專利名稱：作為載體的非人皰疹病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作為載體的動物病毒例如動物皰疹病毒，該載體用作將異源基因和核酸診斷性、治療性和預(yù)防性地分別遞送給動物、人或其來源的原代細(xì)胞。通過使用該載體，可以實現(xiàn)感染性、自身免疫性和腫瘤疾病以及變態(tài)反應(yīng)和遺傳性疾病的預(yù)防和治療。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用重組動物病毒在體外和在體內(nèi)有效轉(zhuǎn)導(dǎo)原代人類細(xì)胞的過程。
馬皰疹病毒1型(EHV-1)，α皰疹病毒科的一個成員(EHV-1是一種α皰疹病毒)，水痘病毒屬，通常感染馬和馬或嚙齒動物來源的細(xì)胞，和在其中復(fù)制。通常，病毒所誘導(dǎo)的疾病很輕微，并且全世界大約90％的馬帶有這一動因，其在動物身上終生存在。臨床癥狀是輕微的呼吸道疾病、在母馬中很少見的流產(chǎn)、和神經(jīng)疾病。
EHV-1的一個株，Ab4p的完整DNA序列已被確定。EHV-1是迄今為止確定的八種馬皰疹病毒中的一個。EHV-1和它的最近的親屬EHV-4是水痘病毒屬的成員，與EHV-3和EHV-5至EHV-8一樣，屬于α皰疹病毒科。EHV-2和EHV-5是γ皰疹病毒科，在馬種群中分布廣泛。無論考慮到它們的組織特異性、基因組組成，還是基因功能，EHV-1、-4、-3、-5和-8都被認(rèn)為是在親緣上最接近的。EHV-2和EHV-8雖然屬于γ皰疹病毒科，但與EHV-1、-4、-3、-5和-8在整體基因組組成、同時也在基因功能的許多細(xì)節(jié)上有相似之處。
皰疹病毒通過將它們的被膜與質(zhì)膜融合而進(jìn)入靶細(xì)胞。糖蛋白在這些感染的早期階段、同時也在病毒體從被感染細(xì)胞外出(egress)中、和在直接的細(xì)胞到細(xì)胞傳播(cell-to-cell spread)(ctcs)中發(fā)揮決定性作用。到目前為止，在單純皰疹病毒1型(HSV-1)—原型α皰疹病毒—中，已確定出11種糖蛋白，命名為gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL和gM3。對核苷酸和相應(yīng)氨基酸序列的比較顯示所有已知HSV-1糖蛋白基因在EHV-1中都是保守的。EHV-1糖蛋白根據(jù)HSV-1糖蛋白所用的命名加以命名，但EHV-1還編碼另外一種被膜蛋白，稱為gp2，以及一種是HSV-1的VP13/14同系物的間層蛋白，有報道該間層蛋白是被糖基化的。雖然α皰疹病毒在遺傳上彼此具有緊密的親緣關(guān)系、表達(dá)相似的基因、通過同等的機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞，參與這一過程、此外參與外出和ctcs的蛋白質(zhì)卻相當(dāng)不同。例如，gD對HSV-1、EHV-1和牛皰疹病毒1型(BHV-1)的進(jìn)入和ctcs是絕對必需的，然而它在水痘病毒屬的原型成員—水痘帶狀皰疹病毒(VZV)—中卻不存在。病毒進(jìn)入的主要步驟可以區(qū)分成(i)肝素敏感和肝素不敏感的附著，和(ii)病毒被膜與靶細(xì)胞質(zhì)膜融合。肝素敏感的附著，即病毒被膜與細(xì)胞表面的糖胺聚糖相互作用所介導(dǎo)的初級附著，在許多α皰疹病毒，例如假狂犬病病毒(PRV)、HSV-1、EHV-1中是由gC帶來的。在病毒被膜和質(zhì)膜很可能都發(fā)生構(gòu)象變化后，跟著發(fā)生穩(wěn)定附著，該穩(wěn)定附著是由gD與細(xì)胞受體之間的相互作用所帶來的。在α皰疹病毒，包括EHV-1中，這一步驟是通過涉及至少gB、gD、和gH-gL復(fù)合體的過程所介導(dǎo)的。然而，融合以及融合孔形成的確切機(jī)制仍然是個謎，并且到目前為止無法鑒別出“融合肽”。糖蛋白似乎也決定—至少部分地決定—α皰疹病毒有限的體內(nèi)宿主向性，即，動物皰疹病毒不能感染與它們協(xié)同進(jìn)化的宿主之外的物種。
近年來，通過引入細(xì)菌人工染色體(BAC)克隆和誘變，已便利了大的皰疹病毒基因組的操作。使用這一技術(shù)，幾種皰疹病毒、包括EHV-1的基因組已作為BAC而加以克隆。對作為BAC而加以克隆的皰疹病毒基因組進(jìn)行定向和隨機(jī)誘變的快速草案已被使用，誘變不再依賴于病毒在真核細(xì)胞中的生長，而可在大腸桿菌中進(jìn)行。
可能在人類基因治療或免疫中使用的幾種載體已被描述。其中有RNA和DNA病毒。最通常使用的載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒、彈狀病毒、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、和包括HSV-1在內(nèi)的人皰疹病毒，和人巨細(xì)胞病毒(HCMV)。與RNA病毒、腺病毒或AAV相關(guān)的問題在于它們包裝異源DNA的能力有限，這些異源DNA通常被限制在在長度＜5kbp的DNA。此外，有效轉(zhuǎn)導(dǎo)人類細(xì)胞需要極高的腺病毒或AAV效價，這也解釋了在病人中過敏性或毒性反應(yīng)的風(fēng)險。人類皰疹病毒可包裝大?。?00kbp的DNA，RNA病毒、腺病毒或AAV系統(tǒng)固有的低包裝能力的局限性可通過使用HSV-1、EBV或HCMV而加以克服。然而，使用人類病毒的一個主要不利之處在于這一事實，即大多數(shù)病人已經(jīng)遭遇了用這些病毒所進(jìn)行的感染和/或接種。
因此，本發(fā)明的問題是提供新的載體系統(tǒng)，用來使得成功的基因治療途徑成為可能、和用來建立新的和有效的免疫計劃。
本發(fā)明的問題通過權(quán)利要求所定義的主題加以解決。
通過參考附隨的附圖可以更容易地理解本發(fā)明。
附圖簡述

圖1示意性地闡明EHV-1 RacH BAC(pRacH)的構(gòu)建。所顯示的是大約150kbp RacH基因組的組織(A)。描繪了帶有和不帶有插入的BAC序列的RacH基因組獨(dú)特短區(qū)域的基因組組織(B)。給出了按bp或kbp的比例和限制酶位點(diǎn)。B，BamHI；H，HindIII；K，KpnI；P，PacI；S，SphI；S1，SalI。
圖2顯示在每個細(xì)胞加入一個感染單位的HΔgp2后，人(MT4，MEWO，HuH7)、豬(PK15)和牛(MDBK)細(xì)胞系的熒光分析。在90％以上的細(xì)胞中檢測到GFP表達(dá)，而不依賴于細(xì)胞類型。在HΔgp2感染的HuH7和MDBK細(xì)胞中觀察到多核體的形成。
圖3顯示轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的流式細(xì)胞計量術(shù)數(shù)據(jù)。所顯示的是用EHV-1 HΔgp2接種(0.5感染單位/細(xì)胞)24小時后，Con A刺激的牛和豬PBMC的點(diǎn)制圖分析。與用模擬品接種的細(xì)胞相比，可分別在8.1％的被刺激的牛PBMC中、和在7.5％的被刺激的豬PBMC中檢測到GFP表達(dá)。
圖4同樣顯示轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的流式細(xì)胞計量術(shù)數(shù)據(jù)。所顯示的是用EHV-1HΔgp2或BHV-1ΔgE接種細(xì)胞(0.5感染單位/細(xì)胞)24小時后，Con A刺激的人PBMC的點(diǎn)制圖分析。雖然用HΔgp2轉(zhuǎn)導(dǎo)后18.5％的細(xì)胞GFP表達(dá)呈陽性，BHV-1ΔgE接種的PBMC中只有不到0.5％顯示出綠色熒光。
圖5顯示在用EHV-1 HΔgp2接種(0.5感染單位/細(xì)胞)24小時后，ConA刺激的人PBMC的流式細(xì)胞計量術(shù)分析。接種后，細(xì)胞通過用CD3-、CD4-、CD8-、或CD11b特異的單克隆抗體和ALEXA 546(Molecular Probes)第二山羊抗小鼠IgG偶聯(lián)物進(jìn)行間接免疫熒光來進(jìn)行染色。對CD3-、CD4-、CD8-、或CD11b呈陽性的細(xì)胞簇用紅色熒光通道進(jìn)行門化(gated)，在綠色熒光通道分析GFP表達(dá)。通過直方圖分析，13.2％-22.9％之間的被分析PBMC群體的GFP表達(dá)呈陽性。發(fā)綠色熒光的CD4+和CD8+T細(xì)胞的百分比事實上是一樣的。
圖6描繪了在用EHV-1 HΔgp2接種(0.5感染單位/細(xì)胞)24小時后，人CD4+MT4細(xì)胞的流式細(xì)胞計量術(shù)直方圖分析。與用模擬品轉(zhuǎn)導(dǎo)的對照細(xì)胞相比，用HΔgp2接種的MT4細(xì)胞中大約74％對GFP的表達(dá)呈陽性。
圖7鼻內(nèi)施用1×104IU/小鼠后，在第2天在鼠肺中的GFP表達(dá)。(A)肺被除去，立即對GFP表達(dá)進(jìn)行原位掃描。放大倍率為100X。(B)將肺在液氮中休克冷凍(shock-freezing)后制備小鼠肺的薄切片。讓肺不固定和不染色，以維持GFP表達(dá)。上圖顯示在下圖中所顯示的在熒光顯微鏡下的視野的光鏡圖像。注意GFP在細(xì)支氣管(箭頭)和肺泡(箭頭)細(xì)胞中的表達(dá)。放大倍率為200X。
在此所用的術(shù)語“異源動物”指一種動物或其細(xì)胞群體，雖然它不是病毒的天然或終末(dead-end)宿主，但卻可被根據(jù)本發(fā)明的載體加以感染。
在此所用的術(shù)語“載體”指一種病毒或其衍生物，該病毒或其衍生物能將核酸轉(zhuǎn)移給動物和人或自其中分離的細(xì)胞群體。
在此所用的術(shù)語“復(fù)制缺陷型EHV”指一種以EHV為基礎(chǔ)的載體，它已在遺傳上，例如通過對病毒復(fù)制所必需的基因組序列加以缺失，而被加以修飾，在某種意義上它不再在通常的例如馬或嚙齒類動物來源的允許細(xì)胞或細(xì)胞系中復(fù)制。
在此所用的術(shù)語“可復(fù)制病毒”指一種重組病毒，其在允許細(xì)胞系或原代細(xì)胞中是具有復(fù)制能力的。
本發(fā)明涉及動物病毒在治療性、預(yù)防性或診斷性基因遞送目的中的用途，該動物病毒不將人類作為其天然或終末宿主。這樣的病毒可以在如下病毒所組成的不具有限制作用的組中找到雙RNA病毒(例如IBDV，傳染性法氏囊病病毒)、Mononegavirales(例如新城疫病毒)、痘病毒(例如副痘、山羊痘、禽痘)、冠狀病毒(例如傳染性胃腸炎病毒，TGEV；禽傳染性支氣管炎，AIB)、腺病毒(牛、豬、犬腺病毒)和皰疹病毒(馬皰疹病毒，EHV)。本發(fā)明因此旨在探索這樣的動物病毒，特別是動物皰疹病毒，并且更特別是馬皰疹病毒例如EHV-1，作為在異源物種，包括人，中的通用載體的用途的可能性。令人驚訝的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，動物皰疹病毒在多種多樣的異源細(xì)胞，包括體外以及體內(nèi)原代人類細(xì)胞中，在極低的顆粒數(shù)目時展現(xiàn)出高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。值得注意的是，這一特征與其他那些特征同時存在，即(i)與大多數(shù)動物病毒一樣，EHV不在非天然宿主的異源生物，例如人類細(xì)胞，中復(fù)制；(ii)EHV固有地不誘導(dǎo)長期持久的體液免疫應(yīng)答，此外(iii)重組EHV來源的載體可被構(gòu)建，該載體在轉(zhuǎn)導(dǎo)的或感染的細(xì)胞中不表達(dá)單個的EHV蛋白，和(iv)針對大多數(shù)相關(guān)人類皰疹病毒呈現(xiàn)高抗體效價的人血清不中和EHV，這使得設(shè)計EHV來源的載體和基因遞送策略成為可能，這樣的遞送策略允許體外和體內(nèi)高度有效的和重復(fù)的基因遞送。與此同時，這樣的策略幫助避免對受者引入載體免疫和另外的不利副作用，例如毒性、過敏性或自身免疫反應(yīng)。根據(jù)優(yōu)選的病毒/細(xì)胞組合，皰疹病毒是EHV-1，細(xì)胞是原代人類細(xì)胞。更優(yōu)選地，重組EHV-1被用作在體內(nèi)將基因遞送給人類的載體。
根據(jù)本發(fā)明，提供了允許對異源動物和人遞送基因的載體系統(tǒng)。
本發(fā)明的一個令人驚訝的方面是涉及這一事實，即EHV能在體外和在體內(nèi)進(jìn)入和有效轉(zhuǎn)導(dǎo)來自不同物種和原代組織的各種各樣的細(xì)胞。因此，除了感染各種細(xì)胞系之外，發(fā)明人能證實脊椎動物來源，包括鳥類，的原代細(xì)胞的感染，例如雞和鵪鶉、牛、豬、犬、貓和人類細(xì)胞。
本發(fā)明的另一出人意料的方面涉及這一事實，即EHV以極高效率進(jìn)入事實上所測試的每一種細(xì)胞類型，包括人類細(xì)胞，并且將標(biāo)記物基因例如增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(EGFP)引入目的細(xì)胞只需要相當(dāng)于大約100個顆粒/每細(xì)胞的不到一個感染單位。這一方面對均衡最佳基因遞送并在同時降低載體免疫的引入是至關(guān)重要的。
本發(fā)明的另一出人意料的發(fā)現(xiàn)在于這一事實，即EHV介導(dǎo)的基因，例如EGFP，向PBMC的遞送的效率可通過或者特異性地刺激PBMC、或者用促分裂原，例如Con A進(jìn)行非特異性刺激而顯著增加。
本發(fā)明的另一方面涉及這一事實，即在用表達(dá)EGFP的重組EHV感染后，在原代刺激的、同時也在非刺激的外周血細(xì)胞中，標(biāo)記物轉(zhuǎn)基因可有效地和在長持續(xù)時間內(nèi)表達(dá)。
本發(fā)明的另一令人驚訝的方面涉及這一事實，即在細(xì)胞例如人CD4+細(xì)胞系MT4中，幾次連續(xù)傳代后，標(biāo)記物轉(zhuǎn)基因表達(dá)仍被相對穩(wěn)定地保持，而不需要子代病毒的從頭(de novo)生產(chǎn)，這一點(diǎn)已被在被感染細(xì)胞上清中沒有傳染性子代的條件下EGFP仍長時間表達(dá)所證實。這些細(xì)胞似乎不被EHV所溶解，并明顯抗拒生產(chǎn)性病毒復(fù)制，生產(chǎn)性病毒復(fù)制這一現(xiàn)象最有可能是由EHV基因組在某些非允許細(xì)胞中的附加型(episomal)和穩(wěn)定保持所引起的。
另一個出人意料的發(fā)現(xiàn)是在人體內(nèi)，包括在與該介質(zhì)持續(xù)接觸的實驗室人員中，缺乏中和性抗EHV-1抗體，同時缺乏由針對相關(guān)人類病毒的高效價抗血清所帶來的交叉中和，該相關(guān)人類病毒例如α皰疹病毒組如HSV-1和2、β皰疹病毒如人巨細(xì)胞病毒(HCMV)和γ皰疹病毒如EB病毒中的重要成員，這兩個發(fā)現(xiàn)代表了將重組EHV有效用作在人體內(nèi)免疫和基因治療應(yīng)用的新載體的前提條件。另一個發(fā)現(xiàn)是，EHV能在體內(nèi)有效轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠肺細(xì)胞。鼻內(nèi)滴注低劑量EHV后，可在超過12天的時間里檢測到EGFP的表達(dá)。EHV的這些特性使得這一系統(tǒng)，例如，易于在小動物模型中在體內(nèi)測試潛在的治療應(yīng)用。
另一令人驚訝的方面在于這一事實，即把以EHV為基礎(chǔ)的載體體內(nèi)投藥僅誘導(dǎo)非常溫和和持續(xù)時間很短的體液應(yīng)答，這使得重復(fù)施用成為可能，而不會導(dǎo)致轉(zhuǎn)導(dǎo)或免疫效率的顯著喪失。
總言之，以EHV為基礎(chǔ)的載體與目前所使用的載體相比具有多種優(yōu)勢，這些目前所使用的載體源自在人體內(nèi)復(fù)制或至少用人體作為其終末宿主的病毒。考慮到這些方面以及EHV在理論上的包裝能力，并考慮到以下事實，即表達(dá)異源基因或包含異源核酸的安全載體可通過引入條件性致死突變株而構(gòu)建，該條件性致死突變株只能在補(bǔ)充/包裝(complementing/packaging)細(xì)胞系上擴(kuò)增，根據(jù)本發(fā)明的EHV載體系統(tǒng)可以幾種不同方式被利用。
因此，本發(fā)明的一個目的涉及重組動物病毒，優(yōu)選雙RNA病毒(例如IBDV，傳染性法氏囊病病毒)、Mononegavirales(例如新城疫病毒)、痘病毒(例如副痘、山羊痘、禽痘)、冠狀病毒(例如傳染性胃腸炎病毒，TGEV；禽傳染性支氣管炎，AIB)、腺病毒(牛、豬、犬腺病毒)和皰疹病毒(馬皰疹病毒，EHV如EHV-1)，該病毒在自然狀態(tài)下不以人作為宿主，在原代細(xì)胞中具有復(fù)制能力或復(fù)制缺陷，并具有在體外以小于1的MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)原代細(xì)胞的能力，所述原代細(xì)胞來自并非病毒的天然宿主的生物。優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的重組動物病毒進(jìn)一步具有在體內(nèi)以顆粒數(shù)目在大約166-108pfu的范圍內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的能力。優(yōu)選原代細(xì)胞源自人類。根據(jù)本發(fā)明的重組動物病毒優(yōu)選包含轉(zhuǎn)基因。
本發(fā)明的另一個方面涉及根據(jù)本發(fā)明的重組動物病毒作為藥物或診斷試劑或疫苗，優(yōu)選作為基因?qū)蜉d體的用途。
本發(fā)明的更進(jìn)一步方面涉及用根據(jù)本發(fā)明的重組動物病毒轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞。
這樣的根據(jù)本發(fā)明的重組的、具有復(fù)制能力或復(fù)制缺陷的動物病毒可被用于在各種來源的動物，例如哺乳動物，細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白，其中細(xì)胞所來源的生物不是所述病毒的天然宿主。此外，這樣的重組的、具有復(fù)制能力或復(fù)制缺陷的動物病毒可被用在免疫策略中，作為在動物，例如家養(yǎng)或?qū)櫸飫游锘蛉祟愔械囊呙?，以誘導(dǎo)，例如病毒或腫瘤特異的免疫反應(yīng)，以生成抗原特異性耐受、無反應(yīng)性(anergy)，或為預(yù)防性或治療性目的去除抗原特異性B細(xì)胞、T細(xì)胞或其獨(dú)特亞型。此外，重組的、具有復(fù)制能力或復(fù)制缺陷的動物病毒，例如馬皰疹病毒，可被用作人類體細(xì)胞基因治療的載體，來恢復(fù)、補(bǔ)償或調(diào)制細(xì)胞性、病毒性或任何其它疾病相關(guān)的基因的表達(dá)，以治療遺傳性疾病，例如常染色體性隱性遺傳的遺傳病、癌癥、自體免疫疾病或傳染性疾病。根據(jù)本發(fā)明的這樣的重組的、具有復(fù)制能力或復(fù)制缺陷的動物病毒也可以被用作基因遞送系統(tǒng)來生成轉(zhuǎn)基因動物。此外，本發(fā)明涉及表達(dá)所選擇的抗原的根據(jù)本發(fā)明的這樣的重組的、具有復(fù)制能力或復(fù)制缺陷的動物病毒在診斷或跟蹤抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答中的用途，該抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答是在疫苗接種、傳染性疾病、癌癥或自體免疫疾病后產(chǎn)生的。此外，本發(fā)明使得構(gòu)建試劑盒成為可能，該試劑盒包含至少，例如一個轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物，該轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物包含(i)EHV DNA復(fù)制的兩個已知起始點(diǎn)，ORIS和ORIL，中的一個，以及(ii)將單位長度的病毒DNA摻入預(yù)先形成的殼體所需的包裝序列，其反式(in trans)提供自一個包裝細(xì)胞系，以便能生成這樣的重組、感染性的，然而在當(dāng)前情況下是用于上述用途的復(fù)制缺陷型的、馬皰疹病毒。更特別地，這樣的檢測試劑盒使得將基因文庫亞克隆入轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物成為可能，以在異源或同源細(xì)胞中表達(dá)時鑒定獨(dú)特多肽、B和T細(xì)胞表位，該獨(dú)特多肽、B和T細(xì)胞表位與傳染性和自體免疫性疾病、癌癥和變態(tài)反應(yīng)的診斷、預(yù)防、治療和治療監(jiān)測相關(guān)。
具有復(fù)制能力的病毒可按“材料和方法”中所描述的加以構(gòu)建，并在圖1中圖解說明。簡要地說，利用BAC克隆和重組技術(shù)，異源基因或DNA序列可被插入到，或完整或部分取代，基因內(nèi)區(qū)段或非必需基因，該基因內(nèi)區(qū)段或非必需基因可被缺失而不影響或僅少量影響病毒生長。這樣的非必需基因的例子是gp2、gC、gE或gI基因。
復(fù)制缺陷型病毒可以對EHV基因組的幾個開放閱讀框架進(jìn)行缺失為基礎(chǔ)，該開放閱讀框架或者單獨(dú)、或者聯(lián)合對病毒復(fù)制是必需的，例如EHV-1所編碼的唯一一個即刻早期基因，基因64。特別地，由于EHV-1僅表達(dá)一個即刻早期(IE)反式激活蛋白，該即刻早期反式激活蛋白調(diào)節(jié)自身和調(diào)節(jié)所有非結(jié)構(gòu)性和結(jié)構(gòu)性蛋白表達(dá)，這一IE基因的缺失代表一種非常有效的方式，用來構(gòu)建復(fù)制缺陷型EHV-1。使用這一方法，可以構(gòu)建EHV-1來源的載體—最初是作為包含除IE基因之外的完整EHV-1基因組的以EHV-1為基礎(chǔ)的BAC，該載體將被轉(zhuǎn)染入和在補(bǔ)充細(xì)胞系上擴(kuò)增。這樣的重組EHV-1載體能感染，例如人類，來源的靶細(xì)胞。然而在體外或在體內(nèi)進(jìn)入靶細(xì)胞后，只有在非EHV-1來源的、異源啟動子/增強(qiáng)子的控制下的轉(zhuǎn)基因?qū)⒈槐磉_(dá)，并且抗EHV-1免疫反應(yīng)可被完全避免。
通過構(gòu)建“無內(nèi)臟”(gut-less)EHV，基因治療載體可被進(jìn)一步開發(fā)。這樣的無內(nèi)臟EHV，優(yōu)選EHV-1來源的載體，基本上基于EHV-1來源的復(fù)制子(replicon)基因組，該EHV-1來源的復(fù)制子基因組包含EHV-1 DNA復(fù)制的兩個已知起始點(diǎn)，ORIS和ORIL20-22，中的至少一個，以及將單位長度的病毒DNA摻入預(yù)先形成的核殼22-24所需的包裝(pac)序列。這些突變復(fù)制子基因組也可包含必需的核殼、間層或被膜成分的基因。這樣的復(fù)制子基因組可在攜帶突變EHV-1基因組的細(xì)胞系的幫助下被包裝，該突變EHV-1基因組缺乏病毒包裝序列以及ORIS和/或ORIL，但能提供和補(bǔ)充所需和必需的基因，該所需和必需的基因被從用于病毒DNA包裝的載體上反式除去。由于這些細(xì)胞系不編碼pac位點(diǎn)，只有復(fù)制子基因組被包裝，因此，這樣便代表了純的重組病毒群體。
包裝細(xì)胞系也可以以各種來源的穩(wěn)定細(xì)胞系的形式構(gòu)建，其中復(fù)制缺陷型EHV-1來源的復(fù)制子基因組包含EB病毒(EBV)來源的ORIp，并因此分離入表達(dá)EBV來源的EBNA-1蛋白的包裝子細(xì)胞。在將基因引入包裝細(xì)胞、用例如G-418抗性來選擇后，EBNA-1可通過補(bǔ)充細(xì)胞系穩(wěn)定生產(chǎn)。EBNA-1介導(dǎo)EHV-1來源的復(fù)制子基因組的分離，及其通過與ORIp結(jié)合在子細(xì)胞中的穩(wěn)定維持。
為了延長轉(zhuǎn)基因信息在靶細(xì)胞或靶組織中的維持，EBV ORIp和EBNA-1 ORF也可被插入EHV復(fù)制子基因組中，該EHV復(fù)制子基因組將在補(bǔ)充包裝細(xì)胞或生產(chǎn)者細(xì)胞中包裝入EHV，優(yōu)選EHV-1載體顆粒。在用EHV載體成功轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞或靶組織后，包含轉(zhuǎn)基因信息的EHV來源的復(fù)制子基因組在EBNA-1與ORIp結(jié)合的介導(dǎo)下在有絲分裂過程中分離入子細(xì)胞，從而導(dǎo)致EHV來源的復(fù)制子基因組在被轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的核中的長期保持?；蛘?，通過將基質(zhì)附著位點(diǎn)(MAT)插入EHV來源的復(fù)制子基因組，也可以使轉(zhuǎn)基因信息的保持延長。
在不依賴于EHV糖蛋白的條件下將本發(fā)明的EHV來源的載體導(dǎo)向特定細(xì)胞類型是可能的。例如，EHV-1對細(xì)胞的附著是通過病毒體對細(xì)胞表面的糖胺聚糖經(jīng)由gC的結(jié)合而介導(dǎo)的。在到目前為止所分析的所有皰疹病毒中，穩(wěn)定附著與受體結(jié)合是通過gD介導(dǎo)的，而病毒被膜與質(zhì)膜的融合通過仍然未知的過程發(fā)生，該過程涉及gB、gD和gH-gL復(fù)合物。然而，也證實在gB、gD和gH-gL不存在時病毒從被感染細(xì)胞有效釋放。
作為一個例子，假型EHV載體可通過幾種方式生產(chǎn)。例如，通過從病毒基因組中分別單獨(dú)或聯(lián)合缺失gB、gD和gH-gL，并構(gòu)建各自的補(bǔ)充包裝細(xì)胞系，可以生成單個或多重缺失的EHV-1。這些病毒可被用來感染非補(bǔ)充細(xì)胞，從這些非補(bǔ)充細(xì)胞中“非傳染性”病毒釋放出來。在這一病毒子代的被膜中，目的受體導(dǎo)向蛋白，例如gp120/41，可通過從細(xì)胞系中表達(dá)各自基因而被插入，該目的受體導(dǎo)向蛋白在表面暴露的膜受體水平介導(dǎo)細(xì)胞類型或組織特異性。或者，缺少gB、gD、gH-gL編碼區(qū)域的以EHV-1為基礎(chǔ)的BAC基因組也可以通過，例如將所述EHV-1糖蛋白gB、gD和gH-gL中的全部或部分用目的受體導(dǎo)向蛋白取代而加以直接假型化。這樣的病毒可隨后在允許生產(chǎn)細(xì)胞系上很容易地生產(chǎn)，該允許生產(chǎn)細(xì)胞系表達(dá)受體和潛在的共同受體。在gp120/41假型化的病毒這一例子中，受體和共同受體分子是原代人CD4受體和人共同受體，例如CXCR4或CCR5。任選地，除了gB、gD和gH-gL以外，IE基因和/或其它基因可被從病毒基因組缺失，例如用來避免EHV來源的基因產(chǎn)物在靶細(xì)胞中的表達(dá)和/或增加EHV來源的載體(“無內(nèi)臟”載體)的包裝體積，并且必須因此在上述包裝和生產(chǎn)細(xì)胞系中被補(bǔ)充。
介導(dǎo)細(xì)胞類型或組織特異性的受體導(dǎo)向蛋白可源自不同來源，例如(i)來自病毒，例如來自HIV-1的gp120/gp41被膜蛋白，通過假型化逆轉(zhuǎn)錄病毒支持CD4陽性細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)，(ii)來自已知在天然狀態(tài)下介導(dǎo)緊密細(xì)胞與細(xì)胞接觸的細(xì)胞受體，(iii)來自已知識別它們的相關(guān)細(xì)胞受體的可溶性配體，該相關(guān)細(xì)胞受體例如補(bǔ)體成分或趨化因子，該趨化因子能夠通過異源跨膜結(jié)構(gòu)域固定于病毒體表面，從而介導(dǎo)與例如抗原呈遞細(xì)胞、幼稚或記憶T或B細(xì)胞(取決于，例如，所選擇的趨化因子的性質(zhì))接觸，(iv)來自基因工程化的膜結(jié)合抗體、Fab片段或其替代品，例如單鏈抗體、PSTI(胰分泌性胰蛋白酶抑制劑)衍生物、或任何已通過，例如噬菌體或核糖體展示技術(shù)加以選擇的其它支架蛋白，或(v)來自其代表互補(bǔ)性決定區(qū)或受體相互作用決定簇的部分，該互補(bǔ)性決定區(qū)或受體相互作用決定簇被插入到受體導(dǎo)向或膜融合介導(dǎo)蛋白的合適位點(diǎn)。此外，例如EHV-1載體顆粒有效融合和進(jìn)入靶細(xì)胞可獨(dú)立完成，或通過完全或部分非選擇性兼嗜性，例如病毒被膜蛋白如VSV-G被膜蛋白、MoMLV被膜蛋白或GaLV被膜蛋白，而輔助細(xì)胞類型和組織特異性結(jié)合。
EHV來源的載體可被用于遞送非EHV載體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體。為了構(gòu)建這樣的雜種EHV載體，將要被包裝入EHV來源的載體顆粒的EHV來源的復(fù)制子基因組必須包含至少逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒復(fù)制子DNA基因組，該逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒復(fù)制子DNA基因組編碼轉(zhuǎn)基因信息，此外還有EHV來源的復(fù)制子基因組復(fù)制和其在補(bǔ)充包裝細(xì)胞系中包裝入EHV載體顆粒所需的最少信息。插入EHV復(fù)制子基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒復(fù)制子DNA基因組必要地必須提供至少所有順式作用元件，該順式作用元件對于逆轉(zhuǎn)錄或慢病毒RNA復(fù)制子的生成、其包裝入逆轉(zhuǎn)錄或慢病毒顆粒、逆轉(zhuǎn)錄、核靶向以及慢病毒復(fù)制子基因組整合入宿主細(xì)胞基因組和轉(zhuǎn)基因的表達(dá)是必需的。這樣的傳染性、但非復(fù)制的雜種的以EHV為基礎(chǔ)的載體顆?？杀挥糜谕ㄟ^感染逆轉(zhuǎn)錄或慢病毒包裝細(xì)胞來反式生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體顆粒，該逆轉(zhuǎn)錄或慢病毒包裝細(xì)胞提供包裝功能例如GagPol，以及表面暴露的靶蛋白，例如VSV G蛋白。
或者，除了逆轉(zhuǎn)錄或慢病毒“復(fù)制子”DNA基因組之外，將被包裝入EHV來源的載體顆粒中的EHV來源的“復(fù)制子”基因組也可包含(i)野生型或密碼子優(yōu)化的逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒gagpol包裝基因，以及(ii)開放閱讀框架，該開放閱讀框架編碼表面暴露的導(dǎo)向蛋白，該導(dǎo)向蛋白介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體的細(xì)胞特異性。這樣的復(fù)雜的雜種的以EHV為基礎(chǔ)的載體顆粒也可被用于在體外生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體顆粒。這樣的復(fù)雜的雜種的以EHV為基礎(chǔ)的載體顆粒的一個優(yōu)選應(yīng)用是它們的原位或體內(nèi)用途，其中，在用雜種的以EHV為基礎(chǔ)的載體顆粒感染后，逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒顆粒在原位生產(chǎn)，該逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒顆粒允許通過將轉(zhuǎn)基因信息整合入宿主細(xì)胞基因組而穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞。
用例如EHV-1來源的載體遞送非EHV-1來源的載體的用途的另一個例子是遞送甲病毒(alphavirus)(例如無名森林病毒SFV、辛德比斯或委內(nèi)瑞拉腦炎病毒VEE)復(fù)制子到靶細(xì)胞。這樣的甲病毒來源的復(fù)制子通常受，例如病毒的、細(xì)胞類型特異的或可誘導(dǎo)的啟動子調(diào)節(jié)，該啟動子驅(qū)動一單位的核轉(zhuǎn)錄，該單位包含編碼甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白、和代表甲病毒啟動子的序列，該甲病毒啟動子對轉(zhuǎn)基因的強(qiáng)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄是必需的，該轉(zhuǎn)基因受反式激活甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的控制。這些元件在轉(zhuǎn)錄單位上的順序的一個例子是5’-CMV啟動子/增強(qiáng)子-甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白-甲病毒啟動子-轉(zhuǎn)基因-3’。為了構(gòu)建這樣的雜種EHV-1載體，將要被包裝入EHV-1來源的載體顆粒的EHV-1來源的復(fù)制子基因組至少包含上述的甲病毒復(fù)制子，該甲病毒復(fù)制子除了最少信息之外還包括轉(zhuǎn)基因信息，該最少信息對于EHV-1來源的復(fù)制子基因組的復(fù)制和其在補(bǔ)充包裝細(xì)胞系中包裝入EHV-1載體顆粒是必需的。
轉(zhuǎn)基因信息的轉(zhuǎn)錄可被任何異源的，例如病毒的、細(xì)胞的或任何種類的雜種啟動子/增強(qiáng)子單元所驅(qū)動。組成型轉(zhuǎn)錄可通過各種病毒啟動子/增強(qiáng)子元件來達(dá)到，病毒啟動子/增強(qiáng)子元件例如病毒的人巨細(xì)胞病毒(HCMV)即刻早期啟動子/增強(qiáng)子、勞斯肉瘤病毒啟動子/增強(qiáng)子或腺病毒主要/晚期啟動子/增強(qiáng)子，或通過驅(qū)動管家基因表達(dá)的細(xì)胞啟動子/增強(qiáng)子單位來達(dá)到，管家基因例如肌動蛋白啟動子?；蛘?，轉(zhuǎn)基因表達(dá)的細(xì)胞類型特異性導(dǎo)向可以通過使用細(xì)胞類型或組織特異性啟動子/增強(qiáng)子元件來達(dá)到或受其支持，該細(xì)胞類型或組織特異性啟動子/增強(qiáng)子元件例如那些調(diào)節(jié)例如肌肉肌酸激酶(MCK)、MHC I或II類分子、CD4受體、胰島素、血液凝固級聯(lián)因子或其它的表達(dá)的元件?；蛘?，可以利用可誘導(dǎo)啟動子/增強(qiáng)子元件，例如激素可誘導(dǎo)的P/E元件，或優(yōu)選能被四環(huán)素或其類似物誘導(dǎo)的啟動子增強(qiáng)子單位。將被以EHV-1為基礎(chǔ)的載體遞送的轉(zhuǎn)錄單位可編碼各種生物學(xué)上的活性化合物，例如用于診斷、預(yù)防或治療用途的多肽、apta-或intramer、核酶、反義構(gòu)建物或小干擾RNA(small interfering RNA)。通過這樣的重組EHV-1來源的載體單獨(dú)或聯(lián)合遞送的這樣的生物學(xué)上的活性化合物可被用于誘導(dǎo)、增強(qiáng)和調(diào)制免疫反應(yīng)、中斷或誘導(dǎo)耐受、誘導(dǎo)無反應(yīng)性、去除特異性T或B細(xì)胞或其亞群。
因此，以EHV為基礎(chǔ)的載體可簡單地被用于在細(xì)胞培養(yǎng)物中為診斷、預(yù)防或治療用途生產(chǎn)任何種類的多肽。
或者，EHV-1來源的載體可被用于在體外和在體內(nèi)感染或轉(zhuǎn)導(dǎo)非馬動物和人類來源的原代靶細(xì)胞、以及非馬動物和人類來源的細(xì)胞系。
任何可被回體(ex vivo)選擇、生成、操作和培養(yǎng)的非馬動物和人類細(xì)胞系或細(xì)胞群體可代表將在體外被轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶細(xì)胞。優(yōu)選地，這些細(xì)胞是原代細(xì)胞例如分離自動物例如牲畜(livestock)或?qū)櫸飫游?pet animal)或人類的原代免疫細(xì)胞，更優(yōu)選多能祖先細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、血液來源的干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞或其獨(dú)特亞型或衍生物。最優(yōu)選的，這些細(xì)胞分別是抗原呈遞細(xì)胞例如B細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系的細(xì)胞、樹突細(xì)胞或其衍生物?；蛘撸@些細(xì)胞是原代腫瘤細(xì)胞。
利用正的或負(fù)的可選擇標(biāo)記物，例如二氫葉酸還原酶(DHFR)或新霉素，或利用免疫學(xué)標(biāo)記物例如NGFR，來進(jìn)行例如熒光激活的細(xì)胞揀選(FACS)、或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的物理富集，該物理富集是使用如通過MilenyiBioTech或Dynal而在商業(yè)上可得到的磁珠技術(shù)而進(jìn)行的，成功轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞可以被選擇。被選擇的細(xì)胞或者可自己擴(kuò)增，或者更特別地可被用于擴(kuò)增免疫細(xì)胞例如抗原特異性T細(xì)胞。所轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞可被進(jìn)一步在培養(yǎng)物中擴(kuò)增，例如用來純化分泌自細(xì)胞培養(yǎng)物上清中的成分例如多肽。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞可為治療或預(yù)防目的再次被引入人體、寵物、牲畜或?qū)嶒炇覄游矬w內(nèi)。
優(yōu)選地，使用根據(jù)本發(fā)明的重組的、具有復(fù)制能力的或復(fù)制缺陷型動物病毒回體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞、優(yōu)選原代和最優(yōu)選原代人類細(xì)胞可被用于將選擇的、疾病相關(guān)抗原、嵌合或雜種蛋白、表位或表位串分別遞送入細(xì)胞，該表位串代表例如導(dǎo)致自體免疫或變態(tài)反應(yīng)的病毒抗原、腫瘤抗原、抗原或表位，更特別地遞送到抗原呈遞細(xì)胞，并且優(yōu)選遞送到樹突細(xì)胞或其衍生物，以便達(dá)到相關(guān)表位向免疫系統(tǒng)的順利遞送，該相關(guān)表位例如MHC I類和II類限制的T細(xì)胞表位和/或B細(xì)胞表位。免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和類型的結(jié)果可以例如通過在被轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，例如樹突細(xì)胞中或者單獨(dú)、或者聯(lián)合共表達(dá)選擇的細(xì)胞因子，例如IL-2、gIFN、IL-12、IL18、IL10、IL4、IL6，和/或趨化因子例如Rantes、MIP1a、MIP1β、SDF-1、SLC、ECL、BCA-1、DC-CK1、IP-10或其衍生物而加以影響和調(diào)制，以影響Th1/Th2平衡、吸引限定亞群的免疫細(xì)胞，并且中斷耐受?；蛘呋蝾~外地，參與細(xì)胞內(nèi)信號傳遞例如共同刺激性信號如B7.1、B7.2、CD80、CD86的細(xì)胞表面受體或配體的表達(dá)水平，可例如通過共轉(zhuǎn)錄閱讀框架特異性核酶、反義RNA或siRNA來在被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中加以調(diào)制，以通過誘導(dǎo)無反應(yīng)性使免疫的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)換為例如外周T細(xì)胞的耐受。此外，通過在被轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中使用fas/fasL系統(tǒng)，抗原特異性T細(xì)胞可被去除，從而在表型上也導(dǎo)致耐受。
或者，使用根據(jù)本發(fā)明的重組的、具有復(fù)制能力的或復(fù)制缺陷型動物病毒回體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞可被用作在人類中進(jìn)行體細(xì)胞基因治療的載體來恢復(fù)、補(bǔ)償或調(diào)制細(xì)胞的、病毒的或任何其他疾病相關(guān)基因，通過遞送例如反式顯性失活突變體、分子誘騙物(decoy)、反義構(gòu)建物或siRNA，來治療遺傳性疾病例如常染色體隱形遺傳的遺傳性疾病、癌癥、自體免疫疾病或傳染性疾病。更特別地，轉(zhuǎn)導(dǎo)的胚胎干細(xì)胞可被用于生成轉(zhuǎn)基因動物例如小鼠和牲畜。
原代人類細(xì)胞地體外轉(zhuǎn)導(dǎo)也可被用于診斷目的，例如鑒別、指定和監(jiān)視體液的，和優(yōu)選地，細(xì)胞的，例如MHC I類和MHC II類限制的和，特別的，CD4-和/或CD8-陽性的T細(xì)胞應(yīng)答。例如，純化的PBMC，優(yōu)選純化的抗原呈遞細(xì)胞和最優(yōu)選純化的樹突細(xì)胞或其衍生物可被重組復(fù)制或復(fù)制機(jī)能不全的EHV-1感染，該EHV-1表達(dá)免疫靶蛋白或其衍生物?；蛘撸獦悠房芍苯佑脕碛弥亟MEHV-1感染易感細(xì)胞，該重組EHV-1表達(dá)目的轉(zhuǎn)基因，以達(dá)到選擇的表位向免疫細(xì)胞的遞送，該遞送是MHC II類和/或MHC I類限制的。隨后進(jìn)行的對抗原特異性T細(xì)胞的刺激可通過不同手段加以監(jiān)測，這些不同手段例如通過摻入例如3H胸腺嘧啶核苷或5-溴脫氧尿苷測定T細(xì)胞增殖、在ELISPOT測定中對細(xì)胞因子和趨化因子產(chǎn)生細(xì)胞進(jìn)行定量，或者，另外地，通過FACS分析，或通過建立標(biāo)準(zhǔn)鉻釋放測定。此外，所得到的基因文庫，例如作為將不同細(xì)胞群體的cDNA從彼此扣除的結(jié)果而得到的基因文庫，可被克隆入具有復(fù)制能力或非復(fù)制的EHV-1來源的載體，以生成載體群體，該載體群體隨后被用來進(jìn)行根據(jù)上面概括的程序進(jìn)行的詳細(xì)的免疫分析，以鑒定和描繪MHC I類和MHC II類限制的T細(xì)胞的特征，該T細(xì)胞參與自體免疫疾病、腫瘤排斥和傳染性疾病的控制。
利用在人類、寵物和牲畜中缺乏EHV特異性原始免疫，并考慮到例如原代人類細(xì)胞在低顆粒數(shù)目時的有效感染，本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方式是為預(yù)防或治療目的將EHV來源的載體在體內(nèi)或原位直接投藥給人類或?qū)櫸锘蛏?，而不預(yù)先對靶細(xì)胞進(jìn)行回體轉(zhuǎn)導(dǎo)。
特別地，我們的這些發(fā)現(xiàn)證明極低的感染復(fù)數(shù)使得原代人類細(xì)胞例如B和T細(xì)胞的有效感染成為可能，并且MOI＜1對于體外有效感染人類細(xì)胞系是足夠的；并充分暗示，通過EHV載體顆粒進(jìn)行的體內(nèi)基因遞送比腺病毒介導(dǎo)的基因遞送效率高出大約100-5000倍。因此，在低顆粒數(shù)目(106-108pfu；與腺病毒載體相比低出100-5000倍)使用這樣的高度有效的、以EHV為基礎(chǔ)的載體用于在體內(nèi)向人類、寵物和牲畜進(jìn)行基因遞送的一個主要好處是與腺病毒載體相比，其誘發(fā)毒性副作用、變態(tài)反應(yīng)或自體免疫疾病的可能性低。
EHV來源的、非復(fù)制載體顆粒這樣的可比較的低數(shù)目對針對病毒載體的有限的免疫應(yīng)答作出貢獻(xiàn)。這一事實，以及短暫的EHV特異性體液免疫應(yīng)答本身，使得在短的時間間隔使用同一EHV株作為載體重復(fù)增強(qiáng)免疫成為可能，并因此能夠使用EHV來源的載體作為通用媒介物，用來遞送各種抗原、基因或DNA序列。
至于根據(jù)本發(fā)明的非復(fù)制動物病毒來源的載體，當(dāng)例如包裝的EHV復(fù)制子缺乏例如EHV編碼的即刻早期基因64時，這一效應(yīng)可進(jìn)一步擴(kuò)大。這樣的喪失IE基因的、EHV來源的載體使得體內(nèi)感染和轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞成為可能，而不表達(dá)任何EHV蛋白，從而避免了對成功感染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的消除，這種消除是由EHV特異性免疫應(yīng)答進(jìn)行的。
除此之外，EHV來源的載體展示出優(yōu)選轉(zhuǎn)導(dǎo)非極化細(xì)胞(non-polarizedcell)例如PBMC和腫瘤細(xì)胞的傾向。
因此，除了回體轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞，這樣的重組、具有復(fù)制能力或復(fù)制缺陷的馬皰疹病毒也可在體內(nèi)或原位在免疫策略中被直接使用，作為在動物，例如寵物和牲畜，以及人類中的疫苗，以便為預(yù)防或治療目的誘導(dǎo)例如對病毒或腫瘤特異性的免疫應(yīng)答、生成或中斷抗原特異性耐受、誘導(dǎo)無反應(yīng)性、或去除抗原特異性B細(xì)胞、T細(xì)胞或其獨(dú)特亞型。
直接原位或體內(nèi)給予根據(jù)本發(fā)明的這樣的重組、具有復(fù)制能力的或復(fù)制缺陷的動物病毒可被用于遞送選擇的、疾病相關(guān)抗原、嵌合或雜種蛋白、表位或表位串分別至免疫系統(tǒng)，該表位串代表例如導(dǎo)致自體免疫或變態(tài)反應(yīng)的病毒抗原、腫瘤抗原、抗原或表位，更特別地至抗原呈遞細(xì)胞，最優(yōu)選至樹突細(xì)胞或其衍生物，以便達(dá)到相關(guān)表位向免疫系統(tǒng)的順利遞送，該相關(guān)表位例如MHC I類和II類限制的T細(xì)胞表位和/或B細(xì)胞表位。免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和類型的結(jié)果可以例如通過共表達(dá)選擇的細(xì)胞因子，例如IL-2、gIFN、IL-12、IL18、IL10、IL4、IL6(或者單獨(dú)、或者聯(lián)合)，和/或趨化因子例如Rantes、MIP1a、MIP1β、SDF-1、SLC、ECL、BCA-1、DC-CK1、IP-10或其衍生物(或者單獨(dú)、或者聯(lián)合)而加以影響或調(diào)制，以影響Th1/Th2平衡、吸引限定亞群的免疫細(xì)胞，并且中斷耐受?；蛘呋蝾~外地，參與細(xì)胞內(nèi)信號傳遞例如共同刺激性信號如B7.1、B7.2、CD80、CD86的細(xì)胞表面受體或配體的表達(dá)水平可，例如通過共轉(zhuǎn)錄閱讀框架特異性核酶、反義RNA或siRNA來在被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中加以調(diào)制，以通過誘導(dǎo)無反應(yīng)性從免疫的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)換至例如外周T細(xì)胞耐受。此外，通過在被轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中使用fas/fasL系統(tǒng)，抗原特異性T細(xì)胞可被去除，從而在表型上也導(dǎo)致耐受。
此外，根據(jù)本發(fā)明的重組的、具有復(fù)制能力或復(fù)制缺陷的動物病毒可在體內(nèi)被用作人類體細(xì)胞基因治療的載體，來恢復(fù)、補(bǔ)償或調(diào)制細(xì)胞性、病毒性或任何其它疾病相關(guān)的基因的表達(dá)，以治療遺傳性疾病，例如常染色體性隱性遺傳的遺傳病、癌癥、自體免疫疾病或傳染性疾病。
可使用不同的給藥途徑來向受者遞送所需抗原、反式顯性失活基因突變體、核酶、反義RNA或siRNA。遞送途徑的范圍從(i)原位給藥，例如通過將重組的、具有復(fù)制能力或復(fù)制缺陷的馬皰疹病毒注射入門靜脈來轉(zhuǎn)導(dǎo)肝細(xì)胞，(ii)吸入，以將基因遞送入肺，(iii)鼻內(nèi)、直腸或陰道給藥，例如以生成粘膜應(yīng)答，(iv)皮下或皮內(nèi)注射以導(dǎo)向特異的抗原呈遞細(xì)胞，(v)肌肉內(nèi)給藥，直到(vi)靜脈內(nèi)注射。
遞送抗原或核酸至免疫系統(tǒng)的另一方式是(i)或者在用重組的、具有復(fù)制能力或復(fù)制缺陷的馬皰疹病毒感染后將細(xì)胞包入膠囊內(nèi)，或者(ii)用根據(jù)本發(fā)明的重組的、具有復(fù)制能力或復(fù)制缺陷的動物病毒感染包入膠囊內(nèi)的、或以別的方式固定或區(qū)室化的細(xì)胞，并且通過針對特異器官，或者系統(tǒng)地或者原位地隨后將這樣感染的、包入膠囊內(nèi)的或固定的細(xì)胞投藥給受者。這樣的細(xì)胞可以是(i)包裝細(xì)胞，該細(xì)胞支持根據(jù)本發(fā)明人的傳染性、然而復(fù)制缺陷的動物病毒的生產(chǎn)；(ii)允許所需抗原適當(dāng)表達(dá)和分泌的同源細(xì)胞、細(xì)胞群體或細(xì)胞系。
因此，本發(fā)明的一個目的是分析EHV-1作為通用載體用來將編碼例如轉(zhuǎn)基因報告子的DNA序列在體外遞送入非人和人類來源的不同細(xì)胞的能力。更特別地，本發(fā)明的一個目的是分析EHV-1作為通用載體用來在體外和體內(nèi)表達(dá)基因以針對傳染性疾病免疫人和最重要的哺乳動物和鳥類物種的能力。本發(fā)明的另一個目的是分析EHV-1被用作人類抗腫瘤疫苗的能力。此外，本發(fā)明的一個目的是分析EHV-1來源的載體為基因治療目的、轉(zhuǎn)基因動物生成或診斷目的被用來用大的DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的能力。本發(fā)明的另一個目的是分析EHV-1作為通用載體用來對在各種細(xì)胞類型中的鼠、人或任何其他基因組的BAC/PAC文庫進(jìn)行體外應(yīng)用和功能性測定的能力。
特別地，鑒于高包裝能力、低病毒數(shù)目/每個細(xì)胞即能極其有效地遞送標(biāo)記基因、不被人類血清中和、其在活躍復(fù)制的細(xì)胞中建立潛伏感染的能力、以及其在鼠模型中介導(dǎo)有效的和持久的體內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的能力，EHV-1可以證明是一種極端有用的新工具，用來作為在動物和人類中為治療、預(yù)防和診斷目的的載體。
與其它系統(tǒng)相比，EHV-1作為在人類、寵物和牲畜中使用的載體有若干優(yōu)點(diǎn)，即，如果被系統(tǒng)地加以利用和使用的話，生成具有迄今為止未知特性的新的遞送系統(tǒng)。這些特性包括(1)其以極低的顆粒數(shù)目非常有效地感染異源物種，例如人類的能力，(2)缺乏中和抗EHV-1抗體，以及(3)缺乏相關(guān)人類病毒的交叉中和，以及以下事實(4)EHV本身僅誘導(dǎo)較小的載體特異性免疫應(yīng)答，該應(yīng)答(5)可通過生成安全的、條件致死突變體而加以進(jìn)一步降低，該突變體可在補(bǔ)充/包裝細(xì)胞系上擴(kuò)增，在受者細(xì)胞中完全不表達(dá)EHV來源的蛋白質(zhì)，(6)EHV-1理論上的包裝容量到目前為止超過100kbp，以及(7)這一事實，即表達(dá)或遞送異源核酸的EHV-1可容易地在小動物(嚙齒類動物)模型上進(jìn)行測試。
為了完成本發(fā)明，發(fā)明人使用了如下材料和方法。
材料病毒和細(xì)胞使用無毒EHV-1疫苗株RacH(第256次傳代)的衍生物，將其生長于RK13細(xì)胞上，該細(xì)胞在補(bǔ)充有10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco極限必需培養(yǎng)基(DMEM)擴(kuò)增。在所有感染實驗中，使用重構(gòu)自傳染性BAC克隆pRacH的無毒RacH病毒(圖1)。重構(gòu)自pRacH的病毒缺乏糖蛋白gp2基因(基因71)，被稱為HΔgp2。作為對照病毒，使用表達(dá)GFP的牛皰疹病毒1型(BHV-1)，Schnbken株。至于BHV-1，病毒重構(gòu)自傳染性BAC克隆pBHV-1。重構(gòu)自pBHV-1的BHV-1稱為BHV-1ΔgE，缺乏gE開放閱讀框架(ORF)，代替它的是插入了包括GFP表達(dá)盒的微型F質(zhì)粒pHA2。
人細(xì)胞系是CD4+T細(xì)胞系MT4(MRC ARP017)、人黑素瘤細(xì)胞系MeWo(ATCC HTB-65)、肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HuH7(ATCC CCL-185)，腎癌細(xì)胞系293(ATCC CRL-1573)，肺癌細(xì)胞系H1299，和人宮頸癌細(xì)胞系HeLa(ATCC EEL-2)。我們還使用了牛Madin Darby牛腎(MDBK；ATCCCCL-22)細(xì)胞，Madin Darby犬腎(MDBK；ATCC CCL-34)，貓胚細(xì)胞(Riems島動物病毒疾病聯(lián)邦研究中心的獸醫(yī)學(xué)細(xì)胞系保藏中心，RIE138)、豬腎細(xì)胞系PK15(ATCC CCL-33)、以及原代雞胚細(xì)胞(CEC)和鵪鶉肌肉QM7。細(xì)胞系保持在補(bǔ)充有10％FCS的DMEM中。原代人類、豬、?；蝰R外周血單核細(xì)胞(PBMC)如下述制備。將10毫升靜脈血或臍帶血加樣至2ml 2％的檸檬酸鈉溶液中。在用Ficoll(Histopaque，Sigma)進(jìn)行密度梯度離心后，PBMC或臍帶干細(xì)胞被分離。PBMC在磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中洗兩次，懸浮于RPMI(Gibco-BRL)?；蛘邔BMC留下不處理，或者用伴刀豆球蛋白A(ConA)以5μg/ml的濃度刺激24-48小時，然后用HΔgp2或BHV-1ΔgE病毒接種。
方法單一步驟生長動力學(xué)和病毒效價測定 對接種于24孔板的1×105細(xì)胞以感染復(fù)數(shù)(m.o.i.)為3進(jìn)行感染后，測定單一步驟生長動力學(xué)。讓病毒在冰上附著2小時，隨后在37℃穿透1小時。溫度轉(zhuǎn)換后在指定時間收獲感染的上清，通過在RK13細(xì)胞上鋪板(EHV-1)或在MDBK細(xì)胞上鋪板(BHV-1)測定兩種配制品中的病毒效價。
間接免疫熒光和流式細(xì)胞儀測定 對間接免疫熒光(IF)而言，將細(xì)胞生長在24或6孔板上，繼而用表達(dá)GFP的HΔgp2在各種m.o.i.進(jìn)行感染。GFP表達(dá)和抗體結(jié)合用倒置熒光顯微鏡(Zeiss Axiovert和Olympus)觀察，抗體結(jié)合用與各種熒光染料結(jié)合的第二抗體進(jìn)行檢測，或用FACSCan(Becton-Dickinson)通過流式細(xì)胞計進(jìn)行觀察。將病毒感染的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至U形底的96孔微量滴定板(4×104細(xì)胞/孔)。于冰上加入針對各種人CD標(biāo)記物的單克隆抗體(mabs)(抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD11b、抗CD16、抗CD319，所有抗體來自Dako)30分鐘，細(xì)胞用PBS洗兩次。加入ALEXA543山羊抗小鼠IgG偶聯(lián)物(Molecular Probes，USA)15分鐘。再用PBS洗兩次之后，細(xì)胞重懸于100μl PBS，并用流式細(xì)胞計分析(至少5000細(xì)胞/樣品)。
病毒中和測定包含10-100pfu的病毒懸液在10％DMEM中在37℃與包含高效價VZV-、HSV-1-、HCMV-、或EBV特異性抗體的人抗血清一起孵育1-4小時。對照包括對EHV-1抗體呈陰性或陽性的馬或鼠血清。將病毒抗體混合物一式三份加入RK13細(xì)胞，在37℃孵育48-96小時，用光學(xué)顯微鏡分析致細(xì)胞病變效應(yīng)。
動物實驗乙醚麻醉后，用20μl體積的2×104感染單位的EHV-1鼻內(nèi)接種BALB/c或C57/黑(C57/black)。在滴注后第1至14天，殺死小鼠，取下肺，立刻原位檢查GFP表達(dá)。然后將肺在液氮中迅速冷凍(shock-freeze)，制備薄切片。不進(jìn)行固定，以避免GFP熒光信號被降低。用光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡掃描肺切片。用數(shù)碼照相機(jī)(Olympus)拍照片。
實施例1EHV-1有效感染各種來源的細(xì)胞系，并遞送異源基因至細(xì)胞以前曾顯示，EHV-1可有效感染馬和嚙齒類動物來源的細(xì)胞，并在其中復(fù)制。為EHV-1生長所提供的基質(zhì)是源自鼻上皮、肺、甲狀腺和皮膚的原代馬細(xì)胞。此外，EHV-1株已被顯示在兔RK13細(xì)胞、小鼠LM細(xì)胞、以及幼倉鼠腎BHK-21/C13細(xì)胞中生長至高效價。也可證明，在這些細(xì)胞中，異源基因在各種啟動子控制下有效表達(dá)。
我們的興趣在于探索gp2-陰性EHV-1 HΔgp2感染鳥類、牛、豬、犬、貓和靈長類動物來源的細(xì)胞的能力，該gp2-陰性EHV-1 HΔgp2在HCMV即刻早期啟動子/增強(qiáng)子的控制下表達(dá)GFP。我們能夠證明，EHV-1有效進(jìn)入鳥類、牛、豬、犬、貓和人類動物來源的細(xì)胞。如熒光顯微鏡所分析的，在CEC、QM7、MDBK、PK15、MDCK、CRFK、和人類細(xì)胞系MT4、HeLa、HuH7、293、H1299、和MeWo的情形下，顯示2％至100％之間的細(xì)胞從感染后24小時后表達(dá)GFP(圖2)。相反，從傳染性質(zhì)粒pBHV-1收回的BHV-1ΔgE無法有效感染非牛來源的細(xì)胞，顯示EHV-1在非人來源的α皰疹病毒中具有獨(dú)特的感染人類細(xì)胞系的能力。
實施例2EHV-1有效感染豬和牛PBMC在下一系列的實驗中，我們研究了EHV-1進(jìn)入原代細(xì)胞的能力，該原代細(xì)胞獲自重要牲畜物種的外周血。從馬、豬或牛取靜脈血，以m.o.i為0.1進(jìn)行感染。盡管這些物種的大約0.5％的PBMC在接種EHV-1后表達(dá)GFP，當(dāng)用ConA刺激后24-48小時對細(xì)胞進(jìn)行感染時，5-25％的PBMC被顯示表達(dá)GFP(圖3)。有趣的是注意到，馬PBMC—其已被描述在馬中既是溶解性感染部位，也是潛伏狀態(tài)部位—與用分離自其它物種的PBMC所測定的一樣，對用HΔgp2感染展示出相似的易感性。結(jié)果證明，EHV-1能有效進(jìn)入牲畜動物的PBMC。相反，正如將病毒添加給受刺激和未受刺激的PBMC后缺乏GFP表達(dá)細(xì)胞這一點(diǎn)所反映出的，BHV-1ΔgE無法進(jìn)入任一物種的PBMC。
實施例3EHV-1有效轉(zhuǎn)導(dǎo)人PBMC和臍帶干細(xì)胞上面的結(jié)果非常令人驚訝，即其他物種的PBMC具有被EHV-1轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力。因此，將不同女性和男性人類個體的PBMC，以及分別來自一個男性和一個女性新生兒的臍帶干細(xì)胞，保持在補(bǔ)充有10％FCS的RPMI中，或保持在含ConA的培養(yǎng)基中?？梢燥@示，總共4個個體的PBMC可被EHV-1感染，并且發(fā)生GFP表達(dá)。此外，來自男性和女性胚胎的干細(xì)胞可用EHV-1有效轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且超過15％的分離的干細(xì)胞表達(dá)GFP。正如馬、豬和牛PBMC所報告的，如果PBMC用ConA刺激24小時，感染和GFP表達(dá)更加有效(圖4)。如用流式細(xì)胞儀所測定的，在未刺激的培養(yǎng)物中，大約1％的PBMC被EHV-1所轉(zhuǎn)導(dǎo)，而感染ConA刺激的胚細(xì)胞24小時后，高達(dá)22％的PBMC為GFP陽性。如上面所描述的，BHV-1ΔgE既無法進(jìn)入刺激的、也無法進(jìn)入未刺激的人類PBMC。這些結(jié)果以及上面所描述的那些結(jié)果證明，EHV-1能有效轉(zhuǎn)導(dǎo)各種來源的細(xì)胞系，并且其能以高效進(jìn)入人類PBMC。
實施例4EHV-1以相似效率介導(dǎo)向人類CD3+、CD4+、CD8+、CD11b+、CD19+細(xì)胞的基因?qū)胛覀冸S后嘗試鑒定EHV-1轉(zhuǎn)導(dǎo)的人類PBMC的特性。EHV-1被用來以m.o.i為1感染人類PBMC，該P(yáng)BMC或者用ConA刺激24小時，或者留下不進(jìn)行刺激。感染后24小時將細(xì)胞與特異性CD標(biāo)記物一起孵育，進(jìn)行流式細(xì)胞計數(shù)?？梢宰C明，使用EHV-1，人類B淋巴細(xì)胞(CD19+)，以及CD4+和CD8+人類T淋巴細(xì)胞被有效轉(zhuǎn)導(dǎo)，證明這一點(diǎn)的是在感染后24小時在表達(dá)GFP的細(xì)胞表面檢測相應(yīng)的分化分子后，出現(xiàn)雙標(biāo)記細(xì)胞，并且每種被測試表型的細(xì)胞中大約15-22％被顯示出表達(dá)標(biāo)記物GFP基因(圖5)。此外，在生長自懸浮培養(yǎng)物的CD11b+細(xì)胞(單核細(xì)胞、粒細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞)中的大約10％中，可以很容易地檢測到GFP表達(dá)(圖5)。此外，CD4+MT4細(xì)胞也可以高效率被轉(zhuǎn)導(dǎo)(圖6)。結(jié)果證明，在用ConA刺激后，EHV-1能轉(zhuǎn)導(dǎo)廣泛種類的人類PBMC，并且其m.o.i低，相當(dāng)于不到100顆粒/細(xì)胞。
實施例5EHV-1不被含高效價的針對人皰疹病毒的中和抗體的人類血清所中和為了使EHV-1能被用于人類疫苗接種或基因治療，我們考察了用含高效價抗體的血清中和EHV-1的問題，該抗體針對α皰疹病毒HSV-1或VZV，以及β皰疹病毒HCMV，和γ皰疹病毒EBV。此外，測試了三名研究人員的血清，該三名研究人員日常操作EHV-1。血清在56℃滅活30分鐘，或留下不進(jìn)行處理，100μl體積的100或10p.f.u.的EHV-1 RacH株或HΔgp2突變病毒與在DMEM中的log2稀釋的(100μl)人血清在37℃一起孵育1-4小時。病毒一抗血清混合物然后與RK13細(xì)胞混合。在人血清中沒有一份能檢測到針對EHV-1的中和活性，并且即使使用最低血清稀釋度(1∶4)和僅僅10p.f.u.的病毒，也發(fā)展出完全致細(xì)胞病變效應(yīng)(表1)。相反，用RacH免疫一次的小鼠或馬血清很容易中和10或100p.f.u.的RacH和HΔgp2，該RacH和HΔgp2展示1∶16至1∶256的效價(表1)。這些結(jié)果證明，EHV-1無法被人類抗血清中和，即使它們包含針對人皰疹病毒的高效價。此外，無論男性還是女性，人類在實驗室條件下持續(xù)暴露于EHV-1都不導(dǎo)致誘導(dǎo)EHV-1特異的抗體滴度。
實施例6EHV-1引起的體內(nèi)有效和持久轉(zhuǎn)基因表達(dá)為了將新開發(fā)的載體用于疫苗接種或基因治療應(yīng)用，載體所介導(dǎo)的插入轉(zhuǎn)基因的體內(nèi)表達(dá)是必要的。因此，評估了在對各種遺傳背景的小鼠鼻內(nèi)滴注2×104IU的EHV-1后，GFP的體內(nèi)表達(dá)。鼻內(nèi)施用第1至12天，BALB/c和C57/黑小鼠肺中都可以很容易觀察到GFP表達(dá)。肺從尸體上取下后立即在顯微鏡下檢查時，鑒定出多個展示出高水平自發(fā)熒光的區(qū)域(圖5a)。在薄切片上，在支氣管和肺泡的多個細(xì)胞中觀察到高水平GFP表達(dá)。施用載體后直到第12天，檢測到氣道上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因的長時間表達(dá)，證實了上面所證明的在自然器官中的觀察(圖5b)。重要的是應(yīng)該強(qiáng)調(diào)，接受表達(dá)GFP的EHV-1載體的小鼠中沒有一只在觀察期間表現(xiàn)出任何疾病跡象，因為使用的是無毒的和遺傳上減毒的病毒。這些結(jié)果顯示，EHV-1能在體內(nèi)有效轉(zhuǎn)導(dǎo)非馬來源的細(xì)胞，而不引起任何臨床癥狀。匯總起來，上述實施例清楚證明，分離自牛、豬和人的原代外周血單核細(xì)胞(PBMC)可有效地被EHV-1所感染。EHV-1的這一特性是通過使用表達(dá)增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(EGFP)的重組病毒而顯示出來的，該增強(qiáng)的綠色熒光蛋白位于HCMV即刻早期啟動子/增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄控制之下。人類PBMC可以以高達(dá)分離的、Ficoll梯度純化的、和伴刀豆球蛋白A刺激的細(xì)胞的25％的效率被感染，反之大約0.5％至2％的未刺激細(xì)胞可被感染。具有各種表型標(biāo)記物(CD3+、CD4+、CD8+、CD11b+、和CD19+)的細(xì)胞可以以幾乎相同的效率被感染。此外，使用＜1的感染復(fù)數(shù)，實際上100％的人細(xì)胞系是CD4+人細(xì)胞系MT4、人黑素瘤細(xì)胞系MEWO、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HuH7、人腎癌細(xì)胞293、和人宮頸癌細(xì)胞系HeLa可被EHV-1感染。當(dāng)被感染的細(xì)胞在感染后被增殖時，GFP表達(dá)可在幾次連續(xù)傳代中被檢測。然而，病毒感染后細(xì)胞不死亡，并且沒有觀察到傳染性向細(xì)胞培養(yǎng)物上清中的釋放。這些結(jié)果顯示，在非允許細(xì)胞中建立了非溶解性EHV-1感染。此外，EHV-1能以高效率進(jìn)入豬腎PK15、牛Madine Darby牛腎細(xì)胞(MDBK)、貓胚細(xì)胞(KE-R)、雞胚細(xì)胞、和鵪鶉肌肉細(xì)胞QM7。因為包括EHV-1在內(nèi)的皰疹病毒展現(xiàn)出高的包裝容量(＞100kbp)，并且因為EHV-1能在復(fù)制細(xì)胞中建立潛伏感染，在動物和人中進(jìn)行免疫、抗腫瘤治療、自體免疫疾病的治療以及基因治療方面，使用EHV-1作為異源核酸序列的預(yù)防性和治療性遞送的通用載體是可能的。
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權(quán)利要求
1.源自病毒的重組動物病毒，該病毒天然狀態(tài)下不以人或其它動物物種作為宿主或終末宿主，該重組動物病毒在原代細(xì)胞中具有復(fù)制能力或是復(fù)制缺陷的，具有以小于1的感染復(fù)數(shù)體外轉(zhuǎn)導(dǎo)原代細(xì)胞的能力，所述原代細(xì)胞源自不是天然或終末宿主的生物體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的重組動物病毒，進(jìn)一步具有在體內(nèi)以低顆粒數(shù)目有效轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的能力，該低顆粒數(shù)目在小于106至108顆粒/生物體范圍內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的重組動物病毒，其中轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致了免疫反應(yīng)在生物學(xué)上可測量的誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的表達(dá)，該轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的表達(dá)足以在受處理的生物體內(nèi)誘導(dǎo)預(yù)防性或治療性或診斷性效應(yīng)。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一所述的重組動物病毒，所述病毒是馬皰疹病毒。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一所述的重組動物病毒，所述原代細(xì)胞來源于人，寵物動物或牲畜。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一所述的重組動物病毒，包含轉(zhuǎn)基因。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一所述的重組動物病毒，缺乏至少一個對在其天然宿主或源自天然宿主的細(xì)胞或細(xì)胞系中復(fù)制是必需的基因。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一所述的重組動物病毒，包含ORIS和/或ORIL，以及包裝(pac)序列。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一所述的重組動物病毒在制備針對疾病進(jìn)行治療或診斷或免疫的藥學(xué)試劑或診斷試劑或疫苗中的用途，其中所述重組動物病毒以低顆粒數(shù)目投藥給受治療的個體，該低顆粒數(shù)目在小于106至108顆粒/劑量范圍內(nèi)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的重組動物病毒，其用作基因?qū)蜉d體，其中所述重組動物病毒以低顆粒數(shù)目投藥給受治療的個體，該低顆粒數(shù)目在小于106至108顆粒/劑量范圍內(nèi)。
11.用根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的重組動物病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的原代細(xì)胞。
12.攜帶至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的重組動物病毒的包裝細(xì)胞系，缺乏病毒包裝序列，ORIS和/或ORIL，但反式提供和補(bǔ)充從載體上除去的對病毒DNA包裝所需要和必需的基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及動物病毒，例如動物皰疹病毒，作為異源基因和核酸分別向動物、人類或其來源的原代細(xì)胞進(jìn)行診斷性、治療性和預(yù)防性遞送的載體。通過使用所述病毒，傳染性、自體免疫和腫瘤疾病被預(yù)防和治療，并且變態(tài)反應(yīng)和遺傳性疾病可被治療。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用重組動物病毒體外和體內(nèi)有效轉(zhuǎn)導(dǎo)原代人類細(xì)胞的步驟。發(fā)明進(jìn)一步涉及試劑盒，對于(i)診斷和監(jiān)測先天的和獲得性的免疫應(yīng)答，以及(ii)基因治療，和(iii)免疫目的是有用的。
文檔編號C12N15/869GK1678749SQ03820044
公開日2005年10月5日 申請日期2003年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月30日
發(fā)明者馬丁·比爾, 尼古勞斯·奧斯特里德, 詹斯·魯?shù)婪? 薩沙·特拉普, 拉爾夫·瓦格納 申請人:基因藝術(shù)有限責(zé)任公司