專利名稱：靶向性共表達(dá)新型p53和p53AIP1的重組腺病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及靶向性共表達(dá)p53和p53AIP1的重組腺病毒備制方法，其備制的重組腺病毒具有在腫瘤細(xì)胞內(nèi)靶向性共表達(dá)具有較野生型P53細(xì)胞凋亡功能更強(qiáng)的新型抑癌基因p53和p53調(diào)控細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白(P53AIP1)，達(dá)到直接殺滅惡性腫瘤的效果，可用于多種癌癥的基因治療。故其所在的技術(shù)領(lǐng)域與生命醫(yī)藥和生物技術(shù)有關(guān)。
背景技術(shù)：
P53基因是腫瘤抑制基因家族中的主要成員，是目前發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤發(fā)生的相關(guān)性最高的基因。野生型p53基因在維持細(xì)胞正常生長、防止和抑制惡性腫瘤細(xì)胞的發(fā)生和增生中起重要作用。環(huán)境中各種的因素，如紫外線、放射線和化學(xué)物質(zhì)以及機(jī)體自身產(chǎn)生的某些代謝產(chǎn)物等都可導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷。在正常生理情況下，這些細(xì)胞DNA能在某些基因產(chǎn)物作用下進(jìn)行修復(fù)或被降解清除，防止其遺傳下去而保持正常DNA的復(fù)制，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞的正常功能運(yùn)作。否則損傷的DNA會(huì)繼續(xù)復(fù)制、隨染色體分離，導(dǎo)致染色體組中出現(xiàn)大量的DNA突變和染色體畸變。這些突變的進(jìn)一步積聚將便正常細(xì)胞最終惡化，發(fā)展成癌細(xì)胞。
現(xiàn)有的大量研究表明野生型p53蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著“基因衛(wèi)士”的生物功能作用，監(jiān)視著細(xì)胞基因組的完整性和穩(wěn)定性。在細(xì)胞DNA受到損傷時(shí)，p53迅速活化p21基因的轉(zhuǎn)錄，抑制多種原癌基因，如c-Fos、c-jun、Rb和其他相關(guān)基因如IL-6、PCNA的轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞分裂停滯在G1期節(jié)點(diǎn)。同時(shí)，野生型p53蛋白質(zhì)與復(fù)制因子(RPA)相互作用，參與DNA的復(fù)制和修復(fù)。更為重要的是，野生型p53蛋白質(zhì)能啟動(dòng)細(xì)胞程序性死亡過程，誘導(dǎo)細(xì)胞自殺，防止具有惡變傾向的細(xì)胞進(jìn)一步分裂、增殖，從而防止癌癥的發(fā)生。
p53基因突變是人類惡性腫瘤中最常見的遺傳變異。據(jù)統(tǒng)計(jì)，大約有50％的人類腫瘤發(fā)生與p53基因突變有關(guān)，有30％-40％的乳腺癌、50％的肺癌和70％的結(jié)腸癌存在P53基因突變；幾乎100％的小細(xì)胞性肺癌有p53基因突變。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，表達(dá)異常p53基因蛋白的小鼠100％的發(fā)生腫瘤。
由于p53基因如此重要的生物學(xué)功能及其與人類腫瘤發(fā)生和惡性程度有密切關(guān)系，在八十年代以來，科學(xué)家就開始了應(yīng)用外源野生型p53基因的生物學(xué)功能，啟動(dòng)p53基因缺陷型腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞程序性凋亡過程，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自殺死亡的實(shí)驗(yàn)研究和臨床腫瘤基因治療研究?，F(xiàn)在眾多的研究報(bào)告以及臨床研究結(jié)果證明，野生型p53基因冶療安全、有效，而且毒副作用小。
臨床研究結(jié)果表明，野生型p53基因?qū)θ祟^頸腫瘤、腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤、膀胱癌、卵巢癌、黑色素瘤和肺癌有較好療效。同時(shí)研究還表明野生型p53基因還具有抑制腫瘤組織內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)表達(dá)的作用，因而減少腫瘤組織內(nèi)血管的形成，減少腫瘤組織的血供，起著進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡的作用。
野生型p53基因的某些氨基位點(diǎn)在自然狀態(tài)下存在多態(tài)性，例如在47位點(diǎn)存在脯氨酸/絲氨酸多態(tài)性。研究發(fā)現(xiàn)野生型P5347位點(diǎn)為脯氨酸，其介導(dǎo)的激酶p38MAPK使鄰近的46位點(diǎn)絲氨酸磷酸化，可大大增加誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力；而47位點(diǎn)為絲氨酸的變異，則使p53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力下降2-5倍以上。同樣，野生型P53基因72位點(diǎn)存在常見的脯氨酸(P72，下同)/精氨酸(R72，下同)多態(tài)性，這種多態(tài)性對于野生型P53基因的細(xì)胞調(diào)亡誘導(dǎo)功能上有很大的意義。P53基因?yàn)镽72型的，其細(xì)胞調(diào)亡能力比P72型的強(qiáng)2-15倍以上(Murphy M，etal2003，3(3)357-65，Nat.Genetics)，其機(jī)理被認(rèn)為至少部份是由于R72型p53基因增加了在線粒體的聚集，能直接與促細(xì)胞調(diào)亡蛋白BAK相互作用，破壞線粒體，使細(xì)胞缺乏能量而導(dǎo)致細(xì)胞調(diào)亡有關(guān)。
新近，一種新的p53突變體，p53-46F，即p53-46S(Ser)突變?yōu)镻53-46F(Phe)已被證明其促細(xì)胞調(diào)亡功能在許多癌細(xì)胞比野生型p53更有效，對p53下游基因，包括Noxa，p53AIP1和P53RFP的轉(zhuǎn)激活水平比野生型p53更強(qiáng)(Nakamura Y，etal.Cancer Sci.2006.July(97(7)633-641)。
此外，近年的研究還證明，作為一種p53下游基因，p53AIP1，其促細(xì)胞調(diào)亡功能比野生型p53更強(qiáng)，其作用機(jī)理被認(rèn)為是下調(diào)細(xì)胞線粒體膜電位，增加細(xì)胞色素c的釋放有關(guān)。更重要的是，表達(dá)野生型P53基因的癌細(xì)胞對外源野生型p53的治療有抗性，但p53AIP1卻能有效地殺死表達(dá)野生型P53基因的癌細(xì)胞。而且，二者同時(shí)應(yīng)用對誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡有協(xié)同作用(Oda K，et al.Cell2000.Sep.15.102(6)849-62；Yoshida K，et al.Cancer Sci.2004 Jan95(1)91-97；Koschi Matsuda，et al.Cancer Research(2002)622883-2889)。
上述研究結(jié)果為協(xié)同使用上述突變型p53和p53AIP1對多種惡性腫瘤，無論其表達(dá)野生型P53還是表達(dá)突變型p53，進(jìn)行更有效地基因治療奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
毫無疑問，抗癌基因治療的成敗取決于整個(gè)表達(dá)結(jié)構(gòu)三大元件的最佳組合。第一個(gè)元件為進(jìn)入機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的腺病毒載體，要求安全、高效；第二個(gè)元件為治療基因的有效性；第三個(gè)元件為驅(qū)動(dòng)抗癌基因表達(dá)的啟動(dòng)子的強(qiáng)弱及其組織/細(xì)胞特異性。
目前，將基因?qū)塍w內(nèi)的載體多為復(fù)制缺陷型腺病毒載體。這種載體具有感染能力強(qiáng)、靶細(xì)胞可以是處于分裂期或是非分裂期、轉(zhuǎn)染細(xì)胞后腺病毒載體基因不整合進(jìn)入人類基因組、可大量生產(chǎn)高滴度腺病毒及其瞬時(shí)表達(dá)等特點(diǎn)，故復(fù)制缺陷型腺病毒載體是目前在腫瘤基因治療中的首選載體。
重組腺病毒驅(qū)動(dòng)治療基因表達(dá)的啟動(dòng)子可以有多種來源的啟動(dòng)子。目前使用較多是mCMV啟動(dòng)子，但此啟動(dòng)子幾乎沒有組織/細(xì)胞的特導(dǎo)性，對某些毒性作用較大的基因治療不大適合。
但無論如何，靶向性基因治療是目前和將來癌癥基因治療的一個(gè)非常重要的發(fā)展方向。因此，發(fā)現(xiàn)和證明一種腫瘤特異性啟動(dòng)子至關(guān)重要。
新近，一種腫瘤特異性啟動(dòng)子已被發(fā)現(xiàn)和克隆。這種腫瘤特異性啟動(dòng)子含有調(diào)控基因表達(dá)的胞核轉(zhuǎn)錄因子，活化蛋白因-1(AP-1)的結(jié)合位點(diǎn)和polyomavirus enhancer activator 3(PEA3，下同)結(jié)合位點(diǎn)?；罨鞍滓蜃?1(AP-1)和PEA-3這二個(gè)因子在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中都處于過表達(dá)狀態(tài)?；蛲蛔冄芯孔C明將上述二個(gè)因子結(jié)合位點(diǎn)或其中任何一個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行突變，都將失去該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的基因在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的功能，表明此啟動(dòng)子的上述二個(gè)因子結(jié)合位點(diǎn)是決定其腫瘤特異性表達(dá)的決定性因素，不可偏廢。更重要的是，研究已經(jīng)證明此腫瘤特異性啟動(dòng)子腫瘤細(xì)胞內(nèi)有較強(qiáng)的活性，而在正常細(xì)胞內(nèi)沒有或極低活性。因此，被確認(rèn)為一種腫瘤特異性啟動(dòng)子(Haviv，Y.S.，et alCurr.Gene Ther.Adv，Drug.Delivery Rev.53，135-154；Haviv，Y.S.，et alCurr.Gene.Ther.(2003)3，357-365；Su，ZZ.et al.PNAS(2005)，102(4)1059-1064；Devanand Sarkar，et al.PNAS(2005)，102(39)14034-14039)，。
同樣，病毒載體感染細(xì)胞須與細(xì)胞上的受體結(jié)合才能起作用，故其感染與細(xì)胞膜上的受體數(shù)量呈正比。某些組織細(xì)胞，尤其是腫瘤細(xì)胞表面的CAR受體偏少，Ad5對它們的感染受限，故病毒難以感染進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)有效發(fā)揮其治療作用。
綜上所述，構(gòu)建新一代由腫瘤特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，僅在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)冶療基因、又具有更強(qiáng)腫瘤細(xì)胞感染力，為臨床治療惡性腫瘤提供一種靶向性腫瘤基因治療的腺病毒，在腫瘤的基因治療應(yīng)用中將具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的以細(xì)胞調(diào)亡功能更強(qiáng)的R72型腫瘤抑制基因p53和p53調(diào)控的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白為治療基因，以腫瘤特異性啟動(dòng)子為調(diào)控元件，構(gòu)建新一代抗癌作用更強(qiáng)、但又不損害正常細(xì)胞的腺病毒，使其成為臨床惡性腫瘤的基因治療的新一代產(chǎn)品。
本發(fā)明的表達(dá)新型抑癌基因p53和p53AIP1基因的表達(dá)結(jié)構(gòu)，其主要特點(diǎn)為1).野生型P53抑癌基因的第72位氨基酸由脯氨酸突變成為精氨酸，其他氨基酸組成及其排列順序不變；2).其表達(dá)盒由腫瘤特異性啟動(dòng)子、P53(72R型)、內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)、抑癌基因p53調(diào)控的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白基因和SV40多聚腺嘌呤DNA片段構(gòu)成。因此，該新型腺病毒由于具有靶向性共表達(dá)二種抗癌基因，因而其抗癌功能更強(qiáng)、抗癌譜更廣，又具有不損傷正常細(xì)胞的生物功能。


附圖1人野生型腫瘤抑制因子p53基因的PCR產(chǎn)物應(yīng)用人工合成的特異性引物，以人正常組織cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，其反應(yīng)產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖電泳分離；純化后進(jìn)行克隆。第一泳道和第二泳道為PCR產(chǎn)物、第三泳道為Φ174/BsuRI DNA分子量標(biāo)記物。
附圖2腫瘤抑制因子p53突變型R72的內(nèi)切酶圖譜R72突變型腫瘤抑制因子p53在突變位點(diǎn)形成新的核苷酸內(nèi)切酶smal1位點(diǎn)。用內(nèi)切酶smal1分別消化R72突變型和野生型腫瘤抑制因子p53后，R72突變型產(chǎn)生二個(gè)DNA片段；野生型僅產(chǎn)生一個(gè)DNA片段。圖示電泳第一泳道為landa/Hind111 DNA分子量標(biāo)記物，第二泳道為I kB DNA分子量標(biāo)記物；第三泳道為野生型腫瘤抑制因子P53；第四泳道R72突變型腫瘤抑制因子P53。
附圖3抑癌基因p53調(diào)控的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白基因(p53AIP1)的克隆此為p53AIP1的EcoR1酶切圖譜。經(jīng)RT-PCR反應(yīng)，克隆p53AIP1于T-Easy載體。第一、二泳道為DNA分子量標(biāo)記物，第三泳道為p53AIP1的EcoR1酶切結(jié)果。箭頭所指為p53AIP1基因。
附圖4腫瘤特異性啟動(dòng)子的克隆應(yīng)用野生型p53轉(zhuǎn)染，導(dǎo)致的Hela腫瘤細(xì)胞凋亡，并抽取總核糖核酸。此徒結(jié)果為合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸后的PCR反應(yīng)產(chǎn)物。第一泳道為DNA分子標(biāo)準(zhǔn)、第二、第三和第四道均為PCR反應(yīng)產(chǎn)物。箭頭為PCR反應(yīng)產(chǎn)物。
附圖5由腫瘤特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)盒構(gòu)成圖譜此表達(dá)盒圖譜顯示由位于N-未端的腫瘤特異性啟動(dòng)子、新型p53、IRES、p53AIP1和SV40多聚腺嘌呤組成，并以不同內(nèi)切酶位點(diǎn)相連接。
附圖6表達(dá)由腫瘤特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)盒的重組腺病毒結(jié)構(gòu)圖結(jié)構(gòu)圖中兩瑞分別為腺病毒的左臂和右臂，表達(dá)盒由腫瘤特異性啟動(dòng)子、R72型腫瘤抑制因子p53、內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)(IRES，下同)、抑癌基因p53調(diào)控的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白基因和SV40多聚腺苷酸組成。
附圖7新型腫瘤抑制因子p53、內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)和抑癌基因p53調(diào)控的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白基因(p53AIP1)拼接完成后的內(nèi)切酶圖譜以BamH1酶切重組IRES質(zhì)粒DNA，產(chǎn)生全長新型腫瘤抑制因子p53片段(上部箭頭所示)和另一由全長IRES及較小部份p53AIP1組成的片段(下部箭頭所示)。第一和第二道為不同分子量DNA標(biāo)準(zhǔn)物，第三道僅為含p53AIP1基因的重組IRES質(zhì)粒，第四道為含p53和p53AIP1的IRES質(zhì)粒。
附圖8抑癌因子p53和p53AIP1以及二者協(xié)同對肺癌細(xì)胞的凋亡作用觀察此為含下述基因的表達(dá)質(zhì)粒三次轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞的平均結(jié)果。A，對照組；B，野生型p53；C，突變型p53；D，p53AIP1；E，野生型p53+p53AIP1；D，突變型p53+p53AIP具體實(shí)施方式
以下的實(shí)施例是為了舉例說明本發(fā)明的內(nèi)容，而不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明所用的腺病毒載體為Stratagene公司產(chǎn)品，包括腺病毒穿載體PaDeasy-1。穿梭質(zhì)粒pShuttle和pShuttle-IRES。
實(shí)施例一、R72型腫瘤抑制因子p53的形成其方法是以克隆的人p53基因?yàn)槟０?，采用基因突變技術(shù)，使野生型第72位脯氨酸的密碼子ccc(P72)突變成精氨酸的密碼子cgg(R72)，在突變區(qū)形成新的核苷酸內(nèi)切酶smal1位點(diǎn)。
i).人野生型腫瘤抑制因子p53基因5’-端Nco1至笫72位密碼子片段擴(kuò)增以人野生型P72腫瘤抑制因子p53基因cDNA中N’-端-Nco1-突變區(qū)片段作為模板，用人工合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
PCR引物設(shè)計(jì)如下引物1N端5’-gccttccgggtcactg aggagccg-3’30 mer Nco1引物2ccg為精氨酸密碼子N端5’-gaatgccagaggctgctccc gtggcccctgca-3’35 merPCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)taillng加上腺嘌呤后，連接至T-easy載體，轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，擴(kuò)增、抽提、純化，經(jīng)DNA測序確定。
2).人野生型腫瘤抑制因子p53基因笫72密碼子區(qū)至C-端Nco1片段擴(kuò)增以上述的片段區(qū)cDNA為模板，用人工合成的下列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
PCR引物設(shè)計(jì)如下引物3ccg為精氨酸密碼子N端 5-aggggccac gggagcagcctctggcattc-332 mer引物4N端 5’-gtagatgg cgcggacgcgggtg-3’28 merNco1將PCR擴(kuò)增的二個(gè)產(chǎn)物按1)的方法聯(lián)接至T-easy載體，經(jīng)DNA測序正確無誤。
3).上述二個(gè)PCR片段產(chǎn)物的拼接，形成Nco1～Nco1片段將1)和2)中含上述DNA片段的T-easy載體質(zhì)粒DNA分別用Nco1和Smal1完全酶切，純化后，再與經(jīng)Nco1酶切的野生型p53基因cDNA進(jìn)行連接。轉(zhuǎn)化細(xì)菌、質(zhì)粒抽提和經(jīng)酶切檢測拼接方向正確后，構(gòu)建成R72型的野生型p53基因表達(dá)質(zhì)粒pCMV-neo-p53
實(shí)施例二、抑癌基因p53調(diào)控的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白基因的克隆1)、將含有野生型p53基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela腫瘤細(xì)胞48小時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞凋亡后，收集細(xì)胞，并提取總核糖枚核酸，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶作用，合成互補(bǔ)脫氧核糖枚核酸(cDNA，下同)。
2)、應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增p53AIP1基因以上述合成的cDNA為模板，用人工合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
引物設(shè)計(jì)如下引物1(在N-末端引入內(nèi)切酶位點(diǎn)Sma1)5′-ctcccggggatgggatcttcctctgaggcgagcttcaga-3′引物2(在c-末端引入內(nèi)切酶位點(diǎn)Xba1)5′-tgagatcttcagttcccagctctgtccaatgctctg-3′PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)tailing加上腺嘌呤后，連接至T-easy載體，轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，擴(kuò)增、抽提、純化，經(jīng)DNA測序確定。
實(shí)施例三、腫瘤特異性啟動(dòng)子DNA片段的人工合成及其克隆根椐巳知基因序列，按常規(guī)技術(shù)人工合成腫瘤特異性啟動(dòng)子的DNA片段，并以下述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
引物1(在N-末端引入內(nèi)切酶位點(diǎn)Nru1、Kpn1和Xba1)5’-tgtcgcgaggtacctctagaatttcagtgttgttttcct-3’引物2(在C-末端引入內(nèi)切酶位點(diǎn)EcoR1和Stu1)5′-gcgatatcaggcctgtccggttcggtttgccaaaagcg-3′PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)tailing加上腺嘌呤后，連接至T-easy載體，轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，擴(kuò)增、抽提、純化，經(jīng)DNA測序確定。
實(shí)施例四、由腫瘤特異性啟動(dòng)子、新型p53、內(nèi)部核糖體結(jié)合點(diǎn)(IRES)和p53AIP1組成的表達(dá)盒的構(gòu)建。本實(shí)施例所用的Stratagene公司產(chǎn)品為pShuttle-IRES，以此載體為骨架構(gòu)建表達(dá)盒。通過多次不同的內(nèi)切酶消化、連接反應(yīng)、感受態(tài)細(xì)菌轉(zhuǎn)化和測序證實(shí)，完成此表達(dá)盒構(gòu)建。即以5’-末端為Sma1內(nèi)切酶位點(diǎn)和3’-末端為Xba1內(nèi)切酶位點(diǎn)的P53AIP1基因片段拼接于SV40多聚腺嘌呤的上游，而位于IRES的下游；以5’-末端為EcoR V和3’-末端為Not1內(nèi)切酶位點(diǎn)的新型P53片段，拼接于IRES的上游；以5’-末端為Nru1和3’-末端為EcoR1內(nèi)切酶位點(diǎn)的腫瘤特異性啟動(dòng)子PEG-3片段，拼接于新型P53片段的上游，至此，此表達(dá)盒構(gòu)建才告完成。
實(shí)施例五、構(gòu)建含此表達(dá)盒的腺病毒穿梭質(zhì)粒1).以內(nèi)切酶Kpn1和Sal1消化上述含表達(dá)盒的pIRES質(zhì)粒DNA，將產(chǎn)生Kpn1-Kpn1片段和Kpn1-Sal1二個(gè)DNA片段，由此，該表達(dá)盒將包含SV40的多聚腺嘌呤DNA序列。消化后，經(jīng)1.2％瓊脂糖電泳分離、純化所需DNA片段備用。
2).以內(nèi)切酶Kpn1和Sal1消化pShuttle穿梭載體質(zhì)粒DNA，經(jīng)1.2％瓊脂糖電泳分離、純化線性化的pShuttle載體DNA備用。
3).將上述線性化的pShuttle載體DNA片段和消化表達(dá)盒產(chǎn)生的Kpn1-Kpn1片段和Kpn1-Sal1二個(gè)DNA片段，在連接酶作用下進(jìn)行拼接反應(yīng)，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，培養(yǎng)擴(kuò)增。
4).篩選細(xì)菌轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)擴(kuò)增，抽取重組質(zhì)粒DNA，最后再經(jīng)酶切消化和DNA測序證實(shí)。
實(shí)施例六、靶向性共表達(dá)新型p53和p53AIP1基因的重組腺病毒1).制備線性化含新型p53和p53AIP1基因表達(dá)盒的重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-p53-p53AIP1取適量上述重組穿梭質(zhì)粒DNA，經(jīng)核苷酸內(nèi)切酶Pme1消化、電泳分離、純化Pme1酶切線性化重組穿梭質(zhì)粒DNA，備用。
2).將上述線性化重組穿梭質(zhì)粒DNA電擊轉(zhuǎn)化已預(yù)轉(zhuǎn)化腺病毒載體pAdEasy-1的BJ5183-AD-1細(xì)菌，進(jìn)行同源重組，并以抗生素卡拉霉素進(jìn)行篩選。含腺病毒載體pAdEasy-1重組體的細(xì)菌將為耐卡拉霉素細(xì)株。
3).擴(kuò)增含腺病毒載體pAdEasy-1重組體的、耐卡拉霉素的細(xì)株，即擴(kuò)增重組腺病毒載體pAdEasy-1DNA。抽提腺病毒載體pAdEasy-1重組體DNA，用內(nèi)切酶Pac1消化，線性化腺病毒載體pAdEasy-1重組體DNA，并分離純化備用。
4).按Stratagene公司關(guān)于AdEasy XL Adenoviral Vector System說明手冊介紹的方法，將上述純化備用的線性化腺病毒載體pAdEasy-1重組體DNA轉(zhuǎn)染AD-胚胎腎293細(xì)胞。
5).轉(zhuǎn)染AD-胚胎腎293細(xì)胞7-10后，備制原代重組腺病毒母液，并優(yōu)化原代重組腺病毒母液的感染AD-胚胎腎293細(xì)胞的條件，擴(kuò)增重組腺病毒。
6).擴(kuò)增足量的高滴定度的重組腺病毒，用于研究和動(dòng)物試驗(yàn)。
序列表Individual Applicant--------------------Street科學(xué)城國際企業(yè)孵化器A區(qū)610房City廣州市State廣東省Country中國PostalCode510633PhoneNumber020-32290208FaxNumber020-38491559EmailAddressshangwu_w@yahoo.com<110>LastName王<110>FirstName尚武<110>MiddleInitial<110>SuffixApplication Project-------------------<120>Title靶向性共表達(dá)新型p53和p53AIP1的重組腺病毒<130>AppFileReference<140>CurrentAppNumber1<141>CurrentFilingDate2006-08-25Sequence--------<213>OrganismNamehuman<400>PreSequenceStringatcgatatcg ccaccgtcca gggagcaggt agctgctggg ctccggggac actttgcgtt60cgggctggga gcgtgctttc cacgacggtg acacgcttcc ctggattggc agccagactg120ccttccgggt cactgccatg gaggagccgc agtcagatcc tagcgtcgag ccccctctga180gtcaggaaac attttcagac ctatggaaac tacttcctga aaacaacgtt ctgtccccct240tgccgtccca agcaatggat gatttgatgc tgtccccgga cgatattgaa caatggttca300ctgaagaccc aggtccagat gaagctccca gaatgccaga ggctgctccc cgggtggccc360ctgcaccagc agctcctaca ccggcggccc ctgcaccagc cccctcctgg cccctgtcat420cttctgtccc ttcccagaaa acctaccagg gcagctacgg tttccgtctg ggcttcttgc480attctgggac agccaagtct gtgacttgca cgtactcccc tgccctcaac aagatgtttt540gccaactggc caagacctgc cctgtgcagc tgtgggttga ttccacaccc ccgcccggca600
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305310315320LysProLeuAspGlyGluTyrPheThrLeuGlnIleArgGlyArgGluArgPheGluMet325330335340PheArgGluLeuAsnGluAlaLeuGluLeuLysAspAlaGlnAlaGlyLysGluProGly345350355360GlySerArgAlaHisSerSerHisLeuLysSerLysLysGlyGlnSerThrSerArgHis365370375380LysLysLeuMetPheLysThrGluGlyProAspSerAspTer385390Sequence<213>OrganismNameRat<400>PreSequenceStringtgaggctcgc gaggtacctc tagaatttca gtgttgtttt cctctctcca cctttctcag60ggacttccga aactccgcct ctccggtgac gtcagcatag cgctgcgtca gactataaac120tcccgggtga tcgtgttggc gcagattgac tcagttcgca gcttgtggaa gattacatgc180gagaccccgc gcgactccgc atccctttgc cgggacagcc tttgcgacag cccgtgagac240atcacgtccc cgagccccac gcctgagggc gacatgaacg cgctggcctt gagagcaatc300cggacccacg atcgcttttg gcaaaccgaa ccggacaggc ctgctagccg atatcgtgtt360ca 362<212>Type<211>Length362SequenceNamePEG-3 PromotorSequenceDescriptionDNA
Sequence--------<213>OrganismNameHuman<400>PreSequenceStringP53AIP1tggacccccg ggctggatcc tgatgggatc ttcctctgag gcgagcttca gatctgctca60agcttcctgc agtggggcca ggaggcaggg cctgggcagg ggagaccaga acctctcggt120gatgcctccg aatggcaggg ctcagacaca cacacctggc tgggtaagtc cctgcagtga180aaaccgagac ggtcttttgc ctgccacagc cccgggcaga ctctgctctc accgtggtgc240cgacatccca agttttcaga ctcaccagga cccagtgaca gcatctgggt cctcagagct300gcatgcggac tgtccccagt tcagagcatt ggacagagct gggaactgac agaattccat360ctagacggta 370<212>TypeDNA<211>Length370SequenceNameP53AIP1SequenceDescription<212>TypeDNA<211>Length339SequenceNameP53AIP1SequenceDescriptionMetGlySerSerSerGluAlaSerPheArgSerAlaGlnAlaSerCysSerGlyAlaArg5 10 15 20ArgGlnGlyLeuGlyArgGlyAspGlnAsnLeuSerValMetProProAsnGlyArgAla25 30 35 40GlnThrHisThrProGlyTrpValSerProCysSerGluAsnArgAspGlyLeuLeuPro45 50 55 60
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caatgtatct taacgcgtcg agtgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta3600tcttatcatg tctgtatacc gtcgac 3626<212>TypeDNA<211>Length3626SequenceName表達(dá)盒SequenceDescription
權(quán)利要求
1，一種靶向性共表達(dá)新型p53和p53AIP1的重組腺病毒。本發(fā)明使用的腺病毒載體為Stratagene公司的產(chǎn)品AdEasy-1載體，為E1和E3區(qū)缺失的腺病毒載體。本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)盒由腫瘤特異性動(dòng)子、新型p53、IRES、p53AIP1和SV40多聚腺嘌呤組成，其主要特征為a).人野生型p53抑癌基因的第72位氨基酸由脯氨酸突變成為精氨酸，其他氨基酸組成及其排列順序不變；b).P53抑癌基因在其N-末端以內(nèi)切酶EcoR V和C-末端以內(nèi)切酶Not1片段拼接于pIRES質(zhì)粒上游；c).p53AIP1基因在其N-末端以內(nèi)切酶Sma1和C-末端以內(nèi)切酶Xba 1片段拼接于pIRES質(zhì)粒下游；d).腫瘤特異性啟動(dòng)子在其N-末端以內(nèi)切酶Nru1和C-末端以內(nèi)切酶EcoRV片段拼接于新型p53基因的上游；經(jīng)重組后，該表達(dá)盒位于腺病毒載體的E1缺失區(qū)。該重組腺病毒具有靶向性共表達(dá)p53和p53AIP1的作用，因而具有更強(qiáng)細(xì)胞凋亡功能、抗癌譜更廣的生物功能。
2.根椐權(quán)利要求1，一種腫瘤特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)共表達(dá)二種有協(xié)同抗癌作用基因的表達(dá)盒，其含有下列氨基酸序列和具有轉(zhuǎn)錄功能的脫氧核苷酸序列a).與人腫瘤抑制基因p53的親本多肽的氨基酸序列基本一致，僅有一個(gè)氨基酸的取代，即此腫瘤抑制基因p53的第72異氨基酸由精氨酸(R72)代替野生型P53同一位置的脯氨酸(P72)。所述腫瘤抑制基因p53親本來源于人；b)一種親本源于人的p53調(diào)控的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白(p53AIP1)基因；c)腫瘤特異性啟動(dòng)子為鼠源PEG-3基因的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子包含的區(qū)域?yàn)?118到+194脫氧核苷酸組成；d)內(nèi)部校核糖體結(jié)合位點(diǎn)(IRES)源于腦心肌炎病毒。
3.根椐權(quán)利要求1和要求2所述重組腺病毒，其特征在于表達(dá)盒中驅(qū)動(dòng)共表達(dá)新型入腫瘤抑制基因p53和p53AIP1基因的啟動(dòng)子序列不僅限于鼠源腫瘤特異性PEG-3基因啟動(dòng)子，也包括其他腫瘤特異性啟動(dòng)子，如人端粒酶啟動(dòng)子、雌激素和低氧反應(yīng)啟動(dòng)子、人前列腺癌特異因子啟動(dòng)和肝胎兒甲型球蛋白啟動(dòng)子(AFP，胎甲球蛋白啟動(dòng)子)；。
4.根椐權(quán)利要求1，表達(dá)盒中共表達(dá)的p53基因既可位于IRES的上游，也可位于其下游；p53AIP1亦如此。
5.根椐權(quán)利要求1和要求3，由腫瘤特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)共表達(dá)的、位于IRES上游的基因既可是本發(fā)明的新型P53(72R)，也可以是p53(46F)；位于IRES下游的基因既可是p53AIP1基因，也可以是其他促細(xì)胞凋亡基因，如Noxa、p53RFP和P27(Kip1)；免疫調(diào)節(jié)因子，如MDA-7/IL-24、IL-2、IL-6、IFN-γ，粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)和TNF-a等。
6.根椐權(quán)利要求1，本發(fā)明使用的腺病毒載體為Stratagene公司的產(chǎn)品AdEasy-1載體，為E1和E3區(qū)缺失的復(fù)制缺陷型腺病毒載體。但本發(fā)明使用的腺病毒載體不限于此復(fù)制缺陷型Ad5型腺病毒，也包括條件性復(fù)制的腺病毒載體，如本人申請的另一專利“一種用于臨床腫瘤基因治療的新型腺病毒載體”所敘述的腺病毒載體。該專利敘述的條件性復(fù)制腺病毒載體為一種由腫瘤特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)腺病毒復(fù)制因子E1A基因僅在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，因而具有僅能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的能力。而且，其纖維蛋白AB環(huán)、H1環(huán)和/或Shaft進(jìn)行了突變，具有感染力更強(qiáng)、感染細(xì)胞譜更廣的特點(diǎn)。
7.根椐權(quán)利要求1，此靶向性共表達(dá)新型p53和p53AIP1的重組腺病毒為一種用于治療多種惡性癌癥疾病的基因治療藥物，以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
8.如權(quán)利要求7所述的基因治療藥物，其特征在于，權(quán)利要求1所述的由腫瘤特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)R72型人p53基因和p53AIP1基因共表達(dá)的重組腺病毒，所述的有效抗癌成份為細(xì)胞凋亡功能更強(qiáng)的R72型人p53基因和p53AIP1基因的表達(dá)蛋白質(zhì)。
9.如權(quán)利要求1、5、6、7和8的基因治療表達(dá)組合藥物，其特征除權(quán)利要求1所述的靶向性共表達(dá)R72型人p53基因和p53AIP1基因的重組腺病毒之外，還包括由此腫瘤特異性啟動(dòng)子靶向性共表達(dá)含有其他具有抗癌治療效果的促細(xì)胞凋亡因子、細(xì)胞因子和/或免疫調(diào)節(jié)因子通過內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)(IRES)與R72型人p53基因或p53AIP1基因相連接的表達(dá)盒的重組腺病毒。
全文摘要
本發(fā)明敘述了一種構(gòu)建靶向性共表達(dá)新型腫瘤抑制基因p53和p53調(diào)控的細(xì)胞凋零誘導(dǎo)蛋白基因(p53AIP1，下同)的表達(dá)盒結(jié)構(gòu)的重組腺病毒的方法及其用途和意義，其主要特征為1)野生型P53抑癌基因的第72位氨基酸由脯氨酸突變成為精氨酸，其他氨基酸組成及其排列順序不變；2)通過內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)將新型腫瘤抑制基因p53和p53AIP1基因連接；3)該表達(dá)盒的啟動(dòng)子由腫瘤特異性啟動(dòng)子PEG－3來驅(qū)動(dòng)；4)該重組腺病毒是復(fù)制缺陷型的血清A5型腺病毒。該新型腺病毒具有靶向性共表達(dá)二種抗癌基因，即新型腫瘤抑制基因p53和p53AIP1基因，其產(chǎn)物具有更強(qiáng)細(xì)胞凋亡生物功能，但對正常細(xì)胞不會(huì)造成損傷。因此，在腫瘤，尤其是惡性腫瘤的基因治療中將具有重要意義。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1944655SQ20061003745
公開日2007年4月11日 申請日期2006年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月4日
發(fā)明者王尚武, 朱雅南 申請人:王尚武, 朱雅南