi)側(cè)中的神經(jīng)元，而至海馬體腹側(cè)的投射神經(jīng)元主要從內(nèi)嗅皮層內(nèi)側(cè)部中的神經(jīng)元起源(PrinciplesofNeuralScience,4thed.,edsKandeletal"McGraw-Hill,1991;TheRatNervousSystem,2nded.，ed.Paxinos,AcademicPress,1995)。此外，內(nèi)嗅皮層中的第二層細(xì)胞投射至齒狀回，終止于齒狀回分子層外三分之二處。來(lái)源于第三層細(xì)胞的軸突兩側(cè)投射至海馬體的CA1和CA3海馬角區(qū)域，終止于多孔層(stratumlacunose)分子層。為將載體特異性投遞到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的特定區(qū)，特別是腦的特定區(qū)，可通過立體定4立微注身寸給藥(sterotaxicmicroinjection)。例如，手術(shù)當(dāng)天，安裝好患者的立體定位架(旋擰入頭蓋骨)。使用高分辨率的核磁共振對(duì)帶有立體定位架(MRI相匹配的可信標(biāo)簽)的腦部成像。核磁共振圖像傳送到運(yùn)行立體定位軟件的電腦。使用一系列冠狀、矢狀和軸向圖像確定載體注射的靶位和軌跡。這個(gè)軟件能直接將軌跡轉(zhuǎn)換成與立體定位架相匹配的三維形式。在進(jìn)入部位上方鉆孔(burrhole),立體定位儀用植入在設(shè)定深度的針定位。然后，注入在藥學(xué)可接受的載體中的載體。然后，AAV載體就通過直接注射到主要靶位點(diǎn)給予并通過軸突逆行運(yùn)輸?shù)侥┥野形稽c(diǎn)。也可能使用額外的給藥途徑，例如可直接目視下的皮質(zhì)表層給藥方式，或其他非立體定位應(yīng)用。將要給予的物質(zhì)的總量，和將要給予的載體顆粒數(shù)由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)基因治療的已知方面確定。治療的有效性和安全性可在適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型中測(cè)試。例如，各種現(xiàn)有的被詳細(xì)描述的LSD動(dòng)物模型，例如如此處所描述的或在Watsonetal.(2001)MethodsMol.Med.，76:383-403;或Jeyakumaretal.(2002)Neuropath.Appl.Neurobiol.，28:343-357;或MetabolicandMolecularBasesofInheritedDisease,8thedition(2001),McGraw-Hill出版的中描述的。在實(shí)驗(yàn)小鼠中，所注射的AAV溶液的總體積為，例如每個(gè)注射位點(diǎn)1至5u1之間或約3u1，或替代地在10至400u1之間，或替代地在100至400u1之間，或替代地在150至250u1之間，或替代地約200ul。對(duì)于其他哺乳動(dòng)物，包括人腦，體積和投遞速率是適當(dāng)成比例的。例如，已證明150ul的體積可安全地注入靈長(zhǎng)類動(dòng)物的腦(Jansonetal.(2002)Hum.GeneTher.,13:1391-1412)。治療可以由每個(gè)耙位點(diǎn)單次注射組成，也可以沿注射道重復(fù)進(jìn)行，如果需要的話?？梢允褂枚鄠€(gè)注射靶位。例如，在一些實(shí)施方案中，除了第一個(gè)給藥靶位之外，包含攜帶轉(zhuǎn)基因的AAV的組合物可給藥到第一個(gè)靶位對(duì)側(cè)或者同側(cè)的另一個(gè)靶位。在本發(fā)明的方法中，任何血清型的AAV都可使用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用能夠進(jìn)行逆行軸突運(yùn)輸?shù)腁AV載體。病毒載體的血清Si可選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8(參見例如Gaoetal.(2002)PNAS,99:11854-11859;和ViralVectorsforGeneTherapy:MethodsandProtocols,ed.Machida,HumanaPress,2003)。除了列于此處的之外，其他血清型也可使用。也可使用偽型AAV載體(PseudotypedAAVvectors),其為那些在第二個(gè)AAV血清型的衣殼中包含一種AAV血清型的ITR的；例如，含有AAV2衣殼和AAV1基因組的AAV病毒載體或含有AAV5衣殼和AAV2基因組的AAV載體。(Auricchioetal.(2001)Hum.Mol.Genet,10(26):3075-81。)AAV載體來(lái)源于對(duì)哺乳動(dòng)物非致病的單鏈(ss)DNA細(xì)小病毒(DNAparvoviruse)(綜述見Muzyscka(1992)Curr.Top.Microb.Immunol.,158:97-129)。簡(jiǎn)言之，基于AAV的載體將占病毒基因組96%的rep和cap病毒基因去除，留下兩個(gè)145堿基對(duì)(bp)的側(cè)翼末端反向重復(fù)(invertedterminalrepeat,ITR)，其用于起始病毒DNA復(fù)制、包裝和整合。在無(wú)輔助病毒時(shí)，野生型AAV整合入在染色體19q13.3具有優(yōu)選位點(diǎn)特異性的人宿主細(xì)胞基因組中，或可以以附加體的形式保持表達(dá)。單個(gè)AAV顆?？裳b入達(dá)到5kb的ssDNA，因而留下約4.5kb給轉(zhuǎn)基因和調(diào)節(jié)元件，這一般是足夠的。然而，例如美國(guó)專利6,544,785號(hào)中所描述的反式剪接系統(tǒng)(trans-splicingsystem)可幾乎使這一界限加倍。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，AAV為AAV2或AAV8。許多血清型的腺伴隨病毒，如AAV2，作為基因治療的載體已被廣泛研究和描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉基于AAV的功能性基因治療載體的制備。在廣泛的已發(fā)表的文獻(xiàn)中，可找到為數(shù)眾多的有關(guān)給予人受試者的AAV生產(chǎn)、純化和制備的不同方法的參考文獻(xiàn)(參見，例如ViralVectorsforGeneTherapy:MethodsandProtocols,ed.Machida,HumanaPress,2003)。另外，美國(guó)專利6,180,613和6,503,888已經(jīng)描述了以CNS細(xì)胞為靶標(biāo)的基于AAV的基因治療。真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平可被該轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒內(nèi)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和/或一個(gè)或多個(gè)增強(qiáng)子調(diào)節(jié)。組織特異性啟動(dòng)子，如肝特異性啟動(dòng)子，可用于一些實(shí)施方案中。組織特異性增強(qiáng)子，如肝特異性增強(qiáng)子，可用于一些實(shí)施方案中。組織特異性啟動(dòng)子和組織特異性增強(qiáng)子，如肝特異性啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，可聯(lián)合用于本發(fā)明的實(shí)施。啟動(dòng)子的非限制性例子包括但不限于巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子(Kaplittetal.(1994)Nat.Genet.8:148-154)、CMV/人卩3珠蛋白啟動(dòng)子(Mandeletal.(1998)J.Neurosci.18:4271-4284)、GFAP啟動(dòng)子(Xuetal.(2001)GeneTher,8:1323-1332)、1.8-kb神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)啟動(dòng)子(Kleinetal.(1998)Exp.Neurol.150:183-194)、雞卩肌動(dòng)蛋白(CBA)啟動(dòng)子(Miyazaki(1989)Gene79:269-277)和卩-葡糖醛酸酶(GUSB)啟動(dòng)子(Shipleyetal.(1991)Genetics10:1009-1018)，人血清白蛋白啟動(dòng)子，a-l-抗胰蛋白酶啟動(dòng)子。為改善表達(dá)，其他調(diào)節(jié)元件可額外地可操作地連接到該轉(zhuǎn)基因，例如旱獺肝炎病毒調(diào)控后元件(theWoodchuckHepatitisVirusPost-RegulatoryElement,WPRE)(Donelloetal.(1998)J.Virol.72:5085-5092)或牛生長(zhǎng)激素(BGH)多腺苷酸化位點(diǎn)。適合本發(fā)明的其他啟動(dòng)子可以是任何能夠促進(jìn)相關(guān)的編碼DNA序列在肝中表達(dá)的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子。所述的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子包括人和鼠巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、截短的CMV啟動(dòng)子、人血清白蛋白啟動(dòng)子[HSA]和(x-l-抗胰蛋白酶啟動(dòng)子。對(duì)本發(fā)明有用的肝特異性增強(qiáng)子元件可以是任何能夠增強(qiáng)相關(guān)的編碼DNA序列在肝中組織特異性表達(dá)的肝特異性增強(qiáng)子。所述的肝特異性增強(qiáng)子包括一個(gè)或更多人血清白蛋白增強(qiáng)子(HSA)、人凝血酶原增強(qiáng)子(HPrT)、a-l微球蛋白增強(qiáng)子(A1MB)和內(nèi)含子醛縮酶增強(qiáng)子。為獲得更高表達(dá)可聯(lián)合多個(gè)增強(qiáng)子元件。例如，兩個(gè)相同的增強(qiáng)子可與肝特異性啟動(dòng)子聯(lián)用。包含下述啟動(dòng)子/增強(qiáng)子聯(lián)合的病毒載體可用于本發(fā)明的實(shí)施一個(gè)或更多個(gè)HSA增強(qiáng)子聯(lián)合CMV啟動(dòng)子或HSA啟動(dòng)子；一個(gè)或更多個(gè)選自人凝血酶原(HprT)增強(qiáng)子或(x-l微球蛋白A1MB增強(qiáng)子的增強(qiáng)子)聯(lián)合CMV啟動(dòng)子；以及一個(gè)或更多個(gè)選自HprT增強(qiáng)子或A1MB增強(qiáng)子的增強(qiáng)子元件聯(lián)合a-l-抗胰蛋白酶啟動(dòng)子。己出版的PCT申請(qǐng)WO01/36620公開了關(guān)于肝特異性構(gòu)建體的其他信息。可替代地，神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子對(duì)于在CNS中定向投遞和表達(dá)轉(zhuǎn)基因有用。在一些方面，控制轉(zhuǎn)錄活性是合乎需要的。為此，可通過包含不同的調(diào)節(jié)元件和藥物應(yīng)答啟動(dòng)子獲得使用AAV載體的基因表達(dá)的藥學(xué)調(diào)節(jié)，如例如在Habermaetal.(1998)GeneTher.,5:1604-16011;和Yeetal.(1995)Science283:88-91中描述的。AAV制劑可通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)生產(chǎn)，如例如在美國(guó)專利5,658,776禾口ViralVectorsforGeneTherapy:MethodsandProtocols,ed.Machida，HumanaPress,2003中描述的。在某些方面，檢測(cè)和/或該轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平可能是合乎需要的。檢測(cè)基因表達(dá)的方法是本領(lǐng)域已知的，可通過如下討論簡(jiǎn)單的使用，或由本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行修改。已知很多定量所需基因表達(dá)的方法，包括但不限于雜交檢測(cè)(Northern印跡分析)和基于PCR的雜交檢測(cè)。在檢測(cè)mRNA水平的改變中，首先根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法從含有該核酸的樣品中提取該核酸。例如，mRNA可使用根據(jù)上述Sambrook等人(1989)的不同裂解酶或化學(xué)溶液分離或通過核酸結(jié)合樹脂根據(jù)制造商提供的相應(yīng)說明書提取。含有至少IO個(gè)核苷酸并表現(xiàn)出與表達(dá)產(chǎn)物序列互補(bǔ)或同源性的核酸分子可用作雜交探針或PCR引物。本領(lǐng)域已知特異性雜交不需要"完全匹配"的探針。通過少量數(shù)目堿基的替換、刪除或插入對(duì)探針序列的小的改變不影響雜交特異性。一般來(lái)說，可耐受達(dá)到20%的堿基對(duì)錯(cuò)配(在最優(yōu)比對(duì)時(shí))。例如，用于檢測(cè)mRNA的探針與包含在以前鑒定的序列，例如ASM序列中的可比大小的同源區(qū)至少約80%相同?？商娲?，該探針與同源區(qū)比對(duì)后的相應(yīng)基因序列至少85%或甚至至少90%相同。片段的總大小和所延伸的互補(bǔ)區(qū)大小取決于該特定核酸區(qū)段的期望用途或應(yīng)用?；虻妮^小片段一般用于雜交實(shí)施例中，其中互補(bǔ)區(qū)的長(zhǎng)度可變，如在約IO和約IOO核苷酸之間，或甚至達(dá)到根據(jù)所想檢測(cè)的互補(bǔ)序列的全長(zhǎng)。與大于約10個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的延伸片段(stretch)有互補(bǔ)序列的核酸探針將增加雜交體的穩(wěn)定性和選擇性，從而改善所獲得的特定雜交分子的特異性?？稍O(shè)計(jì)具有多于約25，甚至優(yōu)選地多于約50個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，或如果需要甚至更長(zhǎng)的基因互補(bǔ)片段的核酸分子?？赏ㄟ^如化學(xué)手段直接合成該片段，通過使用核酸復(fù)制技術(shù)如美國(guó)專利4,603,102描述的有兩個(gè)引發(fā)寡核苷酸的PCRTM技術(shù)，或通過將選定的序列引入用于重組生產(chǎn)的重組載體的方法容易地制備所述的片段。在一些實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的核酸序列聯(lián)合適當(dāng)?shù)姆椒ㄈ鐦?biāo)簽來(lái)檢測(cè)雜交和互補(bǔ)序列是有利的。本領(lǐng)域已知多種適當(dāng)?shù)闹甘痉椒?，包括熒光的、放射性的、酶的或其他的配體，如抗生物素蛋白/生物素，其能夠給出可檢測(cè)的信號(hào)。也可使用熒光標(biāo)簽或酶標(biāo)簽，如脲酶、堿性磷酸酶或過氧化物酶，而不是放射性或其他不利于環(huán)境的試劑。在使用酶標(biāo)簽的情況下，能用于提供人眼可見的或分光光度法的方式來(lái)鑒定同含有互補(bǔ)核酸的樣品特異性雜交的比色指示劑底物是已知的。雜交反應(yīng)可在不同"嚴(yán)謹(jǐn)性"的條件下進(jìn)行。相關(guān)的條件包括溫度、離子強(qiáng)度、保溫時(shí)間、反應(yīng)混合物中其他溶質(zhì)如甲酰胺的存在和洗滌過程。較高的嚴(yán)謹(jǐn)條件是指如較高溫度和較低鈉鹽濃度的條件，其需要雜交元件間較高的最低互補(bǔ)性以形成穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。增加雜交反應(yīng)嚴(yán)謹(jǐn)性的條件是本領(lǐng)域熟知的并且出版的。見上述Sambrook,等人(1989)。也可使用定量PCR或高通量分析如基因表達(dá)系列分析(SAGE)來(lái)檢測(cè)和定量mRNA水平或其表達(dá)，如在Velculescu,V.etal.(1995)Science270:484-487中描述的。簡(jiǎn)而言之，該方法包括從懷疑含有該轉(zhuǎn)錄本的細(xì)胞或組織樣本分離多種mRNA?？蛇x地，該基因轉(zhuǎn)錄本可轉(zhuǎn)換為CDNA?；蜣D(zhuǎn)錄本的取樣進(jìn)行序列特異性分析和定量。將這些基因轉(zhuǎn)錄本序列豐度與包含病人和健康者標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)組的參考數(shù)據(jù)庫(kù)序列豐度相比較。使用本領(lǐng)域已知的方法探針也可附著于用于高通量篩選檢測(cè)中的固相支持物上。例如，國(guó)際PCT申請(qǐng)WO97/10365和美國(guó)專利號(hào)5，405，783、5,412,087和5,445,934披露了可含有一種或更多種序列的高密度寡核苷酸芯片的構(gòu)建。該芯片可使用美國(guó)專利5,405,783、5,412,087和5,445,934中披露的方法在衍生化的玻璃表面合成。光保護(hù)核苷亞磷酰胺可耦聯(lián)到玻璃表面，通過光刻用掩膜的光解進(jìn)行選擇性去保護(hù)，并與第二個(gè)受保護(hù)的核苷亞磷酰胺反應(yīng)。重復(fù)耦聯(lián)/去保護(hù)過程直至完成所需的探針?；虻谋磉_(dá)水平可通過將懷疑含有該多核苷酸的樣品暴露于探針修飾的芯片上來(lái)確定。提取的核酸通過例如熒光標(biāo)簽，優(yōu)選地在擴(kuò)增步驟中標(biāo)記。標(biāo)記的樣品的雜交在適當(dāng)?shù)膰?yán)謹(jǐn)水平下進(jìn)行。探針-核酸雜交的程度使用檢測(cè)裝置如共聚焦顯微鏡定量測(cè)定。見美國(guó)專利5,578,832和5,631,734。獲得的測(cè)定與基因表達(dá)水平直接相關(guān)。雜交探針與樣品核酸可通過本領(lǐng)域已知的多種方法檢測(cè)。例如，雜交核酸可通過檢測(cè)附著于樣品核酸的一個(gè)或更多個(gè)標(biāo)簽來(lái)檢測(cè)。該標(biāo)簽可通過任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式并入。在一個(gè)方面，該標(biāo)簽在制備樣品核酸的擴(kuò)增步驟中同時(shí)并入。因而，例如使用標(biāo)記的引物或標(biāo)記的核苷酸的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)將提供標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物。在一個(gè)單獨(dú)的實(shí)施方案中，使用標(biāo)記的核苷酸(例如，熒光素標(biāo)記的UTP和/或CTP)的如上所述的轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增將標(biāo)簽并入所轉(zhuǎn)錄的核酸。可替代地，標(biāo)簽可直接加入原始樣品核酸(例如mRNA、polyA、mRNA、cDNA等)中或在擴(kuò)增完成后加入擴(kuò)增產(chǎn)物中。將標(biāo)簽附著于核酸的方式對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，包括例如通過核酸的磷酸化(kinasing)反應(yīng)和隨后的核酸接頭的附著(連接)將樣品核酸與標(biāo)簽(例如熒光基團(tuán))連接的切口翻譯法或末端標(biāo)簽(例如使用標(biāo)記的RNA)法。適合用于本發(fā)明的可檢測(cè)的標(biāo)簽包括可通過光譜的、光化學(xué)的、生物化學(xué)的、免疫化學(xué)的、電的、光的或化學(xué)的手段檢測(cè)的任何組合物。本發(fā)明中有用的標(biāo)簽包括用于用標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素結(jié)合物染色的生物素、磁珠(例如DynabeadsTM)、熒光染料(例如熒光素、德克薩斯紅、羅丹明、綠色熒光蛋白之類)、放射性標(biāo)簽(例如&、1251、35S、"C或"P)、酶(例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶和其他ELISA中常用的酶)和比色標(biāo)簽如膠體金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、膠乳等)珠。教導(dǎo)使用上述標(biāo)簽的專利包括美國(guó)專利3,817,837、3，850，752、3，939，350、3，996，345、4,277,437、4，275，149和4,366,241。檢測(cè)上述標(biāo)簽的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的。因此，例如放射性標(biāo)簽可通過使用照相膠片或閃爍計(jì)數(shù)器檢測(cè)，熒光標(biāo)記可使用光檢測(cè)器檢測(cè)發(fā)射光來(lái)檢測(cè)。酶標(biāo)簽典型地通過給該酶提供底物并檢測(cè)酶對(duì)該底物作用產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物來(lái)檢測(cè)，比色標(biāo)簽通過簡(jiǎn)單地使該有色標(biāo)簽顯現(xiàn)檢測(cè)。專利公布WO97/10365公開了在雜交前或可替代地在雜交后將標(biāo)簽添加到一種或更多種靶(樣品)核酸的方法。這些是在雜交前直接附著或并入靶(樣品)核酸的可檢測(cè)的標(biāo)簽。相反，"間接標(biāo)簽"在雜交后結(jié)合到雜交雙鏈中。間接標(biāo)簽常常附著于在雜交前已經(jīng)附著于靶核酸上的結(jié)合部分。因此，例如耙核酸可在雜交前生物素化。雜交后，抗生物素蛋白結(jié)合的熒光團(tuán)將結(jié)合到帶有生物素的雜交雙鏈提供易于檢測(cè)的標(biāo)簽。關(guān)于標(biāo)記核酸分子和檢測(cè)標(biāo)記的雜交核酸分子的方法的詳細(xì)綜述，見LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,Vol.24:HybridizationwithNucleicAcidProbes,P.Tijssen,ed.Elsevier,N.Y.(1993)。在雜交到高密度探針陣列前可使用國(guó)際PCT申請(qǐng)WO97/10365中所披露的方法修飾核酸樣品以降低樣品復(fù)雜性從而降低背景信號(hào)并改善測(cè)量的敏感性。芯片檢測(cè)的結(jié)果典型地使用計(jì)算機(jī)軟件程序分析。參見例如EP0717113A2和WO95/20681。雜交數(shù)據(jù)讀入程序，該程序計(jì)算靶基因的表達(dá)水平。該數(shù)字同已有的患病和健康個(gè)體的基因表達(dá)水平數(shù)據(jù)組相比較。所獲數(shù)據(jù)與一組患病個(gè)體的數(shù)據(jù)之間相關(guān)表明受試者發(fā)病。也可修改已有的免疫測(cè)定法來(lái)檢測(cè)和定量表達(dá)?；虍a(chǎn)物的確定需要測(cè)量該基因產(chǎn)物反應(yīng)性抗體間發(fā)生的免疫特異性結(jié)合的量。為檢測(cè)和定量免疫特異性結(jié)合或雜交或擴(kuò)增過程中產(chǎn)生的信號(hào)，可使用包括但不限于檢測(cè)探針放射性或化學(xué)發(fā)光基團(tuán)的數(shù)字圖像分析系統(tǒng)。多肽產(chǎn)物的表達(dá)也可通過使用用于所表達(dá)的特定多肽的本領(lǐng)域已知的生物化學(xué)手段檢測(cè)。下述實(shí)施例提供本發(fā)明的示例性實(shí)施方案。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到可實(shí)施的不改變本發(fā)明精神或范圍的無(wú)數(shù)修飾和變化形式。這些修飾和變化形式涵蓋于本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例重組載體的滴定AAV載體滴度可根據(jù)基因組拷貝數(shù)(每毫升的基因組顆粒)來(lái)測(cè)定。如以前報(bào)道的，基因組顆粒濃度以載體DNA的TaqmanPCR為基礎(chǔ)(Clarketal.(1999)Hum.GeneTher.10:1031-1039;Veldwijketal.(2002)Mol.Ther.6:272-278)。簡(jiǎn)而言之，AAV載體用DNAse溶液處理以除去可能干擾病毒DNA精確測(cè)量的任何污染DNA。然后AAV載體用衣殼消化緩沖液(50mMTris-HClpH8.0、l.OmMEDTA、0.5%SDS、1.0mg/ml蛋白酶K)在5(TC處理1小時(shí)以釋放載體DNA。DNA樣品用與載體DNA中特異性序列如啟動(dòng)子區(qū)、轉(zhuǎn)基因或多腺苷酸(polyA)序列退火的引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。然后PCR結(jié)果通過如PerkinElmer-AppliedBiosystems(FosterCity,CA)Prism7700序歹U檢測(cè)系統(tǒng)(SequenceDetectorSystem)提供的實(shí)時(shí)Taqman⑧軟件定量。攜帶有如P-半乳糖苷酶或綠色熒光蛋白基因(GFP)的可測(cè)定標(biāo)記基因的載體可通過感染性測(cè)定(infectivityassay)來(lái)滴定。易感細(xì)胞(例如HeLa或COS細(xì)胞)用AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)并進(jìn)行測(cè)定以確定基因表達(dá)，如用X-gal(5-溴-4氯-3』引哚-P-D-B比喃半乳糖苷)染色p-半乳糖苷酶載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞或?qū)τ谵D(zhuǎn)導(dǎo)GFP的細(xì)胞用熒光顯微鏡。例如，該測(cè)定如下述進(jìn)行4X104HeLa細(xì)胞鋪于使用標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)培養(yǎng)基的24-孔培養(yǎng)板中的每個(gè)孔。貼壁后，即約24小時(shí)后，細(xì)胞用Ad5以10的感染復(fù)數(shù)(MOI)感染，用系列稀釋的包裝載體轉(zhuǎn)導(dǎo)并在37。C培養(yǎng)。一至三天后，在觀察到廣泛的細(xì)胞病變效應(yīng)之前，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)?shù)臏y(cè)定(例27如X-gal染色或熒光顯微鏡)。如果使用了報(bào)告基因如(3-半乳糖苷酶，細(xì)胞用2%的多聚甲醛、0.5%的戊二醛固定并用X-gal染色以測(cè)定|3-半乳糖苷酶活性。計(jì)數(shù)產(chǎn)生良好分離的細(xì)胞的載體稀釋。每個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞代表載體的1個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(tu)。全長(zhǎng)人ASMcDNA克隆到含有來(lái)自AAV血清型2和8的ITR的質(zhì)粒中。Jinetal.(2002)JClinInvest.109:1183-1191。AAV8-hASM含有血清型2-末端反向重復(fù)(ITRS)和DC-190肝限制性啟動(dòng)子控制下的人酸性鞘磷脂酶(hASM)cDNA。[Ziegleretal,(2004)Mol.Then9:231-240]。AAV2-hASM含有血清型2-末端反向重復(fù)(ITRS)和CMV增強(qiáng)子和雞P-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子控制下的人酸性鞘磷脂酶(hASM)cDNA。兩個(gè)重組載體都通過三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人293細(xì)胞產(chǎn)生并通過柱純化。AAV8-hASM和AAV2-hASM制劑的最終滴度為5.0><1012基因組拷貝(gc)每ml，如通過每個(gè)載體都含有的牛生長(zhǎng)激素多腺苷酸化信號(hào)序列的TaqManPCR所確定的。雜交載體可通過使用一系列的除了含有AAV血清型復(fù)制基因外還含有血清型特異性衣殼編碼結(jié)構(gòu)域的輔助質(zhì)粒進(jìn)行三重轉(zhuǎn)染產(chǎn)生。該策略允許AAVITR載體包裝入每個(gè)血清型特異性的病毒顆粒中。Rabinowitz,etal.(2002)JVirol.76:791-801。通過這種方法hASM重組基因組可用于產(chǎn)生一系列偽型rAAV-hASM載體。重組AAV載體可通過離子交換層析純化。O'Riordan,etal.(2000)JGeneMed2:444-54。重組AAV載體也可通過CsCl離心純化Rabinowitzetal.(2002)J.Urrol.76:791-801。AAV-ASM病毒體顆粒(抗DNAse顆粒)的最終滴度可通過CMV序列的TaqManPCR確定。Clarketal.(1999)Hum.GeneTherapy10:1031-1039。ASMKO小鼠中腦和全身性的聯(lián)合基因治療酸性鞘磷脂酶缺陷小鼠(ASMKO)，K.Horinouchiefa/,A^Ge"d.10(1995)，pp.288-292,進(jìn)行下述處理組1)小鼠在4周齡通過尾靜脈注射3ellgc的含有兩個(gè)HPrT增強(qiáng)子、人血清白蛋白啟動(dòng)子和人ASM轉(zhuǎn)基因的AAV2/8載體；組2)小鼠在6周齡通過在腦中的8個(gè)位點(diǎn)間的腦注射縫(split)注射含有增強(qiáng)子、啟動(dòng)子和人ASM轉(zhuǎn)基因的2ellgc;組3)小鼠在4周齡通過尾靜脈注射3el1gc的含有兩個(gè)HPrT增強(qiáng)子、人血清白蛋白啟動(dòng)子和人ASM轉(zhuǎn)基因的AAV2/8載體，兩周后相同小鼠通過在腦中的8個(gè)位點(diǎn)間的腦注射縫注射2ellgc的含有增強(qiáng)子、啟動(dòng)子和人ASM轉(zhuǎn)基因的AAV2載體；以及組4)小鼠不接受注射或接受僅有載體的假注射。組5)非ASMKO小鼠或野生型小鼠不接受注射。向所有進(jìn)行立體定位外科手術(shù)的ASMKO小鼠腦的8個(gè)區(qū)每位點(diǎn)注射3plAAV2-hASM(1.5e10gc)，總量為每腦24pl(1.2ellgc)。右半球的注射位點(diǎn)為下丘腦(-0.50、-1.00mm、-3.50mm)、海馬(-2.00mm、-1.75mm、-1.75mm)、延髓(-6.00mm、-1.50mm、-3.75mm)和小腦(-6.00mm、-1.50mm、-2.25mm);左半球注射的位點(diǎn)為紋狀體(0.50mm、1.75mm、-2.75mm)、運(yùn)動(dòng)皮層(0.50mm、1.75mm、-1.25mm)、中腦(-4.50mm、1.00mm、-3.50mm)和小腦(-6.00mm、1.50mm、-2.25mm)。注射用Hamilton注射器(HamiltonUSA,Reno,NV)以0.5^1/min的速率進(jìn)行，每次注射后針留在原位2分鐘以使在拔出針時(shí)病毒溶液的上流最小。所有未處理的ASMKO小鼠以及僅進(jìn)行腦注射AAV2(AAV2brain-)和僅進(jìn)行全身性注射AAV8(AAV8systemic-alone)組的ASMKO小鼠最終都處于垂死狀態(tài)。相反，通過腦和全身聯(lián)合注射處理的ASMKO小鼠未達(dá)到垂死狀態(tài)，但為做對(duì)比分析仍然在54周時(shí)處死。對(duì)動(dòng)物進(jìn)行廣泛灌注以除去所有血液并分成生物化學(xué)組(cohort)和組織學(xué)組(cohort)。在生物化學(xué)組中，肝、肺、脾和骨骼肌切成兩片；一片用于分析hASM水平，另一份用于分析鞘磷脂貯積。在腦中，左右半球分開，每個(gè)半球沿A-P軸進(jìn)一步切成五個(gè)2mm的片。左半球的片進(jìn)行hASM蛋白和抗hASM分析。酸性鞘磷脂酶(ASM)血清水平和抗ASM血清抗體水平在整個(gè)研究中都進(jìn)行測(cè)量。在整個(gè)研究過程中對(duì)小鼠進(jìn)行多種測(cè)試體重評(píng)價(jià)、加速滾輪測(cè)試、搖擺滾輪測(cè)試和Barnes迷宮測(cè)試。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中也收集了存活率曲線數(shù)據(jù)。小鼠死亡后，收集組織，測(cè)量每個(gè)小鼠的腦、肝、肺、脾和肌肉組織中的鞘磷脂水平。腦和肝中人ASM蛋白表達(dá)也通過使用免疫組化定性評(píng)價(jià)。研究在54周終止；所有組3(聯(lián)合注射組，combo)小鼠在研究終止時(shí)都存活并且健康。酸性鞘磷脂酶血清水平通過使用特異性抗該人類酶的多克隆抗體的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)進(jìn)行定量。圖7圖示了隨時(shí)間的血清ASM蛋白水平。小鼠死亡時(shí)腦和肝中ASM也通過免疫組化測(cè)定。在組2和組3小鼠的腦中觀察到陽(yáng)性ASM染色，在組3的小鼠中觀察到定性的更亮的染色。在紋狀體、海馬、中腦和小腦中觀察到染色。在組1小鼠或未處理ASMKO小鼠的腦中沒觀察到ASM染色。在組1和組3小鼠的肝中觀察到陽(yáng)性ASM染色。在組2小鼠或未處理ASMKO小鼠的肝中沒觀察到ASM染色。組織鞘磷脂水平定量方法如下通過在氯仿:甲醇(1:2)中勻漿10至50mg組織制備組織提取物并在37。C孵育1小時(shí)。通過離心去除細(xì)胞碎片后，使用水提取勻漿兩次，有機(jī)相(含有該脂質(zhì))轉(zhuǎn)移到干凈的玻璃管中然后在37'C加熱通氮干燥。提取物中的鞘磷脂量通過使用AmplexRed鞘磷脂酶測(cè)定試劑盒(MolecularProbes)間接測(cè)量。提取物用固定量的來(lái)自蠟樣芽胞桿菌的外源細(xì)菌鞘磷脂酶(Sigma-Aldrich，StLouis,MO,USA)在AmplexRed工作站中處理。鞘磷脂被細(xì)菌的酶水解以產(chǎn)生神經(jīng)酰胺和磷酰膽堿。后者進(jìn)一步水解成膽堿，膽堿依次氧化產(chǎn)生甜菜堿和過氧化氫。釋放的過氧化氫通過與AmplexRed反應(yīng)以產(chǎn)生高熒光性的能通過590nm處熒光發(fā)射檢測(cè)的試鹵靈來(lái)定量。正常C57BL/6小鼠組織中鞘磷脂水平約為鼠齡匹配的ASMKO小鼠中觀察值的5-10%。圖8和圖9圖示了腦和內(nèi)臟器官中鞘磷脂水平。血清中抗人酸性鞘磷脂酶特異性抗體水平通過ELISA測(cè)量。見圖7E。將系列稀釋血清加入到覆蓋有酶或熱滅活A(yù)AV顆粒的96孔板的孔中。結(jié)合的抗體通過使用辣根過氧化物酶結(jié)合的羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)、IgM和IgA(Zymed,SanFrancisco,CA,USA)檢測(cè)。板和底物(Sigma-Aldrich)—起室溫培養(yǎng)20分鐘以顯色。滴度定義為產(chǎn)生OD450等于或低于0.1的最高稀釋血清的倒數(shù)。圖7A至7D圖示了處理和未處理小鼠的循環(huán)中的抗hASM抗體水平。腦實(shí)質(zhì)中的抗體通過如下修改的測(cè)定法來(lái)測(cè)量。組織裂解液在抗體稀釋緩沖液中1:20稀釋，一式兩份加入到覆蓋有100nghASM的96孔板中。第二抗體HRP的結(jié)合和生色底物反應(yīng)按前述方法進(jìn)行。結(jié)合的hASM特異性抗體濃度應(yīng)與來(lái)自結(jié)合物的HRP反應(yīng)的顏色強(qiáng)度直接相關(guān)。因此，最終的結(jié)果報(bào)告為1:20裂解稀釋液產(chǎn)生的OD450的絕對(duì)變化以提供與血清中使用的滴定法相比更敏感的抗體水平測(cè)定。使用以1:200稀釋的抗hASM生物素化單克隆抗體分析腦切片hASM表達(dá)，用抗生蛋白鏈菌素-Cy3-結(jié)合的第二抗體在紅色熒光下顯影[Passini,M.A.etal.(2005).嵐T7zer.11:754-762]。腦中膽固醇底物通過使用非律平(filipin)染色方案檢測(cè)，如所報(bào)告的那樣[Passini,M.A.etal.(2005).Mo/.T7zer.11:754-762]。簡(jiǎn)而言之，非律平(Sigma,StLouis,MO)溶解在100%甲醇中至10mg/ml的工作濃度。腦切片在暗中室溫(RT)下孵育3h，然后RT下用PBS洗滌三次，在藍(lán)色熒光下檢查。進(jìn)行Lysenin染色以確定鞘磷脂底物原位模式，如所報(bào)告的那樣[Shihabuddin，L.S.etal.(2004).J.JVewwsd.24:10642-10651]。簡(jiǎn)而言之，lysenin(PeptidesInternational,Louisville,Kentucky)溶角率在含有0.5%BSA、0.02%皂角武(Sigma)禾n5%標(biāo)準(zhǔn)驢血清的PBS中至10mg/ml。腦切片與lysenin在4。C孵育過夜，然后過夜孵育1:250稀釋的兔抗lysenin抗體(PeptidesInternational)。Lysenin陽(yáng)性細(xì)胞用1:250稀釋的FITC抗兔抗體(JacksonImmunoResearch,WestGrove，PA)顯影并用綠色熒光檢查。每個(gè)小鼠通過使用本領(lǐng)域已知的方法在Smartrod(AccuScan)上進(jìn)行加速和搖擺滾輪測(cè)試來(lái)測(cè)試運(yùn)動(dòng)功能，該方法在Sleatetal.(2004)J.Ne薦ci.24:9117-9126中進(jìn)行了重復(fù)。小鼠通過使用SmartrodRotorodProgram(AccuScanInstruments,Columbus,OH)進(jìn)行力口速禾口搖擺滾輪測(cè)試來(lái)評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)功能。加速滾輪上滾輪轉(zhuǎn)動(dòng)的速度進(jìn)行了程序設(shè)定以在60秒從0-30rpm以恒定比率加速，搖擺滾輪進(jìn)行程序設(shè)定以在54秒每2.5秒向前向后加速至最終速度25rpm。每只動(dòng)物在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上進(jìn)行四次試驗(yàn)，記錄從平臺(tái)上落下的停留時(shí)間(latency)。高的停留時(shí)間得分等于良好的表現(xiàn)。單個(gè)試驗(yàn)至少間隔15min以使動(dòng)物有休息期。圖3和4圖示了作為測(cè)量運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的滾輪測(cè)試的結(jié)果。每個(gè)小鼠進(jìn)行Barnes迷宮測(cè)試。對(duì)小鼠進(jìn)行訓(xùn)練，使之找到藏在位于大的扁平塑料盤周邊的20個(gè)洞穴中其中一個(gè)之下的暗隧道，塑料盤通過四個(gè)在上的鹵素?zé)粽樟?。通過迷宮以找到正確的暗洞穴的時(shí)間與認(rèn)知功能負(fù)相關(guān)——更短的通過時(shí)間表明更好的認(rèn)知功能。圖5圖示了作為測(cè)量認(rèn)知功能恢復(fù)的Barnes迷宮測(cè)試(BarnesMazetest)的結(jié)果。存活曲線圖示于圖6。以解決(addressing)ASMKO小鼠的功能異常和疾病后遺癥對(duì)以腦和內(nèi)臟兩個(gè)為靶標(biāo)的AAVhASM聯(lián)合注射方案進(jìn)行了評(píng)價(jià)。在聯(lián)合組中(n=ll)，四周齡ASMKO小鼠通過尾靜脈注射接受3.0X10"基因組拷貝(gc)的AAV8-hASM。兩周后，在6周齡，同樣的小鼠注射AAV2-hASM至左半球的運(yùn)動(dòng)皮層、紋狀體、中腦和小腦，以及到右半球的下丘腦、海馬、延髓和小腦。每個(gè)結(jié)構(gòu)注射1.5Xl(Tgc，每腦的總量1.2X1()Ugc。處理對(duì)照組在4周齡僅接受全身性注射AAV8-hASM(n=12)或在6周齡僅接受腦注射AAV2-hASM(n=14)，未處理對(duì)照組包括ASMKO(n=23)和野生型(n=10)小鼠。進(jìn)行定期眼采血以測(cè)量循環(huán)中hASM水平和抗hASM抗體水平。對(duì)僅進(jìn)行全身性注射和聯(lián)合注射處理的ASMKO小鼠血清的分析顯示了最高的循環(huán)的hASM水平。因?yàn)樵摬《狙逍偷内呄蛐院驮谠O(shè)計(jì)表'達(dá)盒時(shí)選定的肝限制性啟動(dòng)子(DC190)，AAV8-hASM轉(zhuǎn)導(dǎo)和隨后的表達(dá)主要為肝介導(dǎo)的。兩組在注射后2周均達(dá)到hASM的峰值水平，其隨后在本研究期間降低達(dá)10倍。來(lái)自未處理ASMKO和僅進(jìn)行腦注射AAV2的組的血清中沒有顯示可檢測(cè)的hASM水平。進(jìn)一步的血清分析表明通過聯(lián)合或僅進(jìn)行全身性注射AAV8處理的小鼠中抗hASM抗體水平與未處理ASMKO小鼠中觀察到的低基線水平相似。相反，僅進(jìn)行腦注射AAV2的組的小鼠表現(xiàn)出快速?gòu)?qiáng)烈(200倍增加)的抗hASM抗體滴度的誘導(dǎo)。因而，全身性注射AAV8-hASM處理的小鼠看來(lái)好像對(duì)表達(dá)的hASM產(chǎn)生了免疫耐受。聯(lián)合或僅進(jìn)行全身性注射AAV8處理的小鼠肝、肺、脾和肌肉中明顯有高水平的該酶，推測(cè)起來(lái)是在循環(huán)中的該酶在6-磷酸甘露糖受體介導(dǎo)的胞吞作用后。僅進(jìn)行腦注射AAV2的組的內(nèi)臟器官中人ASM水平與未處理ASMKO對(duì)照小鼠中觀察到的相比沒有顯著提高。對(duì)聯(lián)合和僅進(jìn)行腦注射AAV2的組的腦的分析顯示高水平的hASM遍及軸索。然而，盡管在兩個(gè)組中都使用了了相同的重組AAV2載體，與僅進(jìn)行腦處理的組相比，聯(lián)合組顯示出顯著更高的hASM水平。僅進(jìn)行全身性注射處理的小鼠腦中hASM水平低并處于可與未處理ASMKO小鼠可類比的水平。這表明循環(huán)中來(lái)自于肝的hASM不能跨過血腦屏障進(jìn)入CNS。有趣的是，腦勻漿中抗hASM抗體滴度在僅進(jìn)行腦注射AAV2的組中比其他組包括聯(lián)合組高約10倍。因而，腦中表達(dá)水平是抗體滴度的倒數(shù)(reciprocal);聯(lián)合組顯示高水平的hASM和低水平的抗hASM抗體，而僅進(jìn)行腦注射AAV2的組顯示低水平的hASM和高水平的抗hASM抗體水平。確定了hASM表達(dá)對(duì)于糾正ASMKO小鼠內(nèi)臟和腦中貯積病變的效果。在所有檢查的來(lái)源于僅進(jìn)行全身性注射AAV8和聯(lián)合組的內(nèi)臟組織中，完全糾正了鞘磷脂貯積。相反，僅接受腦注射的動(dòng)物內(nèi)臟中含有高水平的鞘磷脂，這與未處理的ASMKO小鼠類似。對(duì)通過聯(lián)合注射處理的ASMKO小鼠腦中鞘磷脂水平的分析顯示該底物普遍降低到野生型水平。這對(duì)于僅進(jìn)行腦注射AAV2的組來(lái)說的是一個(gè)改善，其僅在注射位點(diǎn)相應(yīng)的腦塊顯示出顯著的鞘磷脂降低。因此，僅進(jìn)行腦注射的組的糾正范圍顯著小于并從未達(dá)到聯(lián)合組中所觀察到的效果。僅進(jìn)行腦注射AAV2的組中較低效的鞘磷脂貯積減少與在該組中觀察到的較低水平的酶相關(guān)。在僅進(jìn)行全身性注射AAV8的組中觀察到高水平的腦鞘磷脂，其與未處理的ASMKO相似。對(duì)腦切片也進(jìn)行hASM表達(dá)以及原位鞘磷脂和膽固醇貯積的組織學(xué)分析。hASM表達(dá)模式和鞘磷脂貯積的清除模式在僅進(jìn)行腦注射AAV2的組中互相重疊。相反，接受聯(lián)合治療的動(dòng)物中鞘磷脂貯積的糾正擴(kuò)展到遠(yuǎn)超過注射位點(diǎn)之外。這導(dǎo)致了病變逆轉(zhuǎn)的模式與聯(lián)合治療的轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)域相比既有重疊又有非重疊的模式。使用膽固醇標(biāo)記非律平也觀察到這種關(guān)系。聯(lián)合組中大量腦區(qū)清除了膽固醇貯積，而僅進(jìn)行腦注射AAV2的組中僅觀察到局部的和更有限的膽固醇清除。因此，聯(lián)合注射處理的小鼠與僅接受腦注射處理的小鼠相比，hASM從注射位點(diǎn)擴(kuò)散以糾正腦遠(yuǎn)側(cè)區(qū)貯積病變的能力顯著性的更好。僅進(jìn)行全身性注射AAV8的組未顯示任何可測(cè)量的腦中鞘磷脂或膽固醇貯積的糾正，這一點(diǎn)從上述生物化學(xué)數(shù)據(jù)可以預(yù)測(cè)到。從IO周齡開始，小鼠每?jī)芍茉诩铀俸蛽u擺滾輪上測(cè)試運(yùn)動(dòng)功能。33聯(lián)合組動(dòng)物在兩個(gè)滾輪測(cè)試中所有檢查的時(shí)間點(diǎn)都顯示出顯著改善的運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)(pO.OOl)。僅進(jìn)行腦注射AAV2處理的小鼠顯示與未處理的ASMKO小鼠相比在早期時(shí)間點(diǎn)加速滾輪上顯示中度改善的運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)。然而，在晚期時(shí)間點(diǎn)其表現(xiàn)下降了，這證明僅進(jìn)行腦注射不足以維持對(duì)運(yùn)動(dòng)功能的糾正。對(duì)于更嚴(yán)格的測(cè)試運(yùn)動(dòng)功能和協(xié)調(diào)性的搖擺滾輪，僅進(jìn)行腦注射AAV2的組在整個(gè)研究中自始至終表現(xiàn)差。僅進(jìn)行全身性注射AAV8的組在任何一個(gè)測(cè)試中顯示少至無(wú)的受益(little-to-nobenefit)。從17周齡開始，小鼠每4周也在Bames迷宮上測(cè)試認(rèn)知功能。在不利光刺激下小鼠利用記憶介導(dǎo)的空間行走線索逃離迷宮。僅進(jìn)行腦注射AAV2的組比未處理的ASMKO表現(xiàn)更好，但從未達(dá)到野生型小鼠中觀察到的表現(xiàn)水平。僅進(jìn)行全身性注射處理的小鼠與未處理的對(duì)照相比顯示或多或少的改善。相反，聯(lián)合組在Barnes迷宮上表現(xiàn)出與野生型小鼠相似的熟練程度(p>0.05)?？偨Y(jié)滾輪數(shù)據(jù)，腦和內(nèi)臟兩者病變的糾正對(duì)于最大功能結(jié)果是必需的。小鼠每?jī)芍芊Q重以評(píng)價(jià)其總體健康情況，其存活率通過Kaplan-Meier曲線分析。聯(lián)合組體重增加概況與野生型相似，比僅進(jìn)行腦注射AAV2和全身性注射AAV8的組顯著要好(pO.OOl)。垂死狀態(tài)的動(dòng)物定義為重度共濟(jì)失調(diào)、不摔跤不能進(jìn)行直線行走、不能清潔、體重?fù)p失20%和脫水，為人道主義目的將其處死。與壽命中位數(shù)為34周的未處理ASMKO小鼠相比，聯(lián)合、僅進(jìn)行腦注射AAV2和僅進(jìn)行全身性注射AAV8的組顯示存活率增加。然而，所有通過聯(lián)合注射處理的ASMKO小鼠存活至54周齡并且未顯示共濟(jì)失調(diào)的跡象。這與僅進(jìn)行腦注射AAV2和僅進(jìn)行全身性注射AAV8的組相比是顯著的改善，后者中所有動(dòng)物最終變得處于垂死狀態(tài)，壽命中位數(shù)為48和47周的(p<0.0001)。在單個(gè)部位注射的組中(singlyinjectedgroup)的沒有一只動(dòng)物存活至54周。因此，盡管僅對(duì)腦或內(nèi)臟進(jìn)行處理確實(shí)提供顯著的存活受益，但比用聯(lián)合治療對(duì)上述身體區(qū)間都處理的效果要差。根據(jù)本說明書中引用的參考文獻(xiàn)的教導(dǎo)可對(duì)本說明書進(jìn)行最充分的理解。本說明書中的實(shí)施方案提供對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案的示例性說明，不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。技術(shù)人員易于認(rèn)識(shí)到本發(fā)明涵蓋許多其他實(shí)施方案。在本公開中引用的所有出版物、專利和生物序列以其整體通過引用合并于此。對(duì)于通過引用合并的材料與本說明矛盾或不一致的地方，本說明書將替代任何這樣的材料。此處引用的任何參考文獻(xiàn)并非承認(rèn)該參考文獻(xiàn)對(duì)于本發(fā)明來(lái)說屬于現(xiàn)有技術(shù)。除非另有說明，本說明書包括權(quán)利要求書中所用的所有表達(dá)成分量、細(xì)胞培養(yǎng)、處理?xiàng)l件等的數(shù)字應(yīng)理解為在所有情況下通過詞語(yǔ)"約"修飾。相應(yīng)地，除非另有相反說明，數(shù)字參數(shù)為近似值，可根據(jù)本發(fā)明要獲得的所需性質(zhì)變化。除非另有說明，在一系列成分前的術(shù)語(yǔ)"至少"應(yīng)理解為是指該系列的每個(gè)成分。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到或通過不超過常規(guī)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虼_定許多此處描述的本發(fā)明具體實(shí)施方案的等同內(nèi)容。這些等同內(nèi)容被權(quán)利要求所涵蓋。權(quán)利要求1、包括下述步驟的方法a)給予有效量的包括編碼免疫原的轉(zhuǎn)基因的病毒載體至哺乳動(dòng)物的肝組織；和b)隨后給予有效量的包括編碼免疫原的轉(zhuǎn)基因的第二病毒載體至所述哺乳動(dòng)物的腦。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在所述哺乳動(dòng)物中檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因的表達(dá)之后給予所述的第二載體。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中轉(zhuǎn)基因編碼溶酶體貯積癥蛋白或多肽。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中蛋白或多肽為酸性鞘磷脂酶多肽或蛋白。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中哺乳動(dòng)物為人。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中給予至哺乳動(dòng)物的腦的位點(diǎn)選自腦干、中腦、海馬、紋狀體、延髓、腦橋、中腦泡、小腦、丘腦、下丘腦、大腦皮質(zhì)、枕葉、顳葉、頂葉或額葉。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中給予至哺乳動(dòng)物的腦的位點(diǎn)為小腦的小腦深部核團(tuán)。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中病毒載體為腺伴隨病毒(AAV)。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中AAV載體選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中AAV為重組AAV載體。11、根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中重組AAV載體選自AAV2/1、AAV2/2、AAV2/5、AAV2/7或AAV2/8血清型載體。12、根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中重組AAV載體包括肝特異性增強(qiáng)子和啟動(dòng)子元件。13、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中重復(fù)歩驟b)。14、治療哺乳動(dòng)物A型尼曼-皮克病的方法，其包括下述步驟a)給予有效量的包括編碼酸性鞘磷脂酶多肽或蛋白轉(zhuǎn)基因的病毒載體至哺乳動(dòng)物的肝組織；和b)隨后給予有效量的包括編碼酸性鞘磷脂酶多肽或蛋白轉(zhuǎn)基因的第二病毒載體至所述哺乳動(dòng)物的腦，由此治療該哺乳動(dòng)物的A型尼曼-皮克病。15、根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中重復(fù)步驟b)。16、根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中在所述哺乳動(dòng)物中檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因的表達(dá)之后給予所述的第二載體。17、根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中哺乳動(dòng)物為人。18、根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中給予至哺乳動(dòng)物的腦的位點(diǎn)選自腦干、中腦、海馬、紋狀體、延髓、腦橋、中腦泡、小腦、丘腦、下丘腦、大腦皮質(zhì)、枕葉、顳葉、頂葉或額葉。19、根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中給予至哺乳動(dòng)物的腦的位點(diǎn)為小腦的小腦深部核團(tuán)。20、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中病毒載體為腺伴隨病毒(AAV)。21、根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中AAV載體選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7或AAV8。22、根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中AAV為重組AAV載體。23、根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中重組AAV載體選自AAV2/1、AAV2/2、AAV2/5、AAV2/7或AAV2/8血清型載體。24、根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中重組AAV載體包括肝特異性增強(qiáng)子和啟動(dòng)子元件。全文摘要本發(fā)明涉及用于使哺乳動(dòng)物腦對(duì)外源性給予的酸性鞘磷酯酶多肽耐受的方法和組合物，其通過首先向該哺乳動(dòng)物肝組織投遞有效量的編碼該多肽的轉(zhuǎn)基因然后向該哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)給予有效量的該轉(zhuǎn)基因?qū)崿F(xiàn)。文檔編號(hào)A61K31/70GK101405008SQ200780009401公開日2009年4月8日申請(qǐng)日期2007年2月8日優(yōu)先權(quán)日2006年2月8日發(fā)明者J·道奇,L·謝哈布丁,M·A·帕西尼,R·J·齊格勒,S·H·鄭申請(qǐng)人:建新公司