專利名稱：糖皮質(zhì)激素修飾聚乙烯亞胺的基因載體材料的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因藥物的載體的制備技術(shù)，尤其涉及一種糖皮質(zhì)激素修飾聚乙 烯亞胺的基因載體材料的制備方法。
背景技術(shù)：
隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，特別是人類基因庫(kù)的建立和人類疾病相關(guān)基因的闡明， 疾病的基因治療應(yīng)運(yùn)而生，并已發(fā)展為當(dāng)代醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的一個(gè)新的研究領(lǐng)域，被認(rèn)為是 治療遺傳性先天疾病、惡性腫瘤、傳染病等最有希望的治療方案之一。目前的轉(zhuǎn)染載體基本上可分為兩類病毒載體與非病毒載體。非病毒基因載體能 夠克服病毒基因載體的許多內(nèi)在問題，諸如無免疫原性、無遺傳毒性、細(xì)胞毒性低、成本低 等等，是治療基因體內(nèi)給藥不可替代的傳遞系統(tǒng)，具有重要的臨床實(shí)用潛力。但是，相比于 病毒載體，非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率低，限制了其實(shí)際應(yīng)用。糖皮質(zhì)激素是一種強(qiáng)疏水性的類固醇激素，能與細(xì)胞中的糖皮質(zhì)激素受體(GR) 結(jié)合，形成激素_受體復(fù)合物，瞬間轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核，通過正性或負(fù)性調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，改變細(xì) 胞的生理功能。GR為多蛋白復(fù)合體，存在于幾乎所有脊椎動(dòng)物組織細(xì)胞中，在無配體存在時(shí) 主要存在于細(xì)胞質(zhì)，其核定位信號(hào)(NLS)被隱藏。GR與強(qiáng)疏水性的糖皮質(zhì)激素結(jié)合以后， NLS被暴露出來，其可以短暫改變核屏障的結(jié)構(gòu)與穿透性，將核膜上的核孔擴(kuò)張至60nm，有 利于大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核。因此可以選擇糖皮質(zhì)激素作為NLS，提高基因載體的轉(zhuǎn)染效 率。聚乙烯亞胺(Polyethylenimine，PEI)是一種陽(yáng)離子聚合物，PEI的單體 為-CH2-CH2-NH-，結(jié)構(gòu)骨架中每三個(gè)原子中含一個(gè)氨基，具有很高的正電荷密度，具有較強(qiáng) 的DNA結(jié)合能力和細(xì)胞吸附能力。PEI具有強(qiáng)大的緩沖能力，被細(xì)胞內(nèi)吞后能抑制溶酶體內(nèi) 酸化，防止所傳遞的DNA被降解，并改變?nèi)苊阁w中的離子滲透壓，引起溶酶體膜的破裂并釋 放其中的DNA，Sr質(zhì)子海綿”效應(yīng)。PEI的分子量范圍很寬，其分子量對(duì)其轉(zhuǎn)染效果和細(xì)胞 毒性影響很大。分子量越高，PEI表面的電荷密度越大，轉(zhuǎn)染效率越高，毒性越大。低分子 量PEI的毒性較低，其轉(zhuǎn)染效率也較低。PEI進(jìn)入細(xì)胞后不會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核，因此如果將糖皮 質(zhì)激素與小分子量PEI連接，預(yù)計(jì)能得到低毒、高效的基因載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種糖皮質(zhì)激素修飾聚乙烯亞胺的基 因載體材料的制備方法，本發(fā)明通過糖皮質(zhì)激素的NLS作用，可以提高基因轉(zhuǎn)染效率。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種糖皮質(zhì)激素修飾聚乙烯亞胺的 基因載體材料的制備方法，包括以下步驟(1)將糖皮質(zhì)激素上的C-21羥基用甲磺酰氯酯化，合成糖皮質(zhì)激素21位甲磺酸 (2)將合成的糖皮質(zhì)激素21位甲磺酸酯與低分子量PEI用Traut’ s試劑連接合
3成目標(biāo)產(chǎn)物糖皮質(zhì)激素修飾聚乙烯亞胺。進(jìn)一步地，所述步驟(1)具體為取C-21羥基的糖皮質(zhì)激素用無水吡啶溶解，溶液 于0°C，N2保護(hù)，攪拌下，慢慢滴加過量的甲磺酰氯，反應(yīng)于0°C進(jìn)行5h，反應(yīng)溶液加入0°C的 過量的純水終止反應(yīng)，抽濾，冰水洗滌，真空干燥，得到白色固體，即糖皮質(zhì)激素21位甲磺酸酯。進(jìn)一步地，所述無水吡啶的制備如下吡啶中加入NaOH，加熱回流2小時(shí)，再蒸餾 得到無水吡啶。進(jìn)一步地，所述步驟(2)具體為將合成的糖皮質(zhì)激素21位甲磺酸酯和Traut’ s 試劑溶于無水DMS0中，將低分子量PEI 1800溶于無水DMS0中，在N2保護(hù)下滴加入前者溶 液中，邊加邊攪拌。反應(yīng)室溫下進(jìn)行4h，然后加入過量的冰的乙酸乙酯，過濾得到淡黃色沉 淀，加入適量純水溶解，0. 45um微孔濾膜過濾，純水透析48小時(shí)。冷凍干燥得淡黃色固體， 即為目標(biāo)產(chǎn)物糖皮質(zhì)激素修飾聚乙烯亞胺。進(jìn)一步地，所述無水DMS0的制備如下DMS0中加入氫化鈣，放置48小時(shí)，減壓蒸 餾得無水DMS0。本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明用糖皮質(zhì)激素修飾低分子量PEI，合成一種新型的基 因載體材料，這種材料具有“質(zhì)子海綿作用”，能夠有效結(jié)合DNA，又能夠在糖皮質(zhì)激素的介 導(dǎo)下加入細(xì)胞核，提高轉(zhuǎn)染效率，是一種低毒，高效，合成簡(jiǎn)單的非病毒基因載體，具有廣闊 的應(yīng)用前景。


圖1是糖皮質(zhì)激素修飾聚乙烯亞胺的合成路線；圖2是糖皮質(zhì)激素21位甲磺酸酯的i-NMR圖譜；圖3是糖皮質(zhì)激素修飾聚乙烯亞胺的i-NMR圖譜；圖4是糖皮質(zhì)激素修飾聚乙烯亞胺的細(xì)胞毒性圖；圖5是糖皮質(zhì)激素修飾聚乙烯亞胺的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明糖皮質(zhì)激素修飾聚乙烯亞胺的基因載體材料的制備方法，包括以下步驟1.將糖皮質(zhì)激素上的C-21羥基用甲磺酰氯酯化，合成糖皮質(zhì)激素21位甲磺酸酯。所用糖皮質(zhì)激素的21位為羥基，取C-21羥基的糖皮質(zhì)激素用無水吡啶溶解，溶液 于0°C，N2保護(hù)，攪拌下，慢慢滴加過量的甲磺酰氯，反應(yīng)于0°C進(jìn)行5h，反應(yīng)溶液加入0°C的 過量的純水終止反應(yīng)，抽濾，冰水洗滌，真空干燥，得到白色固體，即糖皮質(zhì)激素21位甲磺 酸酯。2.糖皮質(zhì)激素21位甲磺酸酯與低分子量PEI用Traut's試劑連接合成目標(biāo)產(chǎn)物 糖皮質(zhì)激素修飾聚乙烯亞胺。將糖皮質(zhì)激素21位甲磺酸酯和Traut，s試劑溶于無水DMS0中，將低分子量PEI 1800溶于無水DMS0中，在N2保護(hù)下滴加入前者溶液中，邊加邊攪拌。反應(yīng)室溫下進(jìn)行4h， 然后加入過量的冰的乙酸乙酯，過濾得到淡黃色沉淀，加入適量純水溶解，0. 45um微孔濾 膜過濾，純水透析(截留分子量1000)48小時(shí)。冷凍干燥得淡黃色固體，即為目標(biāo)產(chǎn)物糖皮
4質(zhì)激素修飾聚乙烯亞胺。無水吡啶的制備如下吡啶中加入適量NaOH，加熱回流2小時(shí)，再蒸餾得到無水吡啶。無水DMS0的制備如下DMS0中加入氫化鈣，放置48小時(shí)，減壓蒸餾得無水DMS0。下面根據(jù)實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，本發(fā)明的目的和效果將變得更加明顯。實(shí)施例1 取倍他米松196. 25mg用無水吡啶溶解，溶液于0°C，N2保護(hù)，攪拌下，慢慢滴加過 量的甲磺酰氯78 u L，反應(yīng)于0°C進(jìn)行5h，反應(yīng)溶液加入0°C的過量的冰水(約80mL)終止 反應(yīng)，抽濾，冰水洗滌，真空干燥，得到白色固體，為倍他米松21位甲磺酸酯。核磁圖參見附 圖2。將4倍過量的倍他米松21位甲磺酸酯117. 65mg和Traut，s試劑34. 4mg溶于無 水DMSO 2mL中，將低分子量PEI 1800 112. 5mg溶于無水DMSO 2mL中，在N2保護(hù)下滴加入 前者溶液中，邊加邊攪拌。反應(yīng)室溫下進(jìn)行4h，然后加入過量的冰的乙酸乙酯80mL，過濾得 到淡黃色沉淀，加入適量純水溶解，0. 45um微孔濾膜過濾，純水透析(截留分子量1000) 48 小時(shí)。冷凍干燥得淡黃色固體，即為倍他米松-聚乙烯亞胺。合成反應(yīng)方程式參見附圖1。 核磁圖參見附圖3。實(shí)施例2:取地塞米松196. 25mg用無水吡啶溶解，溶液于0°C，N2保護(hù)，攪拌下，慢慢滴加過 量的甲磺酰氯78 u L，反應(yīng)于0°C進(jìn)行5h，反應(yīng)溶液加入0°C的過量的冰水80mL終止反應(yīng)， 抽濾，冰水洗滌，真空干燥，得到白色固體，為地塞米松21位甲磺酸酯。核磁圖參見附圖2。將地塞米松21位甲磺酸酯117. 65mg和Traut，s試劑34. 4mg溶于無水DMSO 2mL 中，將低分子量PEI 1800 112. 5mg溶于無水DMSO 2mL中，在N2保護(hù)下滴加入前者溶液中， 邊加邊攪拌。反應(yīng)室溫下進(jìn)行4h，然后加入過量的冰的乙酸乙酯80mL，過濾得到淡黃色沉 淀，加入適量純水溶解，0. 45 ym微孔濾膜過濾，純水透析(截留分子量1000)48小時(shí)。冷凍 干燥得淡黃色固體，即為地塞米松_聚乙烯亞胺。合成反應(yīng)方程式參見附圖1。核磁圖參見 附圖3。實(shí)施例3 取甲基氫化潑尼松187. 24mg用無水吡啶溶解，溶液于0°C，N2保護(hù)，攪拌下，慢慢 滴加過量的甲磺酰氯78 u L，反應(yīng)于0°C進(jìn)行5h，反應(yīng)溶液加入0°C的過量的冰水80mL終止 反應(yīng)，抽濾，冰水洗滌，真空干燥，得到白色固體，為甲基氫化潑尼松21位甲磺酸酯。核磁圖 參見附圖2。將甲基氫化潑尼松21位甲磺酸酯113. 2mg和Traut，s試劑34. 4mg溶于無水DMS0 2mL中，將低分子量PEI 1800 112. 5mg溶于無水DMSO 2mL中，在N2保護(hù)下滴加入前者溶液 中，邊加邊攪拌。反應(yīng)室溫下進(jìn)行4h，然后加入過量的冰的乙酸乙酯80mL，過濾得到淡黃色 沉淀，加入適量純水溶解，0. 45 ym微孔濾膜過濾，純水透析(截留分子量1000)48小時(shí)。冷 凍干燥得淡黃色固體，即為甲基氫化潑尼松-聚乙烯亞胺。合成反應(yīng)方程式參見附圖1。核 磁圖參見附圖3。實(shí)施例4 取氫化潑尼松180. 2mg用無水吡啶溶解，溶液于0°C，N2保護(hù)，攪拌下，慢慢滴加過量的甲磺酰氯78 u L，反應(yīng)于0°C進(jìn)行5h，反應(yīng)溶液加入0°C的過量的冰水80mL終止反應(yīng)， 抽濾，冰水洗滌，真空干燥，得到白色固體，為氫化潑尼松21位甲磺酸酯。核磁圖參見附圖 2。將氫化潑尼松21位甲磺酸酯109. 6mg和Traut，s試劑34. 4mg溶于無水DMSO 2mL 中，將低分子量PEI 1800 112. 5mg溶于無水DMSO 2mL中，在N2保護(hù)下滴加入前者溶液中， 邊加邊攪拌。反應(yīng)室溫下進(jìn)行4h，然后加入過量的冰的乙酸乙酯80mL，過濾得到淡黃色沉 淀，加入適量純水溶解，0. 45 ym微孔濾膜過濾，純水透析(截留分子量1000)48小時(shí)。冷凍 干燥得淡黃色固體，即為氫化潑尼松-聚乙烯亞胺。合成反應(yīng)方程式參見附圖1。核磁圖參 見附圖3。實(shí)施例5 取氫化可的松181. 2mg用無水吡啶溶解，溶液于0°C，N2保護(hù)，攪拌下，慢慢滴加過 量的甲磺酰氯78 u L，反應(yīng)于0°C進(jìn)行5h，反應(yīng)溶液加入0°C的過量的冰水80mL終止反應(yīng)， 抽濾，冰水洗滌，真空干燥，得到白色固體，為氫化可的松21位甲磺酸酯。核磁圖參見附圖 2。將氫化可的松21位甲磺酸酯110. 14mg和Traut，s試劑34. 4mg溶于無水DMS0 2mL中，將低分子量PEI 1800 112. 5mg溶于無水DMSO 2mL中，在N2保護(hù)下滴加入前者溶液 中，邊加邊攪拌。反應(yīng)室溫下進(jìn)行4h，然后加入過量的冰的乙酸乙酯80mL，過濾得到淡黃色 沉淀，加入適量純水溶解，0. 45 ym微孔濾膜過濾，純水透析(截留分子量1000)48小時(shí)。冷 凍干燥得淡黃色固體，即為氫化可的松-聚乙烯亞胺。合成反應(yīng)方程式參見附圖1。核磁圖 參見附圖3。實(shí)施例6 糖皮質(zhì)激素21位甲磺酸酯和糖皮質(zhì)激素-聚乙烯亞胺(GC-PEI)的核 磁共振表征將適量糖皮質(zhì)激素21位甲磺酸酯溶于氘代DMS0中，進(jìn)行500MHzlH-NMR掃描(參 見附圖2)。將適量GC-PEI溶于氘水中，進(jìn)行500MHz 1H-NMR掃描(參見附圖3)。實(shí)施例7 各種GC-PEI材料的細(xì)胞毒性HepG 2細(xì)胞(1X104/孔)接種于96孔培養(yǎng)板，過夜培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，匯合度為 60 80%。PBS洗滌后加入無血清培養(yǎng)基lOOiiL/孔，并加入不同量的PEI1800、PEI 25K、 GC-PEI材料，空白對(duì)照組加100 yL無血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h之后移去培養(yǎng)基，加 入180 ii L無血清培養(yǎng)基和20 ii L MTT (5mg/mL)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，加入100 u L DMSO每 孔，振搖lOmin，酶標(biāo)儀上，于570nm測(cè)定A值。按以下公式計(jì)算細(xì)胞生存率。細(xì)胞生存率(％ ) = (A樣品/八空白)X100%結(jié)果表明GC-PEI材料的細(xì)胞毒性小于PEI 25K，大于PEI 1800，結(jié)果參見附圖4。實(shí)施例8 各種GC-PEI材料的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率測(cè)定pGL-3轉(zhuǎn)染細(xì)胞HepG 2細(xì)胞(1X105/孔)接種于24孔培養(yǎng)板，過夜培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，匯合度為 60 80%。將GC-PEI材料溶液、PEI 25K、PEI 1800、pGL-3質(zhì)粒DNA溶液過濾除菌，按照 不同質(zhì)量比用滅菌純水稀釋、混合、孵育30min，得復(fù)合物。將24孔板中培養(yǎng)基吸去，滅菌 PBS洗一遍，將配好的復(fù)合物加入細(xì)胞中，控制每孔的DNA含量為2 y g。再加入不含血清的 培養(yǎng)基，使每孔的總體積為500 iiL。以PEI 25K為陽(yáng)性對(duì)照，PEI 1800為陰性對(duì)照。放入37°C C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)6小時(shí)，吸去轉(zhuǎn)染液，每孔加入500 iiL含10%小牛血清的培養(yǎng)基，繼 續(xù)培養(yǎng)48h。吸去培養(yǎng)基，PBS洗一次，每孔加入500 u L細(xì)胞裂解液，裂解30min，轉(zhuǎn)移至EP 管中，12000rpm，4°C 離心 5min。取 100 ii L 上清液，加入 100 ii L Luc if erase (Promega)測(cè)定 相對(duì)光單位。其蛋白含量用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。以相對(duì)光單位/蛋白含量作為轉(zhuǎn)染 效率的評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果見附圖5。結(jié)果表明GC-PEI材料在最佳質(zhì)量比時(shí)轉(zhuǎn)染效率大于PEI 1800。本發(fā)明所涉及的糖皮質(zhì)激素不限于實(shí)施例中的糖皮質(zhì)激素，包括所有具有21位 羥基的糖皮質(zhì)激素。上述實(shí)施例用來解釋說明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制，在本發(fā)明的精神和 權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種糖皮質(zhì)激素修飾聚乙烯亞胺的基因載體材料的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將糖皮質(zhì)激素上的C-21羥基用甲磺酰氯酯化，合成糖皮質(zhì)激素21位甲磺酸酯。(2)將合成的糖皮質(zhì)激素21位甲磺酸酯與低分子量PEI用Traut’s試劑連接合成目標(biāo)產(chǎn)物糖皮質(zhì)激素修飾聚乙烯亞胺。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述糖皮質(zhì)激素修飾聚乙烯亞胺的基因載體材料的制備方法，其特 征在于，所述步驟(1)具體為取C-21羥基的糖皮質(zhì)激素用無水吡啶溶解，溶液于0°C，N2 保護(hù)，攪拌下，慢慢滴加過量的甲磺酰氯，反應(yīng)于0°C進(jìn)行5h，反應(yīng)溶液加入0°C的過量的純 水終止反應(yīng)，抽濾，冰水洗滌，真空干燥，得到白色固體，即糖皮質(zhì)激素21位甲磺酸酯。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述糖皮質(zhì)激素修飾聚乙烯亞胺的基因載體材料的制備方法，其特 征在于，所述無水吡啶的制備如下吡啶中加入NaOH，加熱回流2小時(shí)，再蒸餾得到無水吡 啶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述糖皮質(zhì)激素修飾聚乙烯亞胺的基因載體材料的制備方法，其特 征在于，所述步驟(2)具體為將合成的糖皮質(zhì)激素21位甲磺酸酯和Traut’ s試劑溶于無 水DMSO中，將低分子量PEI 1800溶于無水DMSO中，在N2保護(hù)下滴加入前者溶液中，邊加 邊攪拌。反應(yīng)室溫下進(jìn)行4h，然后加入過量的冰的乙酸乙酯，過濾得到淡黃色沉淀，加入適 量純水溶解，0. 45 μ m微孔濾膜過濾，純水透析48小時(shí)。冷凍干燥得淡黃色固體，即為目標(biāo) 產(chǎn)物糖皮質(zhì)激素修飾聚乙烯亞胺。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述糖皮質(zhì)激素修飾聚乙烯亞胺的基因載體材料的制備方法，其 特征在于，所述無水DMSO的制備如下DMS0中加入氫化鈣，放置48小時(shí)，減壓蒸餾得無水 DMSO0
全文摘要
本發(fā)明提供一種糖皮質(zhì)激素修飾聚乙烯亞胺的基因載體材料的制備方法，該方法先將糖皮質(zhì)激素的21位羥基與甲磺酰氯生成21位甲磺酸酯，再將糖皮質(zhì)激素21位甲磺酸酯和低分子量PEI用Traut’s試劑連接，經(jīng)過純化，凍干得到目標(biāo)產(chǎn)物。本發(fā)明具有“質(zhì)子海綿作用”，能夠有效結(jié)合DNA，又能夠在糖皮質(zhì)激素的介導(dǎo)下加入細(xì)胞核，提高轉(zhuǎn)染效率，是一種低毒，高效，合成簡(jiǎn)單的基因載體，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C08G73/04GK101864075SQ200910154929
公開日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2009年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月30日
發(fā)明者王成潤(rùn), 胡敏新, 金 一, 馬昆, 齊巖 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)