人nlk基因和egfr基因治療腫瘤的用途及其相關(guān)藥物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體公開了單獨(dú)的人NLK基因；以及人NLK基因與人EGFR基因作為協(xié)同施藥靶標(biāo)，在制備或篩選腫瘤治療藥物中的用途。本發(fā)明還進(jìn)一步構(gòu)建了NLK基因小干擾RNA、NLK基因干擾慢病毒載體、NLK基因干擾慢病毒，并公開了他們?cè)谂cEGFR基因協(xié)同治療腫瘤中的用途。本發(fā)明提供的siRNA或者包含該siRNA序列的慢病毒載體、慢病毒能夠特異性抑制人NLK基因和/或人EGFR基因的表達(dá)，尤其是慢病毒，本發(fā)明的NLK基因干擾慢病毒能單獨(dú)、或者與EGFR基因干擾慢病毒協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞的生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義。
【專利說明】人NLK基因和EGFR基因治療腫瘤的用途及其相關(guān)藥物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地涉及單獨(dú)的人NLK基因；以及人NLK基因和人 EGFR基因協(xié)同治療腫瘤的用途及其相關(guān)藥物。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前腫瘤的基因治療已經(jīng)取得了蓬勃快速的發(fā)展，但是迄今為止，仍然存在很多 需要解決的問題。目前用于腫瘤基因治療的基因太少，能抑制腫瘤生長的基因?yàn)閿?shù)不多，急 需提供更多可利用的基因。另外，由于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等過程是一個(gè)多基因參與、涉 及多條信號(hào)通路的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，因此單個(gè)基因治療或單一治療方法往往療效有限。因此， 未來基因治療發(fā)展的重點(diǎn)將在于挖掘并鑒定在臨床上有重要價(jià)值的基因，探索多個(gè)具有不 同抗腫瘤作用機(jī)理的基因聯(lián)合治療以及將多基因靶向藥物聯(lián)合治療等。
[0003] Nemo樣激酶（Nemo-like kinase, NLK)定位于細(xì)胞核，是一種屬于脯氨酸介導(dǎo) 的蛋白激酶超家族中保守的絲氨酸-蘇氨酸激酶，最初認(rèn)為與果蠅的眼細(xì)胞的極化及脊 椎動(dòng)物多種發(fā)育過程有關(guān)（Choi KW, Benzer S. Rotation of photoreceptor clusters in the developing Drosophila eye requires the Nemo gene. Cell. 1994;78:125-36. Verheyen EMjMirkovic I，MacLean SJj Langmann Cj Andrews BCj MacKinnon C. The tissue polarity gene Nemo carries out multiple roles in patterning during Drosophila development. Mech Dev. 2001; 101:119-32.)。近年來的研究認(rèn)為NLK可調(diào)節(jié)、磷酸化轉(zhuǎn)錄因 子，并通過多種信號(hào)途徑參與細(xì)胞的凋亡過程（Brott BK, Pinsky BA, Erikson RLNlk is a murine protein kinase related to Erk/MAP kinases and localized in the nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998; 95:963-8. Mirkovic IjCharish KjGorski SMjMcKnight KjVerheyen EM. Drosophila Nemo is an essential gene involved in the regulation of programmed cell death. Mech Dev.2002;119:9-20. )〇
[0004] 關(guān)于NLK在腫瘤中的研究已有在結(jié)直腸癌、前列腺癌和肝癌中的報(bào)道。NLK被 認(rèn)為是結(jié)腸癌fct/β-catenin信號(hào)通路的抑癌基因。野生型的NLK在結(jié)直腸癌中被誘 導(dǎo)表達(dá)，通過磷酸化TCF/LEF抑制細(xì)胞生長，促進(jìn)p53非依賴的細(xì)胞凋亡，但不影響細(xì)胞 周期（Yasuda J, Tsuchiya A, Yamada T, Sakamoto M, Sekiya T, Hirohashi S. Nemo-like kinase induces apoptosis in DLD-1human colon cancer cells. Biochem Biophys Res Commun2003;308:227-33.)。在前列腺癌中，NKL負(fù)調(diào)節(jié)雄性激素受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。NLK 過表達(dá)可顯著誘導(dǎo)雄性激素受體陽性表達(dá)的前列腺癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步的研究發(fā) 現(xiàn)，NLK能夠通過與雄激素受體形成復(fù)合物的方式抑制雄激素受體對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，且 在轉(zhuǎn)錄水平抑制雄激素受體mRNA的表達(dá)（Emami KH，Brown LG，Pitts TE，Sun X，Vessella RL, Corey E. Nemo-like kinase induces apoptosis and inhibits androgen receptor signaling in prostate cancer cells.Prostate.2009;69:1481-92·)。而在人肝癌細(xì) 胞系中，敲除NLK的表達(dá)可以抑制細(xì)胞生長，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，Gl-S期細(xì)胞增加，細(xì)胞周期相關(guān)蛋 白cyclin D1、⑶K2的表達(dá)也明顯降低，說明NLK在肝癌形成中可能具有通過作用cyclin D1、CDK2 而發(fā)揮促有絲分裂的作用（Jung KH，Kim JK，Noh JH，Eun JW，Bae HJ，Xie HJ，Ahn YM, Park WS,Lee JY, Nam Sff. Targeted disruption of Nemo-like kinase inhibits tumor cell growth by simultaneous suppression of cyclin Dland CDK2in human hepatocellular carcinoma. J Cell Biochem. 2010;110:687-96·)。綜上，NLK 在不同腫瘤 的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。
[0005] 表皮生長因子受體（epidermalgrowth factor receptor, EGFR) EGFR 是一種跨膜 蛋白質(zhì)，屬于ErbB受體家族成員，其配體（EGF、TGF-a等）與EGFR胞外段結(jié)合使之二聚 化，由此導(dǎo)致胞內(nèi)段酪氨酸激酶活化以及一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，血管 生成，轉(zhuǎn)移并抑制細(xì)胞凋亡(梁后杰，鄒嵐.EGFR靶向藥物治療晚期結(jié)直腸癌最新進(jìn)展.中 國處方藥2009; 84:58-61.)，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。大量研究發(fā)現(xiàn)EGFR基因在多種腫瘤組 織中過表達(dá)或異常活化，從而使腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。EGFR已成為經(jīng)臨床 驗(yàn)證的多種類型腫瘤的治療祀點(diǎn)（Ciardiello F, Tortora G. EGFR antagonists in cancer treatment. N Engl J Med2008;358:1160-1174. )〇
[0006] RNAi是利用雙鏈RNA介導(dǎo)的序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，已成為研究 基因功能的一種新興的有效手段，并有望成為腫瘤等疾病基因治療的工具（Izquierdo M.Short interfering RNAs as a tool for cancer gene therapy.Cancer Gene Ther. 2005; 12 (3) :217-27.)。慢病毒（Ientivirus)載體是高效的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)工具，主要用于 感染對(duì)常規(guī)方法轉(zhuǎn)染效率較低的細(xì)胞，如原代細(xì)胞等。慢病毒顆?？赏瑫r(shí)感染增殖和非增 殖的細(xì)胞，且感染比較穩(wěn)定、持久。運(yùn)用慢病毒載體，可實(shí)現(xiàn)特定基因的高表達(dá)，也可以表 達(dá)發(fā)夾結(jié)構(gòu) RNA (short hairpin RNA，shRNA)以 RNA 干擾（RNA interference，RNAi)方式 下調(diào)某基因的表達(dá)。本發(fā)明擬采用慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)研究NLK基因在與EGFR基因協(xié) 同抑制腫瘤細(xì)胞增殖中的功能，為惡性腫瘤的非手術(shù)臨床治療提供理論依據(jù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于公開了 NLK基因作為癌癥治療的靶標(biāo)，治療腫瘤的用途及其相 關(guān)藥物；以及將NLK基因和EGFR基因共同作為癌癥治療的靶標(biāo)，通過同時(shí)沉默NLK基因和 EGFR基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)協(xié)同治療腫瘤的用途，及其腫瘤治療藥物。
[0008] 本發(fā)明以RNA干擾為手段，研究了單獨(dú)的NLK基因在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用，以 及，NLK基因與EGFR基因在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的協(xié)同作用，公開了一種抑制或降低腫瘤細(xì) 胞生長、增殖、分化和/或存活的方法，該方法包括：向腫瘤細(xì)胞施用一種能夠特異性抑制 NLK基因和/或EGFR基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯，或能夠特異性抑制NLK蛋白和/或EGFR蛋白表達(dá) 的活性的物質(zhì)，以此來抑制腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、分化或存活。
[0009] 本發(fā)明第一方面，公開了分離的人NLK基因在制備或篩選腫瘤治療藥物，或者在 制備腫瘤診斷藥物中的用途。
[0010] 所述的腫瘤可以為其腫瘤細(xì)胞的增殖與人NLK基因的表達(dá)相關(guān)的任意一種腫瘤； 更進(jìn)一步的，為一種惡性腫瘤，例如選自：結(jié)腸癌。
[0011] 本發(fā)明中，所述人NLK基因作為針對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于制備或篩選腫瘤 治療藥物，或者制備腫瘤診斷藥物。進(jìn)一步的，所述針對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用祀標(biāo)為RNA干擾作 用靶標(biāo)。
[0012] 所述將分離的人NLK基因用于制備或篩選腫瘤治療藥物包括兩方面的內(nèi)容：其 一，將人NLK基因作為藥物或制劑針對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于制備腫瘤治療藥物；其 二，將人NLK基因作為藥物或制劑針對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于篩選腫瘤治療藥物。
[0013] 所述將NLK基因作為藥物或制劑針對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于制備腫瘤治療 藥物具體是指：將NLK基因作為RNA干擾作用的靶標(biāo)，來研制針對(duì)腫瘤細(xì)胞的藥物或制劑， 從而提高或降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)NLK基因的表達(dá)水平。
[0014] 所述將NLK基因作為藥物或制劑針對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于篩選腫瘤治療 藥物具體是指：將NLK基因作為作用對(duì)象，對(duì)藥物或制劑進(jìn)行篩選，以找到可以抑制或促進(jìn) 人NLK基因表達(dá)的藥物作為腫瘤治療備選藥物。如本發(fā)明所述的NLK基因小分子干擾RNA (SiRNA)即是以人NLK基因?yàn)樽饔脤?duì)象篩選獲得的，可用作具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用的 藥物。除此之外，諸如抗體藥物，小分子藥物等也可將NLK基因及其蛋白作為作用對(duì)象。
[0015] 所述將NLK基因用于制備腫瘤診斷藥物，是指將NLK基因表達(dá)產(chǎn)物作為一項(xiàng)腫瘤 診斷指標(biāo)應(yīng)用于腫瘤診斷藥物的制備。
[0016] 所述腫瘤治療藥物為能夠特異性抑制NLK基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，或能夠特異性抑制 NLK蛋白的表達(dá)或活性的分子，從而降低腫瘤細(xì)胞中NLK基因的表達(dá)水平，達(dá)到抑制腫瘤細(xì) 胞的增殖、生長、分化和/或存活的目的。
[0017] 本發(fā)明第一方面，還公開了分離的人NLK基因和人EGFR基因在制備或篩選腫瘤治 療藥物，或者在制備腫瘤診斷藥物中的用途。
[0018] 所述的腫瘤可以為其腫瘤細(xì)胞的增殖與人NLK基因和人EGFR基因的表達(dá)相關(guān)的 任一種腫瘤；更進(jìn)一步的，為一種惡性腫瘤，例如選自：肺癌或結(jié)腸癌。
[0019] 本發(fā)明中，所述人NLK基因和人EGFR基因作為針對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于制 備或篩選腫瘤治療藥物，或者制備腫瘤診斷藥物。進(jìn)一步的，所述針對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用祀標(biāo) 為RNA干擾作用靶標(biāo)。
[0020] 所述將分離的人NLK基因和人EGFR基因用于制備或篩選腫瘤治療藥物包括兩方 面的內(nèi)容：其一，將人NLK基因和人EGFR基因作為藥物或制劑針對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng) 用于制備腫瘤治療藥物；其二，將人NLK基因和人EGFR基因作為藥物或制劑針對(duì)腫瘤細(xì)胞 的作用靶標(biāo)應(yīng)用于篩選腫瘤治療藥物。
[0021] 所述將人NLK基因和人EGFR基因作為藥物或制劑針對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用 于制備腫瘤治療藥物具體是指：將NLK基因和人EGFR基因共同作為RNA干擾作用的靶標(biāo)， 研制能同時(shí)針對(duì)兩種基因的腫瘤治療藥物或制劑，從而提高或降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)NLK基因和 人EGFR基因的表達(dá)水平；或者，將NLK基因和人EGFR基因分別作為RNA干擾作用的靶標(biāo)， 來研制分別針對(duì)兩種基因的腫瘤治療藥物，從而獲得能提高或降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)NLK基因和 人EGFR基因表達(dá)水平的腫瘤治療藥物或制劑。
[0022] 所述將人NLK基因和人EGFR基因作為藥物或制劑針對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用 于篩選腫瘤治療藥物具體是指：將人NLK基因和人EGFR基因同時(shí)作為作用對(duì)象，對(duì)藥物進(jìn) 行篩選，以找到可以分別影響(抑制或促進(jìn)）人NLK基因表達(dá)的藥物和影響(抑制或促進(jìn)）人 EGFR基因表達(dá)的藥物，然后作為腫瘤治療備選組合物藥物；或者找到可以同時(shí)影響(抑制 或促進(jìn)）人NLK基因和人EGFR基因表達(dá)的藥物作為腫瘤治療備選藥物。如本發(fā)明所述的 NLK基因小分子干擾RNA( s i RNA )、基因干擾核酸構(gòu)建體、慢病毒，以及EGFR基因小分子干擾 RNA (siRNA)、基因干擾核酸構(gòu)建體、慢病毒，均是以NLK基因和EGFR基因分別為作用對(duì)象 篩選獲得的；當(dāng)它們共同使用時(shí)，存在協(xié)同作用的效果，比單一一種物質(zhì)的使用效果更好； 可用作具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用的藥物。除此之外，諸如抗體藥物，小分子藥物等也可將 人NLK基因和人EGFR基因及其蛋白作為作用對(duì)象。
[0023] 所述將人NLK基因和人EGFR基因用于制備腫瘤診斷藥物，是指將NLK基因表達(dá)產(chǎn) 物和人EGFR基因表達(dá)產(chǎn)物作為腫瘤診斷指標(biāo)應(yīng)用于腫瘤診斷試劑的制備。
[0024] 本發(fā)明的所述腫瘤治療藥物為能夠特異性抑制人NLK基因和/或人EGFR基因的 轉(zhuǎn)錄或翻譯，或能夠特異性抑制人NLK基因和/或人EGFR基因的表達(dá)或活性的分子，從而 降低腫瘤細(xì)胞人NLK基因和/或人EGFR基因的表達(dá)水平，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、生長、 分化、存活的目的。
[0025] 本發(fā)明制備或篩選的腫瘤治療藥物包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂類、 小分子化學(xué)藥(例如抑制劑)、抗體藥、多肽、蛋白或干擾慢病毒。
[0026] 所述核酸分子包括但不限于：反義寡核苷酸、雙鏈RNA (dsRNA)、核酶、核糖核酸內(nèi) 切酶ΠΙ制備的小干擾RNA (esiRNA)或者短發(fā)夾RNA (shRNA)。
[0027] 所述腫瘤治療藥物的施用量為足夠降低人NLK基因和人EGFR基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯， 或者足夠降低人NLK蛋白和人EGFR蛋白的表達(dá)或活性的劑量。以使人NLK基因和人EGFR 基因的表達(dá)至少被降低50%、80%、90%、95%或99%。
[0028] 本發(fā)明中，當(dāng)人NLK基因和人EGFR基因作為協(xié)同施藥靶標(biāo)進(jìn)行腫瘤治療和藥物篩 選時(shí)，是通過RNA干擾的方法，以人NLK基因和EGFR基因作為RAN干擾的靶基因，降低這兩 個(gè)基因的表達(dá)水平。
[0029] 采用前述腫瘤治療藥物治療腫瘤的方法是通過單獨(dú)降低人NLK基因的表達(dá)水平 抑制腫瘤細(xì)胞的增殖來達(dá)到治療的目的，或者通過同時(shí)降低人NLK基因和人EGFR基因的表 達(dá)水平抑制腫瘤細(xì)胞的增殖來達(dá)到治療的目的。具體的，治療時(shí)，將能有效降低人NLK基因 表達(dá)水平的物質(zhì)；或者，將能有效降低人NLK基因和人EGFR基因表達(dá)水平的物質(zhì)給藥于患 者。
[0030] 本發(fā)明第二方面公開了一種治療腫瘤的核酸分子藥物，其有效成分含有降低腫瘤 細(xì)胞中NLK基因表達(dá)的分離的核酸分子，以及降低腫瘤細(xì)胞中EGFR基因表達(dá)的分離的核酸 分子；所述降低腫瘤細(xì)胞中NLK基因表達(dá)的分離的核酸分子包含：
[0031] a) NLK基因雙鏈RNA，所述NLK基因雙鏈RNA中含有能夠在嚴(yán)緊條件下與NLK基因 雜交的核苷酸序列；或者
[0032] b) NLK基因 shRNA，所述NLK基因 shRNA中含有能夠在嚴(yán)緊條件下與NLK基因雜交 的核苷酸序列；
[0033] 所述降低腫瘤細(xì)胞中EGFR基因表達(dá)的分離的核酸分子包含：
[0034] A. EGFR基因雙鏈RNA，所述EGFR基因雙鏈RNA中含有能夠在嚴(yán)緊條件下與EGFR 基因雜交的核苷酸序列；或者
[0035] B. EGFR基因 shRNA，所述EGFR基因 shRNA中含有能夠在嚴(yán)緊條件下與EGFR基因 雜交的核苷酸序列。
[0036] 進(jìn)一步的，所述腫瘤為肺癌或結(jié)腸癌。
[0037] 較優(yōu)的，所述NLK基因雙鏈RNA包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互 補(bǔ)共同形成RNA二聚體，并且所述第一鏈的序列與NLK基因的靶序列基本相同。
[0038] 較優(yōu)的，所述EGFR基因雙鏈RNA包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈 互補(bǔ)共同形成RNA二聚體，并且所述第一鏈的序列與EGFR基因的靶序列基本相同。
[0039] 較優(yōu)的，所述NLK基因 ShRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義鏈 片段和反義鏈片段的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的序列互補(bǔ)，并且所述 正義鏈片段的序列與NLK基因的靶序列基本相同。
[0040] 較優(yōu)的，所述EGFR基因 ShRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義 鏈片段和反義鏈片段的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的序列互補(bǔ)，并且所 述正義鏈片段的序列與EGFR基因的靶序列基本相同。
[0041] 更優(yōu)的，所述shRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列可選自以下任一 ：UUCAAGAGA、AUG、CCC、 UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU 和 CCACACC。
[0042] 更優(yōu)的，所述NLK基因的靶序列，為SEQ ID NO: 1所示序列；所述EGFR基因的靶序 列，為SEQ ID NO:2所示序列。
[0043] 所述NLK基因的靶序列即為siRNA用于特異性沉默NLK基因表達(dá)時(shí)，與所述siRNA 互補(bǔ)結(jié)合的mRNA片段所對(duì)應(yīng)的NLK基因中的片段。同理，所述EGFR基因的靶序列即為 siRNA用于特異性沉默EGFR基因表達(dá)時(shí)，與所述siRNA互補(bǔ)結(jié)合的mRNA片段所對(duì)應(yīng)的EGFR 基因中的片段。
[0044] 所述雙鏈RNA第一鏈和第二鏈的長度均為15-27個(gè)核苷酸；較佳的，長度均為 19-23個(gè)核苷酸；最佳的，長度均為19、20或者21個(gè)核苷酸。
[0045] 進(jìn)一步的，所述雙鏈RNA為小干擾RNA (siRNA)。
[0046] 最優(yōu)的，NLK基因小干擾RNA第一鏈的序列如SEQ ID NO :9所示，具體為 5' -GCAGCC⑶CAUUACAGCAA-3'。SEQ ID NO :9 所示的 NLK 基因 siRNA 的第一鏈為以 SEQ ID NO: 1所示的序列為RNA干擾靶序列設(shè)計(jì)的針對(duì)人NLK基因的小干擾RNA中的一條鏈，該第 一鏈與第二鏈組成的siRNA能夠起到特異性沉默腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源NLK基因表達(dá)的作用。
[0047] 最優(yōu)的，EGFR基因小干擾RNA第一鏈的序列如SEQ ID N0:10所示，具體為 5' -GGCUGGUUAUGUCCUCAUU-3'。SEQ ID NO :10 所示的 EGFR 基因 siRNA 的第一鏈為以 SEQ ID NO: 2所示的序列為RNA干擾靶序列設(shè)計(jì)的針對(duì)人EGFR基因的小干擾RNA中的一條鏈， 該第一鏈與第二鏈組成的siRNA能夠起到特異性沉默腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源EGFR基因表達(dá)的作 用。
[0048] 最優(yōu)的，所述NLK基因 shRNA的序列如SEQ ID NO: 11所示，具體為： 5' -GCAGCCGUCAUUACAGCAA CUCGAG UUGCUGUAAUGACGGCUGC-3'。
[0049] 最優(yōu)的，所述EGFR基因 shRNA的序列如SEQ ID NO: 12所示，具體為： 5, -GUGGCUGGUUAUGUCCUCAUUCUCGAG AAUGAGGACAUAACCAGCCAC-3，。
[0050] 當(dāng)用作治療腫瘤的藥物時(shí)，是將安全有效量的雙鏈RNA或shRNA施用于哺乳動(dòng)物。 具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
[0051] 本發(fā)明第三方面，公開了一種治療腫瘤的慢病毒載體藥物，其有效成分含有NLK 基因干擾慢病毒載體和EGFR基因干擾慢病毒載體，所述NLK基因干擾慢病毒載體含有編碼 前述NLK基因 shRNA的基因片段，所述EGFR基因干擾慢病毒載體含有編碼前述EGFR基因 shRNA的基因片段。
[0052] 進(jìn)一步的，所述腫瘤為肺癌或結(jié)腸癌。
[0053] 所述NLK基因干擾慢病毒載體是將編碼前述NLK基因 shRNA的DNA片段克隆入已 知載體獲得，所述已知載體多為慢病毒載體，所述NLK基因干擾慢病毒載體經(jīng)過病毒包裝 成為有感染力的病毒顆粒后，感染腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而轉(zhuǎn)錄出所述shRNA，通過酶切加工等步驟， 最終獲得所述NLK基因小干擾RNA，用于特異性沉默NLK基因的表達(dá)。EGFR基因干擾慢病 毒載體同NLK基因。
[0054] 編碼所述NLK基因 shRNA基因片段的DNA序列含有SEQ ID NO: 1所示序列及其互 補(bǔ)序列。編碼所述EGFR基因 shRNA基因片段的DNA序列含有SEQ ID NO: 2所示序列及其 互補(bǔ)序列。
[0055] 進(jìn)一步的，本發(fā)明所述基因干擾慢病毒載體還含有啟動(dòng)子序列和/或編碼腫瘤 細(xì)胞中可被檢測(cè)的標(biāo)記物的核苷酸序列；較優(yōu)的，所述可被檢測(cè)的標(biāo)記物如綠色熒光蛋白 (GFP) 0
[0056] 進(jìn)一步的，所述慢病毒載體可以選自：pLK0. 1-puro、pLKO. 1-CMV-tGFP、 pLKO.1-puro-CMV-tGFP、 pLKO.1-CMV-Ne。、 pLKO.1-Ne。、 pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、 pLKO. 1-puro-CMV-TagCFP、pLKO. 1-puro-CMV-TagYFP、pLKO. 1-puro-CMV-TagRFP、 pLKO. l-pur〇-CMV-TagFP635、pLKO. 1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO. l-pur〇-UbC-TagFP635、 pLKO-puro-IPTG-lxLacO、pLK0-pur〇-IPTG-3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、 pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAL 2/V5-GW/lacZ、pLenti6. 2/ N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-GW/lacZ 中的任一。
[0057] 本發(fā)明第四方面，公開了一種治療腫瘤的慢病毒藥物，其有效成分含有NLK基因 干擾慢病毒和EGFR基因干擾慢病毒，所述NLK基因干擾慢病毒由前述NLK基因干擾慢病 毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過病毒包裝而成；所述EGFR基因干擾慢病 毒由前述EGFR基因干擾慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過病毒包裝而 成。
[0058] 進(jìn)一步的，所述腫瘤為肺癌或結(jié)腸癌。
[0059] 本發(fā)明的慢病毒可感染腫瘤細(xì)胞并產(chǎn)生分別針對(duì)NLK基因或EGFR基因的小分子 干擾RNA，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。該NLK基因干擾慢病毒和EGFR基因干擾慢病毒可用 于制備預(yù)防或治療腫瘤的藥物。
[0060] 本發(fā)明第五方面，公開了一種用于治療肺癌或結(jié)腸癌的藥物組合物，其組成含有 前述降低腫瘤細(xì)胞中NLK基因表達(dá)的分離的核酸分子、NLK基因干擾慢病毒載體、NLK基因 干擾慢病毒中的至少一種；以及，前述降低腫瘤細(xì)胞中EGFR基因表達(dá)的分離的核酸分子、 EGFR基因干擾慢病毒載體、EGFR基因干擾慢病毒中的至少一種。
[0061] 優(yōu)選的，上述成分為治療肺癌或結(jié)腸癌的藥物組合物的藥效成分。
[0062] 當(dāng)用作治療腫瘤的藥物時(shí)，是將安全有效量的雙鏈RNA、shRNA、或慢病毒施用于哺 乳動(dòng)物。具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之 內(nèi)的。
[0063] 本發(fā)明的藥物組合物中，特異性沉默NLK基因表達(dá)，以及特異性沉默EGFR基因表 達(dá)的有效成分發(fā)揮了協(xié)同治療的作用；本發(fā)明實(shí)施例記載，雙基因敲減后的癌細(xì)胞生長抑 制率明顯大于單基因敲減組的加和，表明特異性沉默NLK基因表達(dá)的物質(zhì)與特異性沉默 EGFR基因表達(dá)的物質(zhì)協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。
[0064] 進(jìn)一步的，本發(fā)明所述藥物或藥物組合物含有1?99wt%所述小干擾RNA、shRNA、 基因干擾核酸構(gòu)建體和/或基因干擾慢病毒，以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。 [0065] 制備藥物時(shí)，通常將有效成分與賦形劑混合，或用賦形劑稀釋，或包在可以膠囊或 藥囊形式存在的載體中。當(dāng)賦形劑起稀釋劑作用時(shí)，它可以是固體、半固體或液體材料作為 賦形劑、載體或活性成分的介質(zhì)。因此，組合物可以是片劑、丸劑、粉劑、溶液劑、糖漿劑、滅 菌注射溶液等。合適的賦形劑的例子包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶 纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水等。制劑還可包括：濕潤劑、乳化劑、防腐劑（如羥基苯 甲酸甲酯和丙酯）、甜味劑等。
[0066] 本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供的SiRNA或者包含該小干擾RNA序列的核酸構(gòu) 建體、慢病毒能夠特異性抑制人NLK基因的表達(dá)，尤其是慢病毒，能單獨(dú)，或者與EGFR靶向 慢病毒協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞的生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義。本發(fā)明 中的NLK基因即可以作為單獨(dú)的腫瘤治療靶標(biāo)，也可以作為EGFR基因協(xié)同治療靶標(biāo)，在腫 瘤治療中具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0067] 圖 I :GV115 質(zhì)粒 DNA 圖譜
[0068] 圖 2 :GV113 質(zhì)粒 DNA 圖譜
[0069] 圖3 :NLK shRNA質(zhì)粒鑒定圖
[0070] 1# :陰性對(duì)照（ddH20) ;2# :陰性對(duì)照（空載自連對(duì)照組）
[0071] 3# :Marker 自上而下依次為 5kb，3kb，2kb，I. 5kb，lKb，750bp，500bp，250bp，IOObp
[0072] 4# ?8# :NLK shRNAl-5 號(hào)轉(zhuǎn)化子鑒定
[0073] 圖4 :EGFR shRNA質(zhì)粒鑒定圖
[0074] 1# :陰性對(duì)照（ddH2〇)
[0075] 2# :陰性對(duì)照（空載自連對(duì)照組）
[0076] 3# :Marker 自上而下依次為 5kb，3kb，2kb，I. 5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，IOObp
[0077] 4# ?8# :EGFR shRNAl-5 號(hào)轉(zhuǎn)化子鑒定
[0078] 圖5 :NLK shRNA慢病毒和EGFR shRNA慢病毒同時(shí)浸染人肺癌H1299細(xì)胞4天后， 顯著抑制細(xì)胞增殖
[0079] 圖6 :表示NLK shRNA慢病毒和EGFR shRNA慢病毒同時(shí)浸染人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞4 天后，顯著抑制細(xì)胞增殖

【具體實(shí)施方式】
[0080] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制 本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條 件，如[美]Sambrook. J等著；黃培堂等譯。分子克隆試驗(yàn)指南，第三版。北京：科學(xué)出版社 2002中所述的條件或者制造商建議的條件進(jìn)行或配置。
[0081] 實(shí)施例1針對(duì)人NLK基因和EGFR基因 RNAi慢病毒的制備
[0082] 1.構(gòu)建慢病毒載體
[0083] I)構(gòu)建針對(duì)人NLK基因和EGFR基因的慢病毒載體
[0084] 從Genbank調(diào)取NLK(ΝΜ_016231)和EGFR基因（NM_201282)信息；利用上海吉?jiǎng)P基 因化學(xué)技術(shù)有限公司的設(shè)計(jì)軟件Genechem設(shè)計(jì)針對(duì)NLK基因和EGFR基因的有效的siRNA 靶點(diǎn)。初步篩選得到具有明顯抑制NLK基因表達(dá)功能的siRNA靶點(diǎn)序列（SEQ IDN0. 1)和 明顯抑制EGFR基因表達(dá)功能的siRNA靶點(diǎn)序列（SEQ ID NO. 2)。通過Genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行 BLAST分析，確定其不對(duì)任何其它基因產(chǎn)生干擾作用。
[0085] 表IsiRNA靶點(diǎn)序列

【權(quán)利要求】
1. 分離的人NLK基因在制備或篩選腫瘤治療藥物，或者在制備腫瘤診斷藥物中的用 途。
2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述人NLK基因作為針對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用靶 標(biāo)應(yīng)用于制備或篩選腫瘤治療藥物，或者制備腫瘤診斷藥物。
3. 如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述針對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)為RNA干擾作 用靶標(biāo)。
4. 分離的人NLK基因和人EGFR基因在制備或篩選腫瘤治療藥物，或者在制備腫瘤診斷 藥物中的用途。
5. -種治療腫瘤的核酸分子藥物，其有效成分含有降低腫瘤細(xì)胞中NLK基因表達(dá)的分 離的核酸分子，以及降低腫瘤細(xì)胞中EGFR基因表達(dá)的分離的核酸分子； 所述降低腫瘤細(xì)胞中NLK基因表達(dá)的分離的核酸分子包含： a) NLK基因雙鏈RNA，所述NLK基因雙鏈RNA中含有能夠在嚴(yán)緊條件下與NLK基因雜交 的核苷酸序列；或者 b) NLK基因 shRNA，所述NLK基因 shRNA中含有能夠在嚴(yán)緊條件下與NLK基因雜交的核 苷酸序列； 所述降低腫瘤細(xì)胞中EGFR基因表達(dá)的分離的核酸分子包含： A. EGFR基因雙鏈RNA，所述EGFR基因雙鏈RNA中含有能夠在嚴(yán)緊條件下與EGFR基因 雜交的核苷酸序列；或者 B. EGFR基因 shRNA，所述EGFR基因 shRNA中含有能夠在嚴(yán)緊條件下與EGFR基因雜交 的核苷酸序列。
6. 如權(quán)利要求5所述的核酸分子藥物，其特征在于，所述NLK基因雙鏈RNA包含第一 鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補(bǔ)共同形成RNA二聚體，并且所述第一鏈的序列 與NLK基因的靶序列基本相同；所述NLK基因 shRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段，以及連 接所述正義鏈片段和反義鏈片段的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的序列互 補(bǔ)，并且所述正義鏈片段的序列與NLK基因的靶序列基本相同；所述EGFR基因雙鏈RNA包 含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補(bǔ)共同形成RNA二聚體，并且所述第一鏈 的序列與EGFR基因的靶序列基本相同；所述EGFR基因 shRNA包括正義鏈片段和反義鏈片 段，以及連接所述正義鏈片段和反義鏈片段的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，所述正義鏈片段和所述反義鏈片 段的序列互補(bǔ)，并且所述正義鏈片段的序列與EGFR基因的靶序列基本相同。
7. 如權(quán)利要求6所述的核酸分子藥物，其特征在于，所述NLK基因的靶序列，為SEQ ID NO:1所示序列；所述EGFR基因的靶序列，為SEQ ID NO: 2所示序列。
8. 如權(quán)利要求5-7任一權(quán)利要求所述的核酸分子藥物，其特征在于，所述雙鏈RNA為 小干擾RNA，并且NLK基因小干擾RNA第一鏈的序列如SEQ ID NO :9所示；EGFR基因小干擾 RNA第一鏈的序列如SEQ ID NO :10所示；所述NLK基因 shRNA的序列如SEQ ID NO: 11所 示；所述EGFR基因 shRNA的序列如SEQ ID NO: 12所示。
9. 一種治療腫瘤的慢病毒載體藥物，其有效成分含有NLK基因干擾慢病毒載體和EGFR 基因干擾慢病毒載體，所述NLK基因干擾慢病毒載體含有編碼權(quán)利要求5-8任一權(quán)利要求 所述核酸分子藥物中的NLK基因 shRNA的基因片段；所述EGFR基因干擾慢病毒載體含有編 碼權(quán)利要求5-8任一權(quán)利要求所述核酸分子藥物中的EGFR基因 shRNA的基因片段。
10. -種治療腫瘤的慢病毒藥物，其有效成分含有NLK基因干擾慢病毒和EGFR基因干 擾慢病毒，所述NLK基因干擾慢病毒由權(quán)利要求9所述慢病毒載體藥物中的NLK基因干擾 慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過病毒包裝而成；所述EGFR基因干擾 慢病毒由權(quán)利要求9所述慢病毒載體藥物中的EGFR基因干擾慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì) 粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過病毒包裝而成。
11. 一種治療肺癌或結(jié)腸癌的藥物組合物，其組成含有權(quán)利要求5-8任一權(quán)利要求所 述核酸分子藥物中的降低腫瘤細(xì)胞中NLK基因表達(dá)的分離的核酸分子、權(quán)利要求9所述慢 病毒載體藥物中的NLK基因干擾慢病毒載體、權(quán)利要求10所述慢病毒藥物中的NLK基因干 擾慢病毒中的至少一種；以及權(quán)利要求5-8任一權(quán)利要求所述核酸分子藥物中的降低腫瘤 細(xì)胞中EGFR基因表達(dá)的分離的核酸分子、權(quán)利要求9所述慢病毒載體藥物中的EGFR基因 干擾慢病毒載體、權(quán)利要求10所述慢病毒藥物中的EGFR基因干擾慢病毒中的至少一種。
【文檔編號(hào)】A61K48/00GK104225618SQ201310231694
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2013年6月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月9日
【發(fā)明者】曹躍瓊, 朱向瑩, 金楊晟, 瞿紅花 申請(qǐng)人:上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司