本發(fā)明涉及魚類致病病毒的檢測領(lǐng)域，涉及一種魚類致病病毒檢測試劑盒以及檢測方法，尤其涉及一種錦鯉皰疹病毒Ⅲ型的檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
：錦鯉皰疹病毒(Koiherpesvirus)，簡稱KHV。主要是由DNA類皰疹濾過性病毒感染所引起，又名鯉魚腎炎及腮壞疽病毒。病毒有囊膜，核衣殼為二十面體，直徑為170～230nm，病毒核酸為雙鏈DNA。1998年5月在以色列的MaganMichael地區(qū)首次暴發(fā)錦鯉皰疹病毒病，同年成功分離出了病原錦鯉皰疫病毒(KoiHerpesVirus,KHV)，為皰疫病毒科(Herpesviridae)鯉皰疫病毒屬(CyprinidHerpesvirus)成員，又稱鯉皰疫病毒III型(CyHV-3)。錦鯉皰疫病毒病迅速擴展至世界各地。2002年首次證實該病已傳至我國，近年來鯉魚的養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。目前的診斷方法有細胞培養(yǎng)分離技術(shù)、電鏡技術(shù)、PCR、ELISA、原位雜交技術(shù)等，聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)和細胞培養(yǎng)技術(shù)是OIE推薦的診斷方法。但是這些方法都有各自的局限性，為了及早發(fā)現(xiàn)和確診錦鯉皰疹病毒病，有必要建立一種準確、快速、靈敏的檢測方法，為疾病的診斷與防控提供技術(shù)手段，也為鯉魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供技術(shù)保障。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-timeFluorescentQuantitativePolymeraseChainReaction,RtFQ-PCR)因其具有簡便、快速、敏感、特異、適于早期和大量樣品檢測的優(yōu)點，己在病原檢測領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。目前對于錦鯉皰疹病毒Ⅲ型的檢測國內(nèi)尚沒有相關(guān)的定量PCR檢測技術(shù)方面的研究報告。為了及時控制養(yǎng)殖魚類魚病發(fā)生，迫切需要一種能快速檢測魚體內(nèi)是否存在該致病病毒的技術(shù)。技術(shù)實現(xiàn)要素：發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決第一個技術(shù)問題是提供一種用于錦鯉皰疹病毒Ⅲ型TK基因序列擴增的引物對，該引物對用于檢測錦鯉皰疹病毒Ⅲ型TK基因。本發(fā)明所要解決的第二個技術(shù)問題是提供了一種錦鯉皰疹病毒Ⅲ型TK基因序列的擴增方法。本發(fā)明所要解決的第三個技術(shù)問題是提供一種錦鯉皰疹病毒Ⅲ型的檢測試劑盒，根據(jù)Genbank公布的CyHV-3毒株的TK基因序列(AB375390.1)，設(shè)計特異性引物，利用熒光定量PCR擴增靶基因的特定區(qū)域，從分子水平上對錦鯉皰疹病毒Ⅲ型進行快速檢測，具有簡便、快速、高特異性和靈敏性的特點。本發(fā)明所要解決的第四個技術(shù)問題是提供一種熒光定量檢測試劑盒檢測錦鯉皰疹病毒Ⅲ型的方法，能檢測CyHV-3感染的病魚組織和細胞等。技術(shù)方案：為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種用于錦鯉皰疹病毒Ⅲ型TK基因序列擴增的引物對，所述引物對包括上游引物TK-II-F和下游引物TK-II-R，所述上游引物TK-II-F的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，所述下游引物TK-II-R的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。本發(fā)明的內(nèi)容還包括一種錦鯉皰疹病毒Ⅲ型TK基因序列的擴增方法，包括以下步驟：1)生物信息學方法設(shè)計引物組及進行引物篩選得到如上述的引物對；2)錦鯉皰疹病毒Ⅲ型TK基因的熒光定量PCR檢測：用病毒基因組DNA提取試劑盒提取錦鯉皰疹病毒Ⅲ型基因組DNA，將基因組DNA進行常規(guī)PCR檢測獲得陽性DNA樣品；3)以步驟2)的陽性DNA樣品為模板，將權(quán)利要求1所述的引物對擴增錦鯉皰疹病毒Ⅲ型基因組DNA序列得到PCR擴增產(chǎn)物；4)步驟3)得到的PCR擴增產(chǎn)物分析并測序。其中，上述步驟1)是通過熒光定量PCR進行引物PCR擴增效率檢測從而篩選得到權(quán)利要求1所述的引物對。本發(fā)明的內(nèi)容還包括一種錦鯉皰疹病毒Ⅲ型的檢測試劑盒，所述錦鯉皰疹病毒Ⅲ型的檢測試劑盒包括上述的引物對。其中，上述上游引物TK-II-F和下游引物TK-II-R的濃度比是1-1.5：1-2，更為優(yōu)選地，所述上游引物TK-II-F和下游引物TK-II-R的濃度比是1：1。其中，上述的檢測試劑盒包括：1)錦鯉皰疹病毒Ⅲ型反應(yīng)液和Taq聚合酶：錦鯉皰疹病毒Ⅲ型反應(yīng)液包括含有dNTPs、buffer、MgC12、SYBRgreenI、DEPC水及上述的引物對的混合液；2)強陽性對照品：3)臨界陽性對照品；4)DNA提取液；5)陰性對照品。其中，上述強陽性對照品是重組質(zhì)粒；所述重組質(zhì)粒的序列如SEQIDNO：7所示。本發(fā)明的內(nèi)容還包括上述的錦鯉皰疹病毒Ⅲ型的檢測試劑盒在魚類致病菌的檢測方面的應(yīng)用。本發(fā)明的內(nèi)容還包括上述的檢測方法是實時熒光定量PCR檢測方法。上述的檢測方法具體包括以下步驟：1)提取魚取樣組織的DNA得到樣品DNA；2)建立反應(yīng)體系進行實時熒光定量PCR；3)通過比對標準品實時熒光定量PCR擴增曲線確定是否感染錦鯉皰疹病毒Ⅲ型上述步驟2)中實時熒光定量PCR檢測方法的反應(yīng)體系是：10pmol/μL的上游引物TK-Ⅱ-F2.0μL，10pmol/μL的下游引物TK-Ⅱ-R2.0μL，樣品DNA5μL，5U/μLTaqDNA聚合酶0.6μL，2.9μLDEPC水，2×進口實時熒光PCR緩沖液12.5μL；所述12.5μL的2×進口實時熒光PCR緩沖液是2.5μL的ThermoFisher公司的10×buffer、2μL的10mMdNTP、0.0025μL的10000×SYBRgreenI以及8μLDEPC水的混合物；所述反應(yīng)條件是：95℃3min；95℃10sec，60℃20sec，72℃20sec，75℃5sec，readplate共45個循環(huán)。有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點是：1、本發(fā)明首次提供了錦鯉皰疹病毒Ⅲ型TK基因熒光定量PCR檢測中的專用引物，使利用熒光定量PCR檢測錦鯉皰疹病毒Ⅲ型TK基因成為可能。2、本發(fā)明的檢測方法與錦鯉皰疹病毒Ⅲ型其他常規(guī)檢測方法，如病毒的分離培養(yǎng)鑒定、酶聯(lián)免疫吸附ELISA法和普通PCR相比，靈敏度和特異性極高，檢測效率得到了很大的提高。3、本發(fā)明檢測方法與錦鯉皰疹病毒Ⅲ型的其他檢測方法，如病毒的分離培養(yǎng)鑒定、酶聯(lián)免疫吸附ELISA法和普通PCR相比，具有操作程序簡單易用的特點，本發(fā)明的檢測試劑盒可用于操作程序化，適合大面積推廣和應(yīng)用。綜上所述，本發(fā)明能為快速、準確地檢測出錦鯉皰疹病毒Ⅲ型提供保證，為預(yù)防疾病，科學用藥，和保障魚類健康提供了保障。依據(jù)本發(fā)明專用引物的檢測方法及試劑盒可用于魚主要患病組織(肝、腦、腎)TK基因的核酸檢測。附圖說明圖1是采用三對引物分別對于錦鯉皰疹病毒Ⅲ型的目標靶基因進行擴增后的電泳圖；圖2是采用三對引物對三種非靶標魚類致病病毒的目標靶基因進行擴增后的電泳圖；圖3是利用第二對引物TK-Ⅱ-F/R進行的標準品實時熒光定量PCR擴增曲線圖，以TK-Ⅱ-F/R為陽性標準品引物，將陽性標準品質(zhì)粒DNA進行10倍系列稀釋，作擴增曲線，反映該引物擴增效率良好，檢測方法靈敏可靠；圖4是利用第二對引物TK-Ⅱ-F/R對魚DNA樣本進行實時熒光定量PCR擴增曲線圖，以TK-Ⅱ-F/R為檢測引物，3份患病魚7份健康魚的DNA為模板，作擴增曲線，圖中顯示3份患病魚擴增出相應(yīng)曲線，7份健康魚樣本并未擴增出曲線，說明檢測方法和引物可靠靈敏。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。以下實施例是為了對本發(fā)明作進一步詳細說明，并非對發(fā)明的限制。本發(fā)明的實驗方法均參照《精編分子生物學實驗指南》(F.M.奧斯伯等主編，科學出版社2005年出版)所建議的實驗條件。實施例1用于錦鯉皰疹病毒Ⅲ型TK基因進行熒光定量PCR檢測的引物設(shè)計及篩選1、生物信息學方法設(shè)計引物及進行引物篩選下載GenBank收錄的錦鯉皰疹病毒Ⅲ型的全序列(GeneBank：NC_009127.1)，同時下載陰性對照病毒基因組，錦鯉皰疹病毒Ⅰ型，錦鯉皰疹病毒Ⅱ型，鯉春病毒血癥病毒，請見表1。通過ClustalX進行比對后，選擇合適區(qū)域設(shè)計引物，該區(qū)域在錦鯉皰疹病毒Ⅲ型內(nèi)特異性表達，但相對于陰性對照至少存在10％-30％的差異，選定區(qū)域后采用ABIPrimerExpress3.0實時熒光定量PCR引物設(shè)計軟件，設(shè)計合成引物。將所提取的備選引物按以下要求進行篩選：1)引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計并具有特異性；2)產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)(自由能小于58.61KJ/mol)；3)引物長度一般在17-25堿基之間，上下游引物不能相差太大；4)G+C含量在40％～60％之間；5)堿基要隨機分布，盡量均勻；6)引物自身不能有連續(xù)超過4個堿基的互補；7)引物之間不能有連續(xù)超過4個堿基的互補；8)引物5’端可以修飾；9)3’端不可修飾，而且要避開AT，GCrich的區(qū)域(2-3個)；10)引物整體設(shè)計自由能分布5’端大于3’端，且3’端自由能最好小于9KJ/mol；11)引物設(shè)計避免DNA污染，最好跨外顯子接頭區(qū)；12)引物與非特異性擴增序列的同源性最好小于70％或者有8個互補堿基同源；13)查看有無假基因的存在。假基因就是無功能的DNA序列，與需要擴增的目的片段長度相似；14)Tm值在55-65℃之間。所用PCR引物由上海生工公司合成，引物要求PAGE純化，到貨時為引物干粉，用無菌水復(fù)溶后，對干粉進行含量測定，引物至100pmol/μL貯存液后備用。針對錦鯉皰疹病毒Ⅲ型TK基因，共設(shè)計了3組上下游引物，序列如下：TK-Ⅰ(149bp)上游引物TK-Ⅰ-F：5’-GCTATGCTGGAACTGGT-3'；下游引物TK-Ⅰ-R：5’-GCCACCTTGGAVTCTTCG-3'；TK-Ⅱ(116bp)上游引物TK-Ⅱ-F：5’-GCCCTACGCCTCTCTTTA-3'；下游引物TK-Ⅱ-R：5’-GCAGCTCTCTGTGCTCTT-3'；TK-Ⅲ(106bp)上游引物TK-Ⅲ-F：5’-CGCCTCTCTTTATCTCGC-3'；下游引物TK-Ⅲ-R：5’-CTCTCTGTGCTCTTGCCC-3'。表1陰性對照物種名稱陰性對照物種名稱GenBank錦鯉皰疹病毒Ⅰ型Cyprinidherpesvirus1,CyHV-INC_019491.1錦鯉皰疹病毒Ⅱ型Cyprinidherpesvirus2,CyHV-IINC_019495.1鯉春病毒血癥病毒Springviremiaofcarpvirus,SVCVU18101.22、分子生物學實驗進行引物檢測2.1實驗材料及試劑材料：魚類常見致病錦鯉皰疹病毒Ⅲ型，錦鯉皰疹病毒Ⅰ型，錦鯉皰疹病毒型，鯉春病毒血癥病毒。四種病毒均來自中科院武漢水生生物研究所。使用前均用相應(yīng)的培養(yǎng)基活化，將活化的病毒分別感染健康錦鯉，待病癥體現(xiàn)后分別取患病魚的肝、腦、腎組織作為待測樣本。用病毒基因組DNA提取試劑盒(Tiangen)提取錦鯉皰疹病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型基因組DNA。用RNA提取試劑盒(Tiangen)提取患鯉春病毒血癥病毒樣本的總RNA，用RT-PCR試劑盒(ThermoFisher)逆轉(zhuǎn)錄。用ThermoFisherPCR試劑盒來評價PCR體系的特異性和靈敏度。TiangenDNA試劑：5U/μLTaqDNApolymerase(含10×reactionbuffer和25mMMg2+)、10mMdNTP、DNAmarkerI；MilliporeH2O高壓滅菌后分裝，于-20℃保存?zhèn)溆谩NA試劑：裂解液RL、去蛋白液RW1、漂洗液RW、蛋白酶K、RNase-FreeddH2O、RNase-Free吸附柱CR3、1500UDNaseI，于-20℃保存?zhèn)溆?。ThermoFisherRT-PCR試劑：(1μg)PositivecontrolRNA(陽性對照RNA)、200U/μLAMVreversetranscriptase(AvianMyeloblastosisVirusReverseTranscriptase，禽成髓細胞瘤病毒反轉(zhuǎn)錄酶)、RNaseinhibitor(RNA酶抑制劑)、10mMdNTP(脫氧核苷三磷酸)、RNasefreeH2O(無RNA酶水)、10×RTbuffer(反應(yīng)緩沖液)、25mMMgCl2(氯化鎂)，10×Taqbuffer(Taq酶緩沖液)，5U/μLTaqDNApolymerase(TaqDNA聚合酶)，于-20℃保存?zhèn)溆谩?.2引物、病毒測試用常規(guī)PCR測試所設(shè)計的引物，供試病毒，PCR反應(yīng)體系根據(jù)各組分的濃度配制，擴增程序根據(jù)引物的Tm值及產(chǎn)物的大小編寫。常規(guī)PCR擴增在Bio-RadMycycler梯度擴增儀上進行，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合凝膠成像系統(tǒng)檢測所得到的PCR產(chǎn)物。2.3結(jié)果2.3.1錦鯉皰疹病毒Ⅲ型A.常規(guī)PCR測試錦鯉皰疹病毒Ⅲ型及設(shè)計的引物設(shè)計的三對引物序列如下：TK-Ⅰ上游引物TK-Ⅰ-F：5’-GCTATGCTGGAACTGGT-3'；下游引物TK-Ⅰ-R：5’-GCCACCTTGGAVTCTTCG-3'；TK-Ⅱ上游引物TK-Ⅱ-F：5’-GCCCTACGCCTCTCTTTA-3'；下游引物TK-Ⅱ-R：5’-GCAGCTCTCTGTGCTCTT-3'；TK-Ⅲ上游引物TK-Ⅲ-F：5’-CGCCTCTCTTTATCTCGC-3'；下游引物TK-Ⅲ-R：5’-CTCTCTGTGCTCTTGCCC-3'。從圖1可以看出，對于錦鯉皰疹病毒Ⅲ型，所設(shè)計的三對引物均可擴增出靶標條帶，表明所用錦鯉皰疹病毒Ⅲ型、自行設(shè)計的引物以及使用的PCR擴增體系均可用于后續(xù)的實驗。B.常規(guī)PCR檢測體系的特異性對于常見的三種非靶標魚類致病病毒，使用建立的常規(guī)PCR檢測體系均檢測為陰性，對錦鯉皰疹病毒Ⅲ型檢測為陽性，這表明所建立的常規(guī)PCR檢測體系具有極好的特異性，可以用于錦鯉皰疹病毒Ⅲ型的快速檢測(如圖2所示)。3、引物PCR擴增效率檢測引物的篩選原則為：在目的基因區(qū)域中選擇PCR擴增效率較高的引物作為候選引物。3.1陽性對照物及標準模板的制備用建立的常規(guī)PCR體系擴增錦鯉皰疹病毒Ⅲ型的TK基因片段，2％瓊脂糖凝膠電泳分離得到特定的靶標條帶。用干凈的手術(shù)刀切下包含靶標條帶的凝膠，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)回收靶標DNA。將回收的部分DNA加入到連接體系中(10μL，含線性克隆載體、連接酶和連接酶buffer)，16℃連接過夜。次日，將全部的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到制備好的大腸桿菌感受態(tài)，并涂布于含有氨芐青霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)。挑取菌落并制備成菌懸液，使用載體引物及菌落PCR驗證并挑選陽性克隆子。將陽性克隆子對應(yīng)的細菌于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，并取1mL提取質(zhì)粒DNA(普通質(zhì)粒小提試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司)，從而得到陽性對照質(zhì)粒。測定提取的質(zhì)粒DNA的濃度，稀釋到一定倍數(shù)作為陽性對照質(zhì)粒用于PCR檢測。3.2引物PCR擴增效率檢測引物的篩選原則為：在目的片段區(qū)中選擇PCR擴增效率較高的引物作為候選引物。3.2.1梯度模板準備將陽性對照質(zhì)粒(上述3.1所得)，用無菌水以10倍梯度稀釋，作為熒光定量PCR反應(yīng)體系優(yōu)化用模板。取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀釋度，編號依次對應(yīng)為L1、L2、L3、L4、L5。分裝后于-80℃保存?zhèn)溆谩?.2.2熒光定量PCR緩沖液及PCR程序PCR反應(yīng)體系為：10pmol/μL的上游引物2.0μL，10pmol/μL的下游引物2.0μL，樣品DNA5μL，5U/μLTaqDNA聚合酶0.6μL，2.9μLDEPC水，2×進口實時熒光PCR緩沖液12.5μL；所述12.5μL的2×進口實時熒光PCR緩沖液是2.5μL的ThermoFisher公司的10×buffer、2μL的10mMdNTP、0.0025μL的10000×SYBRgreenI以及8μLDEPC水的混合物；所述PCR反應(yīng)條件為：95℃3min；95℃10sec，55℃20sec，72℃20sec，75℃5sec，共45個循環(huán)。結(jié)果如表2所示。表2不同引物擴增效率引物10-410-510-610-710-8擴增效率TK-I21.923.426.929.232.3137.7％TK-II20.923.226.329.933.8103.1％TK-III20.923.826.229.533.9106.8％注：表格中注明值為Ct值。根據(jù)擴增效率來看，選擇II號引物對TK-II-F/TK-II-R繼續(xù)后續(xù)實驗(熒光定量選擇引物的標準是，越接近100％，越好)。實施例2熒光定量PCR引物用量的優(yōu)化1、熒光定量PCR引物用量的第一次優(yōu)化用稀釋好的L1(10-4)和L2(10-5)陽性對照質(zhì)粒作為引物量優(yōu)化的模板，分別對引物的上下游的用量進行梯度優(yōu)化，引物工作液濃度10pmol/μL，PCR反應(yīng)體系為：上下游引物量見表3，樣品DNA5μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.6μL，實時熒光PCR緩沖液(2×)12.5μL(2.5μL的ThermoFisher公司的10×buffer2.5μL，2μL的10mMdNTP以及的10000×SYBRgreenI0.0025μL和8μLDEPC水的混合物配制而成)，補充無菌水至25μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃3min；95℃10sec，55℃20sec，72℃20sec，75℃5sec,readplate共45個循環(huán)。結(jié)果如表3所示，從結(jié)果可以分析出，PCR引物在以下梯度組合可以正常工作，其中引物組合(2.5μL×10pmol/μL、2.5μL×10pmol/μL)、(2.0μL×10pmol/μL、2.0μL×10pmol/μL)、(1.5μL×10pmol/μL、1.5μL×10pmol/μL)反應(yīng)效率最高，將上游引物量1.5-2.0μL×10pmol/μL、下游引物量1.5-2.0μL×10pmol/μL作為引物用量進行第二次篩選。表3實時熒光定量PCR引物用量的第一次優(yōu)化結(jié)果注：表格中注明值為Ct值，“1.0、1.5、2.0、2.5”為25μLPCR體系中引物(濃度為10pmol/μL)的用量(μL)。2、熒光定量PCR引物用量的第二次優(yōu)化為測試不同引物用量組合對于試劑靈敏度的影響，選用濃度更低的DNA模板進行測試。使用陽性對照質(zhì)粒(實施例l中擴增得到)進行梯度稀釋取L3(10-6)、L4(10-7)，L5(10-8)作為第二次引物量優(yōu)化的模板，對各組引物在第一次優(yōu)化基礎(chǔ)上進一步進行優(yōu)化。PCR反應(yīng)體系為：上下游引物量見表4，樣品DNA5μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.6μL，實時熒光PCR緩沖液(2×)12.5μL(用購自ThermoFisher公司的10×buffer2.5μL，2μL的10mMdNTP以及的10000×SYBRgreenI0.0025μL和8μLDEPC水的混合物配制而成)，補充無菌水至25μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃3min；95℃10sec，55℃20sec，72℃20sec，75℃5sec，readplate共45個循環(huán)。結(jié)果如表4所示，本次優(yōu)化上游引物在2.0μL，下游引物在2.0μL時檢測結(jié)果較好，選擇此體積為本發(fā)明實時熒光定量PCR引物的使用體積。表4實時熒光定量PCR引物用量的第二次優(yōu)化結(jié)果注：表格中注明值為Ct值，“1.5、2.0”為25μLPCR體系中引物(濃度為10pmol/μL)的用量(μL)以上優(yōu)化結(jié)果表明，本發(fā)明錦鯉皰疹病毒Ⅲ型實時熒光定量PCR檢測試劑的基本組成和各組分含量基本如表5所示。表5錦鯉皰疹病毒Ⅲ型實時熒光定量PCR檢測試劑的基本組成和各組分含量組份規(guī)格用量實時熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液2X12.5μLDNA模板5μL引物用量10pmol/μL上游2.0μL，下游2.0μLTaqDNA聚合酶5U/μL0.6μL無菌水補充至25μL實施例3錦鯉皰疹病毒Ⅲ型TK基因熒光定量PCR檢測1、標準曲線的建立將陽性對照質(zhì)粒DNA作為模板進行熒光定量PCR檢測，建立標準曲線。具體操作如下：將質(zhì)粒DNA進行10倍系列稀釋成I：1.0×106拷貝/μL；II：1.0×105拷貝/μL；III：1.0×104拷貝/μL；Ⅳ：1.0×103拷貝/μL；V：1.0×102拷貝/μL；Ⅵ：1.0x101拷貝/μL；Ⅶ：1.0×100拷貝/μL。每個稀釋度重復(fù)平行試驗3次。標準品檢測PCR反應(yīng)體系為：上游引物2.0μL(10pmol/μL)，下游引物2.0μL(10pmol/μL)，質(zhì)粒DNA5μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.6μL，實時熒光PCR緩沖液(2×)12.5μL(用購自ThermoFisher公司的10×buffer2.5μL，2μL的10mMdNTP以及的10000×SYBRgreenI0.0025μL和8μLDEPC水的混合物配制而成)，補充無菌水至25μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃3min；95℃10sec，55℃20sec，72℃20sec，75℃5sec，readplate共45個循環(huán)。標準品實時熒光定量PCR擴增曲線如圖3所示(圖3，橫坐標為Ct值，縱坐標為相對熒光單位，1：1.0×106拷貝/μL；2：1.0×105拷貝/μL；3：1.0×104拷貝/μL；4：1.0×103拷貝/μL；5：1.0×102拷貝/μL；6：1.0x101拷貝/μL；7：1.0x100拷貝/μL。)2、標準曲線的繪制根據(jù)所得Ct值與其對應(yīng)的標準品的對數(shù)值繪制標準曲線，實時熒光定量PCR檢測陽性對照質(zhì)粒線性范圍是1×105～1×100拷貝/μL反應(yīng)體系，標準曲線的相關(guān)系數(shù)R平方值為0.990(y＝-3.25x+36.57)，熒光定量PCR反應(yīng)的擴增效率為103.1％。標準曲線顯示：本發(fā)明建立的錦鯉皰疹病毒Ⅲ型TK區(qū)基因?qū)崟r熒光定量PCR檢測方法有6個數(shù)量級的線性檢測范圍，進一步說明該檢測方法具有非常高的靈敏度。3、實時熒光定量PCR法檢測10份魚類樣本3.1提取魚取樣組織的DNA采集了3份患病的錦鯉及7份健康錦鯉樣品，使用chelex-100(Bio-Rad)煮沸法快速提取DNA。方法如下：取一小塊肝臟組織，加入200μLMilliporeH2O，搗爛，取出沒有搗爛的組織塊，剩余渾濁液12000rpm離心1min，棄上清，加入200μLMilliporeH2O重懸。充分混勻后取50μL加入到200μL6％的chelex-100中，混勻，56℃保溫20min，劇烈震蕩混勻后于100℃保溫8min，劇烈震蕩，并于12000rpm離心3min，取上清作為PCR的模板，用建立的常規(guī)PCR檢測體系進行檢測。剩余的模板于-20℃保存以備復(fù)檢。3.2用實施例1，2中建立的方法檢測病魚DNA樣本病魚檢測PCR反應(yīng)體系為：上游引物2.0μL(10pmol/μL)，下游引物2.0μL(10pmol/μL)，質(zhì)粒DNA5μL，5U/μLTaqDNA聚合酶0.6μL，2.9μLDEPC水，2×進口實時熒光PCR緩沖液的12.5μL；12.5μL的2×進口實時熒光PCR緩沖液是2.5μL的ThermoFisher公司的10×buffer，2μL的10mMdNTP、10000×SYBRgreenI0.0025μL以及8μLDEPC水的混合物配制而成。PCR反應(yīng)條件為：95℃3min；95℃10sec，55℃20sec，72℃20sec，75℃5sec，readplate共45個循環(huán)。標準品實時熒光定量PCR擴增曲線如圖4所示(圖4，橫坐標為Ct值，縱坐標為熒光值)，結(jié)果顯示：以3份患病DNA為模板時出現(xiàn)目的熒光擴增曲線，以其余7份健康錦鯉樣品DNA為模板時無擴增曲線。實施例4錦鯉皰疹病毒Ⅲ型TK基因熒光定量PCR檢測試劑盒錦鯉皰疹病毒Ⅲ型TK區(qū)基因熒光定量PCR檢測試劑盒包括各自獨立包裝的錦鯉皰疹病毒Ⅲ型反應(yīng)液1mL/管和Taq聚合酶(5U/μL，每個反應(yīng)0.6μL)30μL/管，兩試劑管再共同組裝在一外包裝盒中。其中，錦鯉皰疹病毒Ⅲ型反應(yīng)液含有dNTPs、MgC12、SYBRgreenI及引物混合液，由12.5μL的2×buffer(用購自ThermoFisher公司的10×buffer2.5μL，2μL的10mMdNTP以及的10000×SYBRgreenI0.0025μL和8μLDEPC水的混合物配制而成)、實施例2確定的組合2.0μL上游引物、2.0μL下游引物和2.9μL的無菌水水按比例混合，配制時將每一組分乘以一個系數(shù)(如10000，根據(jù)生產(chǎn)量定)，混勻后，分裝，每支1mL為方便檢測，試劑盒包括另外各自獨立包裝的強陽性對照質(zhì)粒(10-5稀釋度的陽性對照質(zhì)粒L2)、臨界陽性對照質(zhì)粒(10-8稀釋度的陽性對照質(zhì)粒L5)、DNA提取液(配方為：chelex-100)及陰性對照品(無菌水)，并與錦鯉皰疹病毒Ⅲ型反應(yīng)液和Taq聚合酶試劑管共同組裝在外包裝盒中。PCR反應(yīng)體系：上游引物2.0μL(10pmol/μL)，下游引物2.0μL(10pmol/μL)，樣品DNA5μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.6μL，實時熒光PCR緩沖液(2×)12.5μL(用購自ThermoFisher公司的10×buffer2.5μL，2μL的10mMdNTP以及的10000×SYBRgreenI0.0025μL和8μLDEPC水的混合物配制而成)，補充無菌水至25μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃3min；95℃10sec，55℃20sec，72℃20sec，75℃5sec，readplate共45個循環(huán)。結(jié)果表明(表6，經(jīng)過5次重復(fù)測定結(jié)果比較穩(wěn)定，確定為本發(fā)明試劑盒的陽性對照。表6陽性對照的測試結(jié)果重復(fù)12345L223.823.523.723.523.9L533.133.533.433.833.3實施例5：錦鯉皰疹病毒Ⅲ型TK基因熒光定量PCR檢測試劑盒的性能評估為對本發(fā)明試劑盒的性能進行評估，按照產(chǎn)品優(yōu)化后的工藝多次配制出產(chǎn)品小樣對試劑盒的靈敏度、特異性、精確度、穩(wěn)定性以及用試生產(chǎn)的產(chǎn)品進行臨床試驗，以考查產(chǎn)品的性能。1、試劑盒檢測的線性范圍和靈敏度測試將錦鯉皰疹病毒Ⅲ型TK區(qū)基因人工構(gòu)建質(zhì)粒pMD-18T-TK-II用DEPC水稀釋液進行10倍系列梯度稀釋至10-9，即靈敏度質(zhì)控品。取L1(10-4稀釋度)、L2(10-5稀釋度)、L3(10-6稀釋度)、L4(10-7稀釋度)、L5(10-8稀釋度)、L6(10-9稀釋度)作為評價試劑盒靈敏度的質(zhì)控品，編號L1-L6，分裝后于-80℃保存?zhèn)溆?。使用本發(fā)明試劑盒進行檢測。PCR反應(yīng)體系：上游引物2.0μL(10pmol/μL)，下游引物2.0μL(10pmol/μL)，樣品DNA5μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.6μL，實時熒光PCR緩沖液(2×)12.5μL(用購自ThermoFisher公司的的10×buffer2.5μL，2μL的10mMdNTP以及的10000×SYBRgreenI0.0025μL和8μLDEPC水的混合物配制而成)，補充無菌水至25μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃3min；95℃10sec，55℃20sec，72℃20sec，75℃5sec，readplate共45個循環(huán)。結(jié)果(表7)顯示，在10-8稀釋度(L5)時試劑盒多數(shù)情況下均可檢出。對不同批次的產(chǎn)品小樣進行靈敏度及線性分析，結(jié)果顯示引物均可穩(wěn)定測出10-8稀釋度的陽性對照質(zhì)粒DNA樣品，對于10-9稀釋度樣品，本發(fā)明試劑盒不能檢出，所以本發(fā)明試劑盒最低可檢出含10-8稀釋度的人工構(gòu)建質(zhì)粒，具有較高的靈敏度。故設(shè)10-8稀釋度為最低檢出值。表7本發(fā)明試劑盒線性范圍的測試結(jié)果稀釋梯度10-410-510-610-710-810-9Ct值20.423.326.729.933.7NoCt2、試劑盒檢測的特異性分析采用不同批次的產(chǎn)品小樣對三種主要魚類致病病毒(錦鯉皰疹病毒Ⅰ型，錦鯉皰疹病毒Ⅱ型，鯉春病毒血癥病毒)進行檢測。PCR反應(yīng)體系：上游引物2.0μL(10pmol/μL)，下游引物2.0μL(10pmol/μL)，樣品DNA5μL，5U/μLTaqDNA聚合酶0.6μL，2.9μLDEPC水，2×進口實時熒光PCR緩沖液的12.5μL；12.5μL的2×進口實時熒光PCR緩沖液是ThermoFisher公司：2.5μL10×buffer，2μL10mMdNTP、10000×SYBRgreenI0.0025μL以及8μLDEPC水的混合物配制而成。PCR反應(yīng)條件為：95℃3min；95℃10sec，55℃20sec，72℃20sec，75℃5sec，readplate共45個循環(huán)。結(jié)果(表8)N1-N3均未檢出Ct值，證明本發(fā)明的試劑盒具有良好的特異性。表8本發(fā)明試劑盒特異性的測試結(jié)果樣品N1N2N3Ct值NoCtNoCtNoCt3、試劑盒批內(nèi)檢測的精密性使用精密性質(zhì)控品(將人工構(gòu)建的陽性對照質(zhì)粒pMD-18T-TK-II稀釋至1.0×10-5作為精密性質(zhì)控品用于對陽性對照檢測試劑盒的質(zhì)量控制。對反應(yīng)體系分別進行10次重復(fù)檢測，PCR反應(yīng)體系：上游引物2.0μL(10pmol/μL)，下游引物2.0μL(10pmol/μL)，樣品DNA5μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.6μL，實時熒光PCR緩沖液(2×)12.5μL(用購自ThermoFisher公司的10×buffer2.5μL，2μL的10mMdNTP以及10000×SYBRgreenI0.0025μL和8μLDEPC水的混合物配制而成)，補充無菌水至25μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃3min；95℃10sec，55℃20sec，72℃20sec，75℃5sec,readplate共45個循環(huán)。10個精密度質(zhì)控品Ct值的CV％<10％(表9)，證明本發(fā)明的試劑盒具有良好的精密性。表9本發(fā)明試劑盒的精密度測試結(jié)果樣品1245678910CV％Ct值23.223.723.123.423.323.923.723.823.31.24、試劑盒的準確性測定采用測序方法進行確認本發(fā)明試劑盒的準確性。對擴增產(chǎn)物進行測序，序列與預(yù)期結(jié)果完全一致，證明本發(fā)明試劑盒的檢測結(jié)果是準確的。5、試劑盒的穩(wěn)定性測定5.1試劑盒的穩(wěn)定性產(chǎn)品的穩(wěn)定性取決于各個組成成份的穩(wěn)定性。本發(fā)明中配制實時熒光定量PCR反應(yīng)液、TaqDNA聚合酶、陽性對照，在-20℃保存，取出后一直保存至4℃冰箱，最長保存一周仍未見性能下降。在為臨床試驗準備的產(chǎn)品運輸中，全套產(chǎn)品(包括實時熒光定量PCR反應(yīng)液、TaqDNA聚合酶、試劑盒陽性對照)，在先后經(jīng)歷為期3天的-20℃冷凍、4℃長途運輸、-20℃冷凍、復(fù)融等一系列往返過程后，使用質(zhì)控品檢測，檢測結(jié)果未見有顯著差異。表明本發(fā)明試劑盒的各組份相當穩(wěn)定。5.2對照品的穩(wěn)定性對照品的穩(wěn)定性對試驗結(jié)果的分析判斷有很大影響，本試劑盒的對照品主要是對反應(yīng)體系進行質(zhì)量控制。本試劑盒使用了一份強陽性對照、一份臨界陽性和一份陰性對照，對其進行凍融檢測。實驗結(jié)果如表10所示，結(jié)果表明本發(fā)明試劑盒中的對照品也具有良好的穩(wěn)定性。表10陽性對照品的凍融試驗結(jié)果凍融次數(shù)陽性對照的CT值臨界陽性對照的CT值陰性對照的CT值123.533.2NoCt223.933.7NoCt323.833.8NoCt423.633.5NoCt523.333.8NoCt623.833.1NoCt723.433.6NoCt823.633.3NoCt最后應(yīng)當說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。當前第1頁1 2 3