專利名稱：用于惡性腫瘤基因治療的增殖和腫瘤細胞特異性基因操縱系統(tǒng)的制作方法
用于自中瘤基因治療的增殖和腫瘤細胞特異性基因^^統(tǒng)
技術領域：
本發(fā)明屬于生 術領域，具,及一種高度增殖特異',組真核細胞啟動子(PCNATAI); ^以PCNATAI作為基因,的啟動子，由腫瘤細胞特異鵬動子啟動彭i的Cre重會SH激活，以高度增殖特異性和腫瘤細胞特異t4)5S^M莫式，啟動外源性治療基因在惡倒中瘤細胞中高^#異性皿的敦亥細 統(tǒng)；以^ffl該操l^統(tǒng)各皿部分構建的相應^M細胞表達質粒載體、彭鵬病毒穿艦粒載體和彭孤彌毒^iWo
背景M惡'鵬中瘤^^，害人類 的5^疾病，在全世界人口死亡原因中，第三，自2006年起惡倒中瘤已誠為我國城鄉(xiāng)居民死亡的首要原因。目前惡倒中瘤的治療仍采用手術切除為主，放、化療為輔的綜合治療方法。因惡倒中瘤呈浸潤性生長，手術不易^t刀；放、化療不僅難以達到滿意的療效，還^患者帶3fc 隹以耐受的全身性毒、副作用；故尋求有效的治療fm徑勢在必行。近來的研，示，基因治g可能成為未來惡'創(chuàng)中瘤治療的有效手段，并展示出誘人的光明前景，但高效,和可靠的安全性是決定基因治療成功的先決條件。然而，現(xiàn)有基因治療載軒但,效率低，且特異'隨；既不能在腫瘤細胞中高效,，又不能將治療基因的，嚴格限定于腫瘤細胞中；因而不但治療效果不理想，還^t成腫瘤周圍組織中乃至全身多種正常細胞的損傷，這是制約惡倒巾瘤基因治療的瓶頸。因此，構建安全、高效細巾瘤細胞特異性治療基因^ii^體是惡ttl中瘤基因治療亟,決的問題111。
高度增殖是所有惡倒中瘤細胞的共同特征，耐中瘤周圍組織的正常細胞絕大多數(shù)處于非增殖狀態(tài)。人增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antig叫PCNA)為全增殖期細胞特異性高,的標志物，^^有惡倒中瘤中的陽性敏糊為100%，其^i7K平與腫瘤的惡性禾SSS正比，耐中瘤周圍組織中處于非增殖狀態(tài)的正常細胞不敏PCNAP1。說明惡魁中瘤細胞中有高效撒活PCNA基因啟動子的微環(huán)境；腫瘤周圍組織中處于非增殖狀態(tài)的正常細胞內不具備欽活PCNA基因啟動子的斜牛；PCNA基因的啟動子為嚴格的增殖特異性啟動子，^f^7K平與細胞的增殖活i4^腫瘤的惡性禾號成正相關，^"腫瘤特異性基因治CT^殖特異性的要求。故利用PCNA基因啟動子啟動夕卜源性治療基因的皿，不但可i^卜源性治療基因在惡糊中瘤細胞內高效,，還可將外源性治療基因的鋭限定在處于高度增殖狀態(tài)的惡性腫瘤細胞內。ffl3l這種增殖特異性的限制，既可^^卜源性治療基因的表達能有效剎窮惡倒中瘤細胞，又可防ih^卜源性治療基因損傷處于非增殖狀態(tài)的正常細胞。
目前已明確PCNA基因啟動子屬于典型的看,因啟動子，，苷,列的-900^60區(qū)段中(啟動子區(qū)DNA序列編號以緑起始位點的蹄酸編號為+1，起始位點上游鄰近核苷酸編號為-1，并向5'方向編號，值依 增；起始位點下游鄰近核苷酸編號為+2，并向3'方向編號依次遞增)，多種反式作用因子的結合位點。我們用增強綠熒光蛋白(EGFP)報導系統(tǒng)，對PCNA基因啟動子^g^ff列-900^64區(qū)段在多種人惡幽中瘤細iam及體外i歸大鼠M^,細胞中的,效斜卩增殖特異'l4a行了檢測。初,實，用攜帶PCNA基因啟動子-900^f64區(qū)段核苷,列及受其調控的下游EGFP ^t基因的獻亥細i^iM粒轉染人惡l^中瘤細鵬后，順$娘動報道蛋白EGFP的表達；而轉染該真核細胞表達質粒的體外培養(yǎng)大鼠星形膠質細胞幾乎不表達EGFP。以上結果說明PCNA基因啟動子核苷,列的-90(M^4區(qū)段具備了必要的增殖特異性和緑活性。對其進行合理的優(yōu)化麟)I賄可倉淛備出一^S用于多種惡倒中瘤基因治療的廣譜增殖特異't^a動子。我們^3l分段m，進一步確定，苷,列的-778^61區(qū)段不但增殖特異性最好，艦下游受其調控基因的録啟動活性最強，可作為以增殖特異性模式啟動夕卜源性治療基因皿的核心啟動子。
體內具有自糊胞更新能力的正常組織內都含有一定數(shù)量的特定干細胞(如骨M3tlfiL干細胞、表皮基廳細胞、毛囊的^ffl胞等)，群且織更M:程中作為種子細胞，不 1分裂增歹艦定向分化形成新的成熟細胞，用以替補衰老凋亡的細胞，在維搟且織中各種正常細胞數(shù)量的動拼衡方面具有;^T^ft的作用[31。如J^述，雖然PCNA基因啟動子在處于非增殖狀態(tài)的正常細胞內不能啟動外源性治療基因,，但因所有正常干細胞也都處于增殖活躍狀態(tài)，用該啟動子啟動夕卜源性治療基因鋭仍有可能會對這些正常千細lfi^生不良影響。故單純解決了外源性治療基因在惡粗中瘤細胞中就的增殖特異性，還不能傲錢因治療的鄉(xiāng)樹安全。
已知^S倒中瘤細胞麗敬期轉的蛋白標志物，如乳&鑣細胞特異性就Her-2蛋白[41，肝細M細胞特異性皿HIP/PAPl和甲胎蛋白(AFP)^，;^癌細胞特異性皿癌Mjt原(CEA)等171。而另夕卜蝶倒中瘤細胞可高^ii其起源組織細胞棘的蛋白標志物，如B細胞性惡性淋巴瘤細胞高皿正常B淋巴細胞^W的蛋白標志物CD20181，，自細,源腫瘤高,正常星形皿細胞,的蛋白標志物，纖維酸性蛋白(GFAP)91，前列腺癌細胞高，正^列腺上皮細胞特有的蛋白標志t/fr列腺特異',抗原(PSMA)等網。以上事實說明i^腫瘤細胞有激活各自特異性蛋白標志物編碼基因啟動子的能力，也即這些啟動子是不同惡'啦中瘤細胞的特異性啟動子。因此，如能構建一個用PCNA基因啟動子啟動目的基因駄，用腫瘤細胞特異性啟動子啟動反式調控因，逸，由反式調控因子調控PCNA基因啟動子,活性的目的基因皿操縱系統(tǒng)，既剛鈔卜源性治療基因在惡翻中瘤細胞中高效敏，又可MilPCNA基因啟動子增殖特異性和腫瘤細胞特異性啟動子細胞特異性的鵬限制，i^卜源性治療基因的敬M^格限制在惡倒中瘤細胞內，就可有效防必卜源性治療基因對全身增殖期和非增殖期正常細,生4瞎異性剎別乍用，以確鵬倒中瘤基因治療的娃性。
Crc重組酶(Crerecombinase,Cre) ;1^源于P1噬菌體的I型拓撲異構酶，可iffii辦異性識別元件LoxP催化DNA的位點特異性同源重組。該SK崔化效率高，短時間內即可超臓物和產物的動拼衡，且催ft^程不需對頓倉遣輔助因子。LoxP元件為^34bp的DNA序列，其兩端
4為13bp的反轉Sfij^列，中間為8bp的間隔序列，，列決定了LoxP元件的方向性，并進一步決定了Cre介導DNA重組的方式。當兩個LoxP元件6^f向相同時，兩個LoxP元件之間的序列在Cre的催化下被環(huán)^l^]除，使其上下游核苷,列對接重組叫。Cre-LoxP系統(tǒng)的高效、特異和穩(wěn)定性使其成為基因和^fe體修飾的有力工具，可以il31特異性^:il^ Cre重組酶刪除LoxP位點間的DNA序列，故可作為楊。、啟動子的輔助調縣統(tǒng)。已知在人類基因組中無內源性LoxP元件的核苷,列，將Cr^LoxP系統(tǒng)導入A^織iffl胞不^g^^基因組結構和^t,列改變，所以將Cre-LoxP輔助調縣鄉(xiāng)j^于人惡'幽中瘤基因治療是安全的。

發(fā)明內容本發(fā)明目的之一是鵬一種高度增殖特異性X+亥細M動子'PCNATAr';本發(fā)明目的之二;W^—種由Cre重組酶激活、以高度增殖特異性豐1^調控下 瘤或自 因皿的餓細胞基因操縣統(tǒng)'PCNATAI-LoxP-stop"LoxP";本發(fā)明目的;tH^J^"^利用PCNATAI-LoxP-stop"LoxP操縣纖驗卜源性基因以腫瘤細胞特異性和增殖特異性)KS特異性模式在惡性腫瘤細胞中高效就的S^案。同時本發(fā)明還以惡性 瘤為例提供了使用方法和實例。
本發(fā)明的具體發(fā)明內容包括
發(fā)明l、 一種高度增殖特異性餓細胞啟動子PCNATAI， K^,列如序列表l辦列表2際。
發(fā)明2、 一種如發(fā)明1所述的高度增殖特異性真核細胞啟動子PCNATAI的獲得方法，其待點是以AK生型增殖細胞核抗原PCNA位*核苷酸序列為原型，并對其進行下列兩個片段的鵬得到
第一、用腺病毒E1B TATA ^t，,列AGGGTATATAATG取4，生型PCNA啟動子區(qū)原-29—21位核苷,列；
第二用多數(shù)基因M的典型lf^始元件Inr核苷,列CCATTCC取代PCNA啟動子區(qū)原有的-2—5位核苷,列，同時在其下游形成一個限制性內切酶&c n的識別位點。
發(fā)明3、 一種含有發(fā)明1所述的啟動子PCNATAI、并由Cre重組酶激活、以高度增殖特異性模式調控下齢卜源性治療基因皿的，細胞基因操m^統(tǒng)PCNATAI-LoxP-stop-LoxP,，苷酸序列如序列表3鵬列表4戶標。
發(fā)明4、 一種如發(fā)明3所述的真核細胞基因操縱系統(tǒng)PCNATAI-LoxP-stopioxP的獲得方法，該方法包括
第一、以權利要求1戶皿的啟動子PCNATAI作為i^^,動夕卜源性治療基因,的核心啟動元件；
第二、在啟動子PCNATAI下游端插入pBS302質粒的"LoxP-Stop"LoxP"序列作為該操縱系統(tǒng)的,[Sii元件，其中Stop為^llh^列，LoxP為Cre重組酶的特異性識別序列。
發(fā)明5、 一種利用發(fā)明3臓的餓細鵬因操!^統(tǒng)PCNATAI-LoxP-StopioxP在惡幽中瘤細胞中以增殖和腫瘤細 3特異性模式高效操綴卜源性抑瘤或自 因皿的方法。即在惡性腫瘤細胞中翻中瘤細胞特異性 模式誠鄉(xiāng)Cre重鄉(xiāng)鵬，使;til3i同源重組機制刪除^lt異性識別位點之間的^^終，列Stop，從而解除Stop序列對PCNATAI啟動的^31程的阻遏作用，最^^下齢卜源性抑瘤基因或自雜因在PCNATAI的啟動下在惡魁中瘤細胞中以腫瘤細胞特異艦增殖特異^S特異性模式高效、特異性敏。
注*啟動子區(qū)DNA序列編號以ff^(臺位點的蹄,號為+l。起始位點上游鄰近^^,號為-l，并向5'方向編號f6^值依7:fcii增；起始^^下游鄰近^MS號為+2，并向3'方向編號依^iii增。本發(fā)明的儲和積極鄉(xiāng)
本發(fā)明提供了一個指導外源性治療基因在惡倒中瘤細胞中高效、特異性泰逸的^#^案，其中包括 一個優(yōu)^S組的增殖特異性啟動子， 一個基于該重組啟動子的調節(jié)外源性抑瘤或自皿因魏對亥細鵬縱系統(tǒng)，以及利用該系統(tǒng)啟動夕卜源性抑瘤或自然基因在惡粗中瘤細胞中高效、特異性就的^^案。
本發(fā)明的技術方案是以增殖特異'鵬動子PCNATAI作為啟動夕卜源性治療基因鋭的楊1>元件，艦CreioxP同源重組機制將腫瘤細胞特異性啟動子的腫瘤細胞特異性和PCNATAI的增殖特異性有機結合，共同實5^卜源性抑瘤或自 因在惡糊中瘤細胞中的高效、特異性皿。
與現(xiàn)有^ffi比，本發(fā)明的優(yōu)點是
(1) 對外源性治療基因泰&的調控具有嚴格的增殖特異性。本發(fā)明以重組增殖特異性啟動子
PCNATAI作為揚O啟動元件，以增殖娜模式啟動夕卜源性基因在處于高度增殖狀態(tài)的惡倒中瘤細胞和腫瘤干細胞中高效、特異性泰ii。 PCNATAI改建于PCNA基因啟動子^^77841區(qū)段，在改建重會做程中弓l入了對緑效賴有正性調節(jié)作用的&彌毒E1B啟動子的TATA M典型的^^始元件Inr序列，定性定量檢測結果顯示PCNATAI不僅保留了野翅PCNA基因啟動子的增殖特異性，而且fm^效率顯著提高，可滿足惡倒中瘤基因治療對啟動子增殖特異'隨轉錄效率的要求(詳見 例1及2)。
(2) 實現(xiàn)了腫瘤細胞特異性與增殖特異性的有 合，傲卜源性治療基因在惡倒中瘤細胞內高效特異性泰ii。在以PCNATAI為核心啟動元件的同時，PCNATAI-LoxP-stop"LoxP操縱系統(tǒng)尚以兩側裝備同向LoxP位點的轉^mh^列(stop)作為P腿下游基因,的阻遏元件，并fflii以腫瘤細胞特異鵬動子介導Cre重組酶的^ii將腫瘤細胞特異性與增殖特異性有機結合，不i!M著增加了外源性治療基因的，效率，還i鈔卜源性治療基因的皿M^格限定在惡倒中瘤細胞內，既可顯著提高惡倒中瘤基因治療的療效，又可保P錢因治療的安全性。
(3) 翻范圍廣、實用性強、艦前景廣闊?；钴S增殖^0f有惡鵬中瘤細胞賄的生物學行為特征，^K需^S當棚中瘤細胞特異腿動子啟動Cre ^iS^擇翻A3S當?shù)耐庠葱灾委熁?，即可將聘^l^^ffl于不同惡幽中瘤的基因治療，因此 有很好的普適性和實用價值，細前景廣闊。


圖1是真核細ffiS縱系統(tǒng)PCNATAI-LoxP-Stop-LoxP物理圖譜。
圖2 ^中瘤細胞特異性和增殖特異性基因^i操,統(tǒng)的工作原理。
本發(fā)明的原遼和具體理論依據(jù)
(1) PCNATAI的g^t策略野4MPCNA基因啟動子即為一嚴格的增殖特異'鵬動子，但定性和定量檢測分析顯^啟動子的啟動效^S低，尚不能完全滿M治療基因,強度的需要。核苷^)￥列分析顯示，野^MPCNA基因啟動子的結構類似^"錢因啟動子，無典型的TATA盒，但其-33—21區(qū)核苷酸序列AGGGTGAGAGCGC與腺病毒E1B基因啟動子的TATA盒AGGGTATATAATG有一定的序列同源性;itt^卜，^^g始位點周圍的核苷,列gCA+in^也與典型的Inr核苷,列PyPyA+lNTPyPy不完全相符(A+l ^^,起始位點的腺嘌呤堿基，Py標嘧啶堿基G或C， N表示任意堿基，標施者為與Inr典辦列不相符的鵬)。TATA盒和Inr是餓細胞録的關觀件，對提^^7K平和穩(wěn)定^f^始位點均有觀作用1121。因此，在啟動子鵬中我們引入了l7彌毒E1B基因啟動子的TATA盒，并利用DNA定點誘變技^l每轉錄起始位點周圍核苷^)^列麟為典型的ta核苷鵬列CCATTCC，同時在^3t31程中弓l入了限制性內切酶5^n的識別位點，以方便DPE的刪除和下齢卜源性治療基因的插入。用增強型ftfe熒光蛋白和雙熒光素酶檢測系縱行的定性、定量檢測結果顯示，PCNATAI不僅保留了野生型PCNA基因啟動子的增殖特異性，且，TJ905惡14AKM瘤細胞系中的,活性明顯高于野生型PCNA基因啟動子-778^f61區(qū)，為后者的1.6倍。同時PCNATAI與SV40增強子有很好的功能腿性，后者可在麟PCNATAI增殖特異性的同時，使PCNATAI的啟動活性提高6倍。
(2) *^作系統(tǒng)的工作原理PCNATAI-LoxP-StoivLoxP操纟M統(tǒng)由兩個基本元件構成， 一為啟動子PCNATAI，為該操縱系統(tǒng)中啟動下游基因轉錄的核心啟動元件;一為LoxP-StopLoxP序列，其來自于美國Invitogen公司的商業(yè)傾粒pBS302，其中的Stop序歹偽緑終膀列，能有效終止PCNATAI啟動的^31程，故為該操縱系統(tǒng)的^:fflji元件。故PCNATAI-LoxP-Stop-LoxP操縱系統(tǒng)的撒活需，個方面的條件(M主細胞處于高度增殖狀態(tài)，使PCNATAI啟動子具W^活性；離主細胞可反式Jii共Cre重組酶。鑒于惡蹈中瘤細MI中瘤干細胞均處于活躍增殖狀態(tài)，PCNATAI啟動子具皿高的,活性，^K需采用腫瘤細胞特異tija動子，如肝細胞癌中的AFP啟動子、結腸癌細胞中的CEA啟動子、前列I^S細胞中的PSMA啟動子、B細胞淋巴瘤細胞中的CD20啟動子、惡l4l^t細胞中的GFAP啟動子等啟動Ge重t鵬的表達，使宿主細胞可以反式麟Cre重OT，后者即可i賜蝶縣統(tǒng)中的LoxP位點，并艦同源重組機制刪除LoxP位點間 It^dl^列Stop,解除其對PCNATAI啟動的^31程的阻Ji3^呈，使該操l^m統(tǒng)下游的外^^性 抑瘤或自M因以腫瘤細胞特異'l4S增殖特異'I^S特異性泰ii (圖2)。而在處于增殖狀態(tài)的正 常細胞，由刊中瘤細胞特異鵬動子緑活性較低，不能介導Cre重組酶的有效敲，故Stop序 列對PCNATAI啟動的^ii程的阻遏作用無法解除，故PCNATAI-LoxP-Stop"LoxP操IR^統(tǒng)調節(jié) 的外源性抑瘤或自縫因不能敲；而在腫瘤起源組織的正常細胞，雖腫瘤細胞特異性啟動子可 能介導Cre重組酶的表達，但由于正常細胞多處于非增殖狀態(tài)，故PCNATAI啟動子活性較低，亦
無法^^介導下 瘤或自皿因的皿。因這種設刑妙;f有0增殖汰態(tài)和非增殖汰態(tài)的正常細
胞，均無同時撒活增殖特異鵬動子和腫瘤細胞特異鵬動子的可能性；從而《鈔卜源性治療基因僅 能在處于高，殖汰態(tài)的惡幽中瘤細胞內高效、特異性表達，并^1TM^惡幽中瘤細胞的同時使 正常細胞娜卜源性治療基因的3粥異I4^勞。 用于本發(fā)明的原始生tfMt斗
(1) PCNA基因啟動子-778^1區(qū)f^ffM^列禾,PCR擴增^7^A基因組DNA獲得；
(2) LoxP"StojvLoxP核,列由DNA合) ^直接合成，參照美國hvitogen公司的商業(yè)化 質粒pBS302中LoxP-stojvLoxP設計，具體序列見t^g1^^列表3 。
實施例l:
高度增殖特異性，細J^動子PCNArAI的獲得方法以人基因組DNA為豐鎌，禾U用聚合 ,式反應(PCR)技術擴增AW翅PCNA啟動子的-77^61區(qū)，并亞克隆至天根生化禾報有 限公司的商業(yè)化T載體pBS-T中，構誠含有野生型PCNA啟動子的-778~+61區(qū)的重纟頓粒 pBS-PCNAP。以限制性內切酶Aat n及Kpn I齢酶切pBS-PCNAP釋放出野翅PCNA啟動子 區(qū)。iffilDNA合離術合成PCNATAI啟動子的-5741區(qū)，募33—21區(qū)含樂彌毒E1B 基因啟動子的TATA盒結構，-2—5區(qū)包含典型的Inr結構，其余序列則與野 PCNA啟動子的 對鵬列相同，同時在其5'端及3'端分別引入Aatn及KpnI的識別序列。禾傭Aatn及KpnI 消化PCNATAI啟動子的-57~+61區(qū)后將其插入pBS，PCNAPAat n及Kpn I消化產物，構建成功含 高度增殖特異性真核細胞啟動子PCNATAI的重纟1M粒pBS-PCNATAI，并經DNA測序證實其序 列的正確性。
操縱系統(tǒng)PCNATAI-LoxP-stop-LoxP的獲得方法利用DNA合^gfe術合成美國Invitrogen公 司商業(yè)4tM粒pBS302中的LoxP-stopLoxP核,列，并在其5'端及3'端分別引入限制性內切 酶Spe I及Not I的識別位點。以Spe I及Not I線性化含高度增殖特異性真核細胞啟動子PCNATAI的重鄉(xiāng)!M粒pBS-PCNATAI，并將Spel及Notl消化的LoxP-stop-LoxP核M^列插A^性ffcM粒中， 構^^含PCNATAI-LoxP-stop"LoxP的重SM粒pBS-PCNATAI-loxP-stop4oxP，并經測序證實其序 列的正確性。
實施例3:
在不同體外,細JjaSm皿中定性檢測PCNATAI的g效率
以增強的雜熒光蛋白EGFP基因為報導基因，在不同體外培養(yǎng)細m細鵬中對PCNATAI、 野^MPCNA啟動子的-300^f61區(qū)(P300)、 ~600~+61區(qū)(P600)及PCNATAI g^t原型PCNA 啟動子-788~+61區(qū)的,效率進行定'慰見察。分別將PCNA啟動子-300~+61區(qū)、>600~+61區(qū)、 -788^+61區(qū)及PCNATAI啟動子插入質粒載體pEGFP-l (美國Clontech公司)，構，^M粒 p300^EGFP、 p600-EGFP、 pPCNA-EGFP及pPCNATAI-EGFP。用四個重,粒分別轉染體外原代 培養(yǎng)大鼠跡^M細胞、Affi腎7乂生化HEK293細胞系、惡't^M瘤細ISmTJ905及U251，繼續(xù) i:^72小時后在熒光倒置顯微鏡下觀察EGFP的^&瞎況。結果顯示PCNA啟動子300^1區(qū) 及-600~+61區(qū)在各細胞系中,效WS低。在不同體外培養(yǎng)細m細胞系中PCNATAI啟動子 及PCNA啟動子-788^f61區(qū)啟動報導基因EGFP表達的效率并不相同，在增殖不活躍的體外原代 培養(yǎng)大鼠,皿細胞中PCNATAI及PCNA啟動子-788^61區(qū)對EGFP的啟動效^J^低，而 在增歹餅?；钴S的惡til^瘤細m^TJ905及U251中，PCNATAI及PCNA啟動子-78^+61區(qū)對 EGFP的啟動效率,高，而在增殖活性較活躍的永生^lffl^m HEK293中，PCNATAI及PCNA 啟動子-788~+61區(qū)對EGFP的啟動效率低于其在U251及TJ905細Bfi^、中對EGFP的啟動效率， 但高于^S體外i^大鼠原ftM^，細胞中對EGFP的啟動效率,證實PCNATAI啟動子保留了 PCNA啟動子-788^1區(qū)轉錄啟動的增殖特異性(部分實驗結果見附件圖1)。
實施例4:
在不同體外,細J3^B皿中定量檢測PCNATAI的^^效率
利用美國Promega公司開發(fā)的熒光素謝艮導系統(tǒng)在不同體外培養(yǎng)細胞及細胞系中對PCNATAI 及其,原型PCNA啟動子-788^1區(qū)檢測的,活fKft行定量檢測。分另iJ將PCNATAI及PCNA 啟動子-788^f61區(qū)插入質粒載體pGL3-Basic及pGL3-enhancer ，構建成重組質粒 pGL3-PCNATAI-Basic、 pGL3-PCNA-Basic、 pGL3- PCNATAI-enhancer及pGL3- PCNA"enhancer。 將JdM鄉(xiāng)I^粒分別轉染體外原代培養(yǎng)大鼠星形,細胞、人胚腎永生化HEK293細鵬及惡性 膠 細皿U251，并以雙熒光素酶檢測試劑^量檢測PCNATAI及PCNA啟動子-78"61區(qū) 的^活'I4S SV40增強子對J^兩啟動子增殖特異性的影響和,活性的增強作用。結果顯示: 在U251惡14ISM瘤細胞中PCNATAI ,導基因的啟動效率為PCNA啟動子-78841區(qū)的1.6倍，
9際PCNATAI的改3g31程有 娥高了啟動子娜導基因表達的啟動效率；在U251惡性膠質瘤細 胞中PCNATAI及PCNA啟動子-788~+61區(qū)M導基因的啟動效率分別是，HEK293細胞中對 報導基因啟動效率的2.85倍和2.17倍，而在體外培養(yǎng)大鼠跡臓細胞中，PCNATAI及PCNA 啟動子-788^1區(qū)的,效^J^^低于MI^^瘤細胞系U251及HEK293細胞中的皿效率， 提g^t后，PCNATAI啟動子不僅保留了 PCNA啟動子-788^1區(qū)的增殖特異性，且其增殖 特異性有了進一步提高。財卜，在SV40增強子的作用下，^5i侖PCNA啟動子-788^f61區(qū)還是 PCNATAI， ^^效,U251及HEK293細胞中均大幅提高，但在體外培養(yǎng)大鼠, 細胞 中無明顯變化，^ SV40可與PCNATAI啟動子有效協(xié)同，既提高了其在增殖細胞中的,效率， 又可鵬其增殖特異性(部分實麟果見附件圖1)。
實施例5:
利用PCNATAI-LoxP-StopL(wP^^統(tǒng)介，導基因EGFP在惡m^i細胞中的特異性
駄
將PCNATAI-LoxP-Stop"LoxP操l^^t入EGFP ^f亥^iiM粒pEGFP-l ，構^gfi組, ^M粒pPCNATAI-LoxP-Sto{>LoxP-EGFP。將GFAP啟動子與Cre重會lH^r^i碼區(qū)串聯(lián)后插 AW除EGFP編碼區(qū)的^t亥^iiM粒pEGFP-l ，構建成由GFAP介導Cre重組^ii的^t亥, 質粒pGFAP-Cre。利用pPCNATAI-LoxP-Stop"LoxP-EGFP轉染HEK293、 TJ905及U87MG細lfi^ 和體外原代培養(yǎng)大鼠跡膠質細胞，轉染后72小時在熒光倒iM微鏡下觀察無鄉(xiāng)絶熒光蛋白鋭。 利用pPCNATAI-LoxP-Stop-LoxP-EGFP和pGFAP-Cre g^轉^h^三個細胞系和體外i歸大鼠星 形驗細胞，轉染后72小時發(fā)現(xiàn)在U87MG及TJ905惡| ^瘤細鵬中有EGFP較高7R平的表 達，而在HEK293細l^及體外原代i^^大鼠M^^M細胞中EGFP無駄。證實利用^M細胞 及惡'I4I^瘤細胞特異'性啟動子GFAP啟動Cre重組酶的泰邸卩可在惡'SI^質瘤細胞中實JJ^卜源 性報導基因的細胞和增殖特異性皿(部分實驗結果見附件圖2)。
實施例6:
在不同體外J^細J3a^皿中定量檢測PCNATAI-LoxP-stop-LoxP的,效率 禾,熒光素llffi導系統(tǒng)在不同體外培養(yǎng)細lM細皿中對PCNATAI-LoxP-stop-LoxP的, 效率進行定量檢測。將PCNATAI-LoxP-stop"LoxP操縱系統(tǒng)分別插入質粒載體pGL3-Basic及 pGL3《nhancer，構建成重組質粒pGL3-PCNATAI-LoxP-stop"LoxP-Basic及pGL3-PCNATAI-LoxP-stoivLoxP~enhancer。將上述重纟IM粒分別^^蟲或與重組GFAP《re質粒l^轉染體外原代培 養(yǎng)大鼠娜l^^細胞、AK腎永生化HEK293細鵬及惡'(4^質瘤細Mf、U251，并以雙熒光素酶 檢測J試劑盒定量檢測PCNATAI-LoxP-stop"LoxP鄉(xiāng)系^ 導基因的緑效率及SV40增強子對,的增強作用。結果顯示無論有無SV40增強子的增強作用，在H^K293細M體外i^大 鼠跡^M細胞中，PCNATAI-LoxP-stop-LoxP操 統(tǒng)的録效糊極低(僅有漏出性就)。 在U251惡'im^瘤細胞系中，在無GFAP-Cre以腫瘤細胞特異'販式提供的Cre重組酶的作用下， PCNArAI-LoxP-stop~LoxP操,^1 導基因的,效 極低，^fi，體外培養(yǎng)大鼠，膠 質細M HEK293細胞系中的轉^7K平；而當GFAP-Cre以腫瘤細胞特異性M反式,Cre重 組酶時，PCNATAI-LoxP-stop-LoxPmiR^^U251亞'&^M瘤細I&^中的,效率明顯提高至 無Crc重組酶時的約4,5倍，同時，SV40增強子可進一步提^^7jC平至無Cre重組酶時的約 30倍，提示PCNATAI-LoxP-stop"LoxP操 ^ 導基因的緑具有鵬的增殖和腫瘤細艦 重特異性，而SV40增強子可在不被PCNATAI-LoxP-stopioxP ^^^異性的11^下進 一步提高^$ 效率(部分實麟果見附件圖2)。
以上實驗結果充分說明該套基因皿操a^統(tǒng)B&至隨粗中瘤基因治療所要求的啟動效率 高、特異性安全斷的要求。
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<160> 4
<170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 839
<212> DNA
<213> Al/P歹!j (Artificial Sequence) <220>
<223>鵬自人增歹飾ffit亥SJ^PCNA啟軒-778至+61區(qū)，用麟毒E1B TATA盒 蹄^ff^!jAGGGTATATAATG取^J^有的—29—21位^^,列，用HM緑 起始元件lnr豐^W^lJ CCATTCC取概有的-2~+5傲雜,列。
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(839) <220>
<221> CAAT一signal
<222> (634) "(638) <220>
<221> GC一signal
<222> (651>..(656) <220>
<221> TATA—signal
<222> (752)..(757)
<400> 1
3ttgcct33gtgctcs3sggtgtttgtsgtg3g3ttgat333tt3tgtt360
t3t3C3tgtgstgct3tgtttt333gaggt3ctg3tstgs3cgtggc3ts120
ssattsaatgt3Cttt3tt3sgt3cttttccsagtgtttacgg33tgsgtgcstttttg3180
gtgtsttcg33Ctttt33333gCttt3t3C240
tgagtgattataagagctggcgggggaatgttaagaggattaagtttaac300
agaacaattacctctttstcttgtgacacct3cg3gcgc3tc3sttctgt360
taa3gtgc3tstttgcsgc3gctgtactctcttcsggctgC33ggsggcttttcctcccg420
gtaggcttgstttgcatttcsctttcactttcgtggctgg333CtttCt3cccscgt3gt480gggsggctg3ggagccaccst333gctggggcttgscgsgccgggaccgggscccg3tct540
CC3C3t3tgCccggscttgttctgcggccgggttcaggagggggsgscct600
gcgcgscgctgccccgccctgcgcccgcttcctccs3tgt3tgctctsgggggcgggcct660
cgcggggsgcttggccctsasgtcttccccgcs3ggccgtgggctgg3c3720
gcgtggtgscgtcgcsscgcggcgcsgggt3t3ts3tggcgcttgcggscgcggcgccst780
tccgcggttgcsggcgtsgc3g3gtggtcgttgtctttctsggtctcagccggtcgtcg839
<210> 2
<211> 1323
<212> DNA
<213> AIJWU (Artificial Sequence) <220>
<223>離自人增殖細胞+^If、 PCNA啟動子-778至+61區(qū)，用B^i毒E1BTATA
,列AGGGTATATAATG取^i^有的-2 9—21位蹄,列，用典型^^i臺元 件lnr TOlim列CCATTCC取ft!^有的-2 +5位蹄^ff列。
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(1323) <220>
<221> CAAT—signal
<222> (1118)..(1122) <220>
<221> GC—signal
<222> (1135)..(1140) <220>
<221> TATA—signal
<222> (1236)--(1241)
<■> 2
tgctgscc333g33gtggtg60
tgtccstcctgt33C33ttg3333tttCtggctgggcgtggtggctc3cg120
cctgta3tcccsgcsctttgagaggccgaggcsggtggstcacctcaggtC3ggtgttcs180
sgacc3gcctggccaacatggtg333ccccgtctctsct3240
agccgggggtggtggt3ggcscctgtaatcCC3g3t3CtCgggaggctga300
ggcaggsgsctc3cttgsscctgggsggcggsggttgcaatg3gctg3gatcgcgccsct360gtsctccsgcctggatg3C3gagcaggsct420
stgtgtscgctctttgsctc3gctgtstt3cttcaaggag ttgatatcsc柳
C3333ttgCCt33gtgctc33sggtgtttgt3gtt333C3 3csggsg3tt g3t333tt3t540
gtt3tatscatgtg3tgct3tgttttaaagaggtactgatatgataasag 3tgtacgtgg600
3stgt3ctttattaagtacttttcc33gtgtttacggaat gagtgcattt660
tcgaactttttasaagcttt stacaatgaa720
cgsttgsgtgctggcggggg33tgttssg3ggstgstsgg gsgct3sgtt780
attacctctttatcttgtgacacctacgag cgcatcaatt ctgtaattga,
gcatstttgcsgcsgctgt3ctctcttcsg gctgc33ggs ggcttttcct900
cccggtaggcttgatttgcatttcsctttcactttcgtggctggaaactt tctacccacg960
tsgtgggsggctgaggsgcctggggcttgscgagccggga ccgggacccg1020
atctccscatatgcccggacttgttctgcggccgggttcaggsgtcsasg aggcggggsg1080
3cctgcgcgscgctgccccgccctgcgcccgcttcctccsatgtatgctc tagggggcgg1140
gcctcgcggggagcstggscscgsttggccct33sgtcttccccgcaagg ccgtgggctg1200
gscsgcgtggtgscgtcgcs3cgcggcgc3gggtatataa tggcgcttgc ggacgcggcg1260
ccsttccgcggttgcsggcgtagcagagtggtcgttgtctttctsggtct csgccggtcg1320
tcg1323
<210> 3
<211> 2280
<212> DNA
<213> AX^歹lJ (Artificial Sequence) <220>
<223>由鵬自人增翻胞核繊PCNA啟動子-778至+61區(qū)的PCNATA工啟動子、來自 pi nfM體的Cre !^的兩^tiR&j位點LoxP及兩個iRSU位點間的^^ih^列 Stop纟誠。
<220>
<221> promoteir
<222> (1)..(839)
<223>麟自人增殖細l&t亥K^ PCNA啟動子的增殖特異'腿動子PCNATAI。 <220>
<221> CAAT—signal
<222> (634)..(638) <220><221> GC—signal
<222> (651)..(656) <220>
<221> TATA一signal
<222> (752)..(757) <220>
<221> misc一feature
<222> (858)..(891)
<223> Pl離體的I繼石撲異構酶Cre ^iil的特異鵬U亂 <220>
<221> misc—feature
<222> (892) "(2240)
<223〉 ff^游列。 <220>
<221> polyA—signal
<222> (1056).， (1061) <220>
<221> misc—feature
<222> (2241)..(2274)
<223> Pl Ut^體的I型拓撲異構酶Cre ^BII的特異性i頓股點。
<400> 3
sttgcct33gtgctcs33ggtgtttgtsgtgsg3ttg3ts33tt3tgtts60
tatac3tgtgstgct3tgtttt333g3ggt3ctg3t3tgs3cgtggc3t3120
七3Cttt3tt3agtscttttcC33gtgtttscggs3tgsgtgc3tttttg3180
gtgtsttcga3Ctttt333333gCttt333sgctttst3C240
tgaigtg3ttataagagctggcgggggsstgtt3sgsggstgstsgggsgctssgtttsac300
3gS3C33tt3cctcttt3tcttgtgscscctscgsgcgcatcaattctgt360
tasagtgcatatttgcagc3gctgtsctctcttcsggctgc33ggaggcttttcctcccg420
gtsggcttgatttgcstttc3CtttC3Ctttcgtggctgg333CtttCt3ccc3cgt3gt480
gggsggctgsggsgccaccst333gctggggcttgaicgsgccgggsccggg3cccg3tct540
CC3C3t3tgCccggacttgttctgcggccgggttcsggsgtcs3sg3ggcggggsgacct600
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cgcgggg3gc3tggsc3cg3ttggccctss3gtcttccccgcssggccgtgggctgg3c3720
gcgtggtgscgtcgc33cgcggcgcsgggtgcttgcggacgcggcgccst780tccgcggttgcaggcgtagc3gagtggtcgttgtctttctsggtctcagccggtcgtcgg840
gatccsctsgtccgcggst33cttcgt3t33tgtstgct3ttsggtccct900
cgacctgcagcccs3gctt3ctt3cc3tgtt3c3ttg3tg960
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3tgctsttgctttatttgta3CC3tt3t331080
gc3ttcsttttstgtttcsggttcsg,gsggtgtgggsggttttttss1140
acctct3cas3tgtggtstggctgattatgstctctsgtc3sggc3ct3t1200
ttCCtt3tt33CCCCttt3CC3C33tttttgsgcstsgtt1260
3tt33t3gC3g3C3CtC七3tgcctgtgtgg1320
sctgtt3tgcsggtt3C3gs3t3tttttCC3t33ttttcttgtstsgcsg1380
tgcagctttttcctttgtggtgtsastsgc3g3gttctatt3Ct333C3C1440
agcatgactcgc33ttctg3sggaaagtccttggggtcttCt3CCtttCt1500
cttcttttttgg3gg3gt3g33tgttg3g3gtcagc3gt3gcctc3tcstcactagstgg1560
cstttcttctggttttcctcttCC3CC3Ctgctcccsttc1620
3tcsgttcc3taggttgg33gttt33C3C31680
tt3t3C3Cttt3ttt3CCttsg3gcttt33stctctgtaggtsgtttgtc1740
C33tt3tgtCsgt33ggttccttcsc33sgstccctcgsg1800
ggaggaacgggttgtggtgataggtggc3agtggtattcc1860
3tttC3tatt3tggctg33C3gtgC3333t1920
ttaagcatcacgagsatggttstgttcctcctcacttaagaggaaaacca1980
scggcggct3cs3cggtggc2040
cgtggcggtggcsgcttcttcgtcgtggtggtt3cggc33cggtggtttc2100
ttcggtggaaacaacggtggcsgcsgstctaacggccgttctggtggtagatggstcgst2160
ggc333cstgtcccsgctcc3aggccg3g3tcgcc3tstttggtgtcccc2220
gaggstccgg33CCCtt33t3tsscttcgt3taatgtstgct3t3cgssgtt3t3ccggt2280
<210> 4 <211> 2758 <212> DNA
<213> AU 歹!J (Artificial Sequence) <220>
<223>由離自^rK:人增歹飾胞核KJi PCNA啟動子的PCNATAI啟動子、來自Pl麟 體的Cre重IMI的兩個i咽lj位點LoxP及兩^HRSlJ位點間的^^lhff'列Stop 艦。<220><221> promoter<222> (1)..(1321)<220><221> CAAT一signal<222> (1118).. (1122) <220><221> GC—signal<222> (1135).. (1140) <220><221> TATA—signal<222> (1236)..(1241) <220><221> misc一feature<222> (1342). . (1375)<223> Pl ISK體的I型拓撲異構酶Cre ^ffil的特異性i，股點。 <220><221> misc—feature<222> (1376).. (2724)<223> $^^游列。 <220><221> polyA—signal <222> (1540).. (1545) <220><221> misc—feature <222> (2725).. (2758)<223> Pl Bta體的I型拓撲異構酶Cre Sl鵬附寺異性i別啦點。<400> 4tgctg3CC333g33gtggtg60tgtccstcct gtsscwttg3333tttCtggctgggcgtggtggctcscg120cctgtsatcccsgcactttgsgsggccgsggcsggtggstc3cctc3ggtC3ggtgttc3180sgsccsgcctggccsscstggtgss3ccccgtctct3cts240sgccgggggtggtggtsggc3cctgtaatcCC3g3t3CtCgggsggctgs300ggcaggagactC3Cttg33Cgaggttgcaatgsgctgsgstcgcgccsct360g七3Ctcc3gcctggstg3C3g3gc3ggsctCC3tCtC333420atgtgtacgctctttgactcsgctgt3ttscttc33gg3gttgst3tc3c480t33gtgctcsaaggtgtttgt3gtt333C33C3gg3gstt540tgtgstgct3tgttttaaag3ggtsctgstatgataaaagatgtacgtgg600aatgtactttattsagtacttttccssgtgtttacggaatgagtgcattt660tcgaactttttaasagcttt720cgattgagtgctggcg,gaatgttaagaggatgatagggsgct33gtt7803ttscctctttatcttgtgacscctacgagcgcatcaattctgtaattga840gcststttgc3gcsgctgt3ctctcttcsggctgc33gg3ggcttttcct900cccggtsggcttgstttgcstttcsctttcsctttcgtggctgg333Ctttct3ccc3cg960tagtgggaggctgsggsgcc3CC3t333gCtggggcttgscgagccgggaccgggscccg1020atCtCC3C3tatgcccggscttgttctgcggccgggttcaggagtcaaagaggcggggsg1080acctgcgcgscgctgccccgccctgcgcccgcttcctcc3atgtatgctctagggggcgg1140gcctcgcggggsgc3tgg3cacgsttggccct33sgtcttccccgcaaggccgtgggctg1200gscagcgtggtgscgtcgc33cgcggcgcstggcgcttgcggscgcggcg1260ccattccgcggttgcaggcgt3gc3g3gtggtcgttgtctttctsggtctcsgccggtcg1320tcgggatcc3ctagtccgcggst33Cttcgt3tsatgt3tgctst3cgs3gttsttsggt1380ccctcgacctgc3gccc33gCtt3Ctt3CC3tgtcsgstccagacatgat3agst3C3tt1440gatgsgtttgg3C333CC3C33ctsgsatgsstgctttatttgtg333tt1500tgtgstgct3ttgctttstttgt33CC3tt3t33gctgc33t333C33gt1560asttgc3ttcattttatgtttcaggttcagggggaggtgtgggaggttttttaat5Lgc33g1620taaaacctcttstggctg3ttstgaitctctagtcaaggca1680aat3ttcctt3tt33CCCCtggt3C3C33tttttg3gcst1740agttsttaat3gcsgsc3ctct3tgcctgtgtggsgtssgatgtt3tg3t1800tataactgtt3tgcctactt3t33sggttscsgaststttttccataattttcttgtst31860gcagtgcsgctttttcctttgtggtgta3a3gc33g3gttCt3tt3Ct331920cttsgcasttgtccttggggtcttctscct1980ttctcttcttttttggsggsgtsg33tgttgsgsgtcsgc3gt3gcctc3tcatcactag2040attggc3tttcttctgagc3333caggttttCCtC3tt333ggcsttccaccaLCtgctccc2100attc3tc3gttccstaggtt2160C3C3ttat3Cttt3t3ttt3ccttsgsgcttt333tCtctgtaggtagtt2220tgtcc33ttstgtC3C3CC3gttccttc3C333g3tCCCt2280gttsgttgtggtgataggtggc33gtggts2340ttccgt3sg3aagcatttcat3ttstggctg33ctg3gcg240019atcaacgacatggttatgttcctcctcsct24603C3tg3gC33Ct3C33t33Cascaacggcggctacsacgg2520tggccgtggcggtggcagcttctttsgc33C33ccgtcgtggtggttscggcascggtgg2580tttcttcggtgtggc3gcsgatctaacggccgttctggtggtagatggat2640cg3tggc333catgtcccsgcgsssaggccgsgstcgccststttggtgt2700ccccgsggstccggsacccttcgtat33tgt3tgctat3cgaagttat2758
權利要求
1、一種高度增殖特異性真核細胞啟動子PCNATAI，其核苷酸序列如序列表1或序列表2所示。
2、 一,利要求1所述的高度增殖特異性皿細胞啟動子PCNATAI的獲得方法，，征在于所述的啟動子PCNATAI是以AK^^增殖細胞核抗原PCNA啟動子區(qū)^^778^61位*核苷,列為原型，并對其進《亍下列兩個片段的g(^得到第一、用腺病毒E1B TATA盒核苷,列AGGGTATATAATG取代PCNA啟動子區(qū)原有的-29 21位核苷,列；第二、用典型$^^始元件Inr核苷 列CCAITCC取代PCNA啟動子區(qū)原有的-2一5位核苷^^列，同時在其下游形成一個限制性內切酶&cn的識別位點。
3、 一種含有權利要求1所述的啟動子PCNATAI，并由Cre重組酶^:活、以高度增殖特異性模式調控下、 瘤或自皿因皿的,細胞基因操 統(tǒng)PCNATAI-LoxP-stop-LoxP， ^t亥苷酸序列如序列表3辦列表4戶標。
4、 一,利要求3所述的真核細胞基因操縱系統(tǒng)PCNATAI-LoxP-stopioxP的獲得方法，其特征在預方雜括第一、以權利要求l 0M的啟動子PCNATAI作為i^M^^a動外源性治療基因,的核心啟動元件；第二、在啟動子PCNATAI下游端插入pBS302質粒的"LoxP-StoivLoxP"序列作為該操縱系統(tǒng)的,KI元件，其中Stop為,終ih^列，LoxP為Cre重組酶的特異性識別序列。
5、 一種權利要求3戶/M的^t亥細胞基因操iim統(tǒng)PCNArAI-LoxP-sto!vLoxP自于操l^卜源性抑瘤或自絲因在惡倒中瘤細胞中的高效特異性敏，即在惡t^中瘤細胞中ffiil腫瘤細胞特異性^IM莫式反^^ crc重,，使;tffla同源重組機制刪除Kt寺異性識別位點之間的^c終膀列Stop，從而解除Stop序列對PCNATAI啟動的f^l程的阻遏作用，最終使下微卜源性抑瘤或自,因在PCNATAI的啟動下在惡翻中瘤細胞中以腫瘤細胞特異14S增殖特異I4^S特異性模式高效敏。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術領域，公開了一種高度增殖特異性重組真核細胞啟動子PCNATAI；一種以PCNATAI為核心轉錄啟動元件、以LoxP-stop-LoxP為轉錄阻遏元件的真核細胞操縱系統(tǒng)PCNATAI-LoxP-stop-LoxP；一套通過以腫瘤細胞特異性依賴模式反式提供的Cre重組酶解除LoxP-stop-LoxP對PCNATAI啟動的轉錄過程的阻遏效應，使下游外源性抑瘤基因或自殺基因在惡性腫瘤細胞中以腫瘤細胞特異性及增殖特異性雙重特異性模式高效、特異性表達的整體方案。該方案既可顯著提高惡性腫瘤基因治療過程中抑瘤或自殺基因在惡性腫瘤細胞中的表達效率，又可確?；蛑委煹陌踩?。
文檔編號C12N15/11GK101671666SQ20091007057
公開日2010年3月17日 申請日期2009年9月25日 優(yōu)先權日2009年9月25日
發(fā)明者于士柱, 孫翠云, 安同嶺, 虔 王 申請人:天津醫(yī)科大學總醫(yī)院