專利名稱：重組抗原pp65包被酶標(biāo)反應(yīng)板的制法及ELISA檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的生物制劑HCMVpp65重組蛋白，是一種用于檢測(cè)HCMV-IgM的ELISA檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
人巨細(xì)胞病毒(Human Cytomegalovirus，HCMV)屬于人類皰疹病毒β亞科病毒，在人群中的感染極為普遍，呈世界性分布。血清流行病學(xué)調(diào)查表明，40-100％成人有HCMV抗體；不同國(guó)家，不同經(jīng)濟(jì)狀況，不同的人群，不同的年齡段，HCMV感染率不同，其流行無(wú)季節(jié)性傾向。在亞洲和非洲90％的人口受感染，其中大多數(shù)人在青少年時(shí)期即有抗體，說(shuō)明感染年齡較早，而西方國(guó)家其感染發(fā)生較晚；低經(jīng)濟(jì)收入人群較高經(jīng)濟(jì)收入人群感染率高。HCMV是人類先天性感染最常見的病原體之一，對(duì)孕婦及胎兒影響巨大，常造成流產(chǎn)、死胎、胎兒畸形、發(fā)育遲緩及遲發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺陷等疾病。先天性感染的嬰兒出生時(shí)可無(wú)癥狀，但也有嚴(yán)重者可累及多臟器，甚至死亡。有癥狀者可見肝脾腫大，黃疸，瘀斑或紫癜，脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎，小頭畸形等?；純簳?huì)出現(xiàn)不同程度的聽力、視力減退，意識(shí)、運(yùn)動(dòng)障礙，智力遲鈍等。HCMV已經(jīng)成為損害兒童健康的重要病原體，因此HCMV的檢測(cè)成為孕婦和新生兒保健的常規(guī)項(xiàng)目之一。HCMV感染可引起機(jī)體的免疫功能降低，特別是細(xì)胞免疫功能下降，引起多種疾病的發(fā)生，如肝炎、器官移植失敗等。此外，HCMV可經(jīng)乳汁、宮頸液、血制品、移植的器官或細(xì)胞等進(jìn)行傳播。初次感染后，潛伏于骨髓細(xì)胞等；當(dāng)免疫功能受損時(shí)，潛伏的病毒易被激活，導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床癥狀，尤其是在發(fā)育的胎兒、新生兒、免疫抑制或免疫功能低下的人群中，HCMV感染可引起甚至是致死性的臨床癥狀。
鑒于HCMV對(duì)人類的危害性較大，發(fā)現(xiàn)患者及時(shí)采取措施是保障人口素質(zhì)及提高人類健康水平的關(guān)鍵。我國(guó)每年需要作HCMV檢測(cè)的人群大約至少有一千多萬(wàn)人次。目前市場(chǎng)上HCMV的各種免疫診斷試劑盒質(zhì)量參差不齊，既無(wú)統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，又在無(wú)序生產(chǎn)與應(yīng)用，給HCMV的預(yù)防和診治造成嚴(yán)重障礙。目前關(guān)于HCMV體外診斷試劑國(guó)內(nèi)外雖上市，但國(guó)外產(chǎn)品價(jià)格昂貴，不適合我國(guó)國(guó)情。而國(guó)產(chǎn)試劑盒多采用細(xì)胞培養(yǎng)的全病毒粗制抗原檢測(cè)血清中特異性IgM，病毒產(chǎn)量低，所得病毒抗原純度較低，且其抗原性可能與其它皰疹病毒有交叉，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性；這些試劑盒存在穩(wěn)定性和重復(fù)性較差、靈敏度和特異性不高等缺點(diǎn)。另外，調(diào)查對(duì)比證實(shí)，各廠家生產(chǎn)的產(chǎn)品間存在較大的質(zhì)量差異，其最小檢出量可相差15～30倍。國(guó)內(nèi)檢測(cè)試劑存在質(zhì)量差異的主要原因可能與生產(chǎn)廠家質(zhì)量意識(shí)淡漠，缺少質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種新的HCMVpp65-IgM型ELISA檢測(cè)試劑盒。
本發(fā)明技術(shù)方案如下特異性重組抗原pp65包被反應(yīng)板的制備方法，通過(guò)下列步驟制備而成(1)pp65重組蛋白的獲得①HCMV pp65的原核表達(dá)以HCMV AD169 DNA為模板，用特異性引物PCR擴(kuò)增pp65(1006-1521nt)目的基因，目的基因克隆于pET-T0P0原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)菌。根據(jù)氨卞青霉素抗性提取克隆，快速提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA，鑒定，得到與目的片斷分子量相一致的片斷，判為陽(yáng)性結(jié)果。以PCR陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，載體pET100-pp65-DNA測(cè)序，結(jié)果表明pp65基因編碼序列已正確連入pET100，具有一個(gè)516bp完整的開放閱讀框(ORF)，與GenBank中pp65基因98％的同源性。推算其蛋白質(zhì)分子量為22.8KD，pI為4.18。
②pp65重組蛋白鑒定將目的基因的重組質(zhì)粒PET/pp65轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，菌體蛋白經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳及考馬斯亮藍(lán)染色顯示，與空菌相比，在20～30KD有一條濃染的新增蛋白條帶。經(jīng)Western blotting鑒定，能與pp65單克隆抗體發(fā)生強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，pp65重組蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性。
③HCMV pp65重組蛋白的大量表達(dá)、純化經(jīng)過(guò)大量誘導(dǎo)，表達(dá)，親和層析純化后得到大量pp65重組蛋白。
(2)將pp65重組蛋白作為抗原，用pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋成適宜濃度后按100μl/孔包被96孔酶標(biāo)板，置濕盒中4℃12～24小時(shí)，PBST洗板3次，每次3min，然后拍干；得到抗原pp65包被酶標(biāo)板。
(3)用含10％小牛血清的PBST加滿孔(約200μl/孔)，37℃孵育，封閉1h，洗板3次，拍干并密封，即可得到pp65抗原包被酶標(biāo)反應(yīng)板。
這種新的HCMVpp65 IgM型ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述試劑盒由上述特異性重組抗原pp65包被板、標(biāo)本稀釋液、洗滌液、酶標(biāo)二抗、顯色液、終止液構(gòu)成。具體分為(1)標(biāo)本稀釋液含10％小牛血清和2％抗人IgG的0.01M pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)；(2)洗滌液含有0.05％Tween 20的磷酸鹽緩沖液(PBST)；(3)酶標(biāo)二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人IgM單抗；(4)顯色液TMB-H2O2尿素溶液；(4)終止液2mol/L H2SO4溶液。
HCMVpp65是參與HCMV病毒基因表達(dá)調(diào)控，改變宿主細(xì)胞代謝，有利于病毒復(fù)制的重要蛋白質(zhì)；pp65蛋白作為HCMV主要被膜磷蛋白，不僅是病毒血癥中的主要蛋白抗原，而且是HCMV特異性CTL的最主要靶分子；其既能誘導(dǎo)特異性抗體產(chǎn)生，亦能誘導(dǎo)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答；是Th細(xì)胞及T記憶細(xì)胞的主要識(shí)別及作用抗原。鑒于pp65具有這些重要的功能及良好的抗原性，本發(fā)明選取了編碼HCMV pp65蛋白的部分序列基因(1006～1521nt)，采用基因重組技術(shù)，原核表達(dá)，親和層析后獲得一種新的pp65重組蛋白。經(jīng)過(guò)改造過(guò)的pp65重組蛋白既保留了其抗原性，又提高了pp65重組蛋白的原核表達(dá)量。采用該重組蛋白，本發(fā)明成功地用間接ELISA法，方便快速地檢出特異性HCMV-IgM，并將該結(jié)果與美國(guó)BioCheck試劑盒相比較，一致性為97.0％。
本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)結(jié)果與國(guó)產(chǎn)的全病毒--ELISA法及美國(guó)BioCheck試劑盒的檢測(cè)陽(yáng)性率分別是本法為44％；全病毒--ELISA法50％；美國(guó)BioCheck試劑盒45％。特異性本法為98.2％，高于全病毒--ELISA法90.9％，正確指數(shù)是92.8％，且與美國(guó)BioCheck法有較高一致性，為97.0％。
本發(fā)明試劑盒選取HCMV抗原性較強(qiáng)的pp65蛋白的部分序列，通過(guò)分析，選擇其中的抗原表位和親水性區(qū)域，采用基因重組技術(shù)，原核表達(dá)，親和層析后獲得一種新的pp65重組蛋白，該抗原不僅具有高特異性，且具有高純度和高穩(wěn)定性，在提取純化后，包板作為試劑盒中的重要組分。與全病毒抗原相比，該重組抗原可規(guī)?；?biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，更安全、經(jīng)濟(jì)。
具體實(shí)施例方式
1、試劑(1)包被液(0.05mol/l，pH9.6的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液)Na2CO31.5g，NaHCO32.9g，Na2N30.2g，加雙蒸水至1000ml，調(diào)至pH9.6。
(2)標(biāo)本稀釋液(含10％小牛血清和2％抗人IgG的0.01M PBS pH7.4)NaCl 8.0g、KH2PO40.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、KCl 0.2g，硫柳汞0.1g，加雙蒸水至1000ml，調(diào)至pH7.4，為PBS。
(3)封閉液(10％小牛血清/PBS溶液)小牛血清100ml，1×PBS(pH7.4)900ml。
(4)洗滌液(PBST，pH7.4)NaCl 8.0g、KH2PO40.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、KCl 0.2g、Tween 20 0.5ml、硫柳汞0.1g、加雙蒸水至1000ml，調(diào)至pH7.4。
(5)酶標(biāo)二抗(HRP*鼠抗人IgM單抗)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人IgM單抗，由本室自行生產(chǎn)。
(6)底物液(TMB-H2O2尿素溶液)①底物液A(3、3‘、5、5‘-四甲基聯(lián)苯胺，TMB)TMB200mg，無(wú)水乙醇100ml，加雙蒸水至1000ml。
②底物液B緩沖液(0.1mol/L檸檬酸-0.2mol/L磷酸氫二鈉緩沖液，pH5.0～5.4)Na2HPO414.60g，檸檬酸9.33g，0.75％過(guò)氧化氫尿素6.4ml，加雙蒸水至1000ml，調(diào)至pH5.0～5.4。
③將底物液A和B按1∶1混合，即成TMB-H2O2尿素應(yīng)用液。
(7)終止液(2mol/L H2SO4溶液)雙蒸水600ml，濃硫酸100ml(緩慢滴加并不斷攪拌)，加雙蒸水至900ml。
2、主要儀器(1)酶標(biāo)儀BIO-RAD Model 550(2)ELISA反應(yīng)板Corning Incorporated costar R 96 Well EIA/RIA plate3、方法酶標(biāo)二抗最適滴度的選擇(1)用100ng/ml人IgM進(jìn)行包被，洗滌。
(2)將酶標(biāo)抗人IgM單抗用稀釋液作一系列稀釋后分別加入已包被的孔中，保溫、洗滌。
(3)加底物顯色。加酸終止反應(yīng)后，讀取吸光度(A)，取A值在1.0時(shí)的酶標(biāo)抗體稀釋度，作為酶標(biāo)二抗的最適滴度為1∶1000。
棋盤滴定法選擇包被抗原最適滴度(1)用包被液將抗原作一系列稀釋后進(jìn)行包被，洗滌。
(2)將強(qiáng)陽(yáng)性參考血清、弱陽(yáng)性參考血清和陰性參考血清用稀釋液按10倍遞增系列稀釋，加樣，保溫，洗滌。
(3)加按最適滴度稀釋的酶標(biāo)抗人IgM單抗，保溫，洗滌。
(4)加底物顯色，加酸終止反應(yīng)后讀取A值。
(5)選擇強(qiáng)陽(yáng)性參考血清的A值為0.8～1.0間、陰性參考血清的A值小于0.1的包被抗原的稀釋度作為最適滴度為20～40μg/孔。
特異性重組抗原pp65包被反應(yīng)板的制備方法(1)將pp65蛋白質(zhì)抗原用pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋后包被96孔板，100μl/孔，置濕盒中4℃ 12～24小時(shí)，PBST洗板3次，每次3min，然后拍干；得到酶標(biāo)板。
(2)用含10％小牛血清的PBS加滿孔，37℃孵育，封閉1h，洗板3次后密封。該板即可得到抗原pp65包被酶標(biāo)反應(yīng)板。
試劑盒的構(gòu)成所述試劑盒由特異性重組抗原pp65包被酶標(biāo)反應(yīng)板、標(biāo)本稀釋液、洗滌液、顯色液、終止液構(gòu)成，具體組分為(1)標(biāo)本稀釋液含10％小牛血清和2％抗人IgG的0.01M PBS(pH7.4)；(2)酶標(biāo)二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人IgM單抗；(3)顯色液TMB-H2O2系統(tǒng)；(4)終止液2mol/L H2SO4。
利用上述試劑盒采用ELISA法檢測(cè)血清中HCMV IgM(1)待檢血清，加入1∶100稀釋的待檢血清到包被好的酶標(biāo)反應(yīng)板，100μl/孔，37℃孵育1h，洗板3次；(2)加酶標(biāo)物，加入HRP(辣根過(guò)氧化酶)標(biāo)記的鼠抗人IgM單抗，100μl/孔，37℃孵育40min，(3)顯色，洗板后每孔加入TMB-H2O2系統(tǒng)底物100μl，37℃或室溫避光顯色15分鐘；(4)每孔加入2mol/L H2SO450μl，終止反應(yīng)；(5)結(jié)果判斷，空白孔調(diào)零，讀取450nm波長(zhǎng)處吸光度，即OD 450值。
(6)計(jì)算結(jié)果，將待檢標(biāo)本血清平均OD值(P)除以陰性血清平均OD值(N)，求得P/N值，P/N≥2.1為陽(yáng)性，P/N＜2.1為陰性。
權(quán)利要求
1.重組抗原pp65包被酶標(biāo)反應(yīng)板的制法，通過(guò)下列步驟制備而成(1)、以HCMV AD169 DNA為模板，擴(kuò)增UL1006-1521nt基因，與克隆表達(dá)試劑TOPO-pET連接，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)StarTM，表達(dá)大量純化pp65蛋白；(2)、將pp65蛋白抗原用pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋后包被96孔板，100μl/孔，置濕盒中4℃ 12～24小時(shí)，PBST洗板3次，每次3min，然后拍干；(3)、用含10％小牛血清的PBS加滿孔，37℃孵育，封閉1h，洗板3次后密封；該板即為pp65抗原pp65包被酶標(biāo)反應(yīng)板，可用于HCMV pp65-IgM的特異性檢測(cè)用。
2.應(yīng)用重組抗原pp65包被酶標(biāo)反應(yīng)板的ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述試劑盒由特異性重組抗原pp65包被反應(yīng)板、標(biāo)本稀釋液、洗滌液、顯色液、終止液構(gòu)成，具體組份為(1)、標(biāo)本稀釋液含10％小牛血清和2％抗人IgG的0.01M PBS(pH7.4)；(2)酶標(biāo)二抗HRP*鼠抗人IgM單抗；(3)、顯色液TMB-H2O2系統(tǒng)(4)、終止液2mol/LH2SO4溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的重組抗原pp65包被酶標(biāo)反應(yīng)板的制法及ELISA檢測(cè)試劑盒，其關(guān)鍵技術(shù)之處主要在于，用基因工程方法制備特異性重組抗原——HCMV pp65。該抗原在提取純化后，包板作為試劑盒中的重要組成，另外，通過(guò)鼠—鼠雜交瘤技術(shù)制備的抗人IgM單克隆抗體，單克隆抗體經(jīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記后即可用于試劑盒的組裝。建立敏感快速的ELISA抗體捕獲血清中HCMV特異性IgM抗體的方法，具有高特異性，高穩(wěn)定性。試劑盒主要供實(shí)驗(yàn)室研究和臨床診斷使用。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1651918SQ20051003766
公開日2005年8月10日 申請(qǐng)日期2005年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月8日
發(fā)明者王明麗 申請(qǐng)人:王明麗