專利名稱：3－氯－1，2－丙二醇人工抗原制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人工抗原的制備，尤其是3-氯-1，2-丙二醇的人工抗原制備。
背景技術(shù)：
3-氯-1，2-丙二醇，英文縮寫為3-MCPD，通常被稱為三氯丙醇，是丙三醇被氯原子取代1個(gè)羥基形成的產(chǎn)物，是近年來備受關(guān)注的氯丙醇類有機(jī)污染物的一種。3-氯-1，2-丙二醇主要來源于酸水解植物蛋白質(zhì)(HVP)，HVP水解液常作為風(fēng)味劑被添加在醬油中，另外某些風(fēng)味快餐、固體湯料、焙烤糧食、黑麥和黑麥提取物、發(fā)酵類香腸、袋泡茶包裝袋、凈化飲用水的含氯凝聚劑、以3-氯-1，2-環(huán)氧丙烷加工的變性淀粉等也經(jīng)常出現(xiàn)3-氯-1，2-丙二醇，家庭烹調(diào)和有些食品的加工貯藏過程中有時(shí)也有氯丙醇出現(xiàn)。許多研究表明，3-氯-1，2-丙二醇會(huì)引起癌癥、影響腎臟及生育，引起貧血、白細(xì)胞減少、血小板減少，降低男性生育力，使雄性的腎臟及睪丸、乳腺、包皮腺癌變幾率增加。因此，很有必要加強(qiáng)3-氯-1，2-丙二醇的檢測(cè)。
3-氯-1，2-丙二醇檢測(cè)一直以來主要是色質(zhì)聯(lián)用法，目前國際上最先進(jìn)的檢測(cè)方法是穩(wěn)定性同位素稀釋質(zhì)譜技術(shù)，盡管這種方法準(zhǔn)確靈敏，檢測(cè)限低，但其前處理繁瑣，操作復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，設(shè)備昂貴，檢測(cè)費(fèi)用高，只能實(shí)驗(yàn)室操作，有一定的局限性，因此，人們迫切希望有一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏、廉價(jià)的檢測(cè)技術(shù)能對(duì)3-氯-1，2-丙二醇進(jìn)行大量樣品快速檢測(cè)。免疫分析恰好具備這樣的優(yōu)點(diǎn)，其特異性強(qiáng)、靈敏度高、對(duì)儀器設(shè)備要求不高、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)容量大、成本低、易普及推廣，世界糧農(nóng)組織已向多個(gè)國家推薦此項(xiàng)技術(shù)，美國化學(xué)學(xué)會(huì)將免疫分析技術(shù)、色譜分析技術(shù)共同列為化學(xué)污染物的主要分析技術(shù)。
要建立免疫分析方法，抗原、抗體是最關(guān)鍵的兩種試劑。對(duì)于小分子半抗原物質(zhì)，因?yàn)榉肿恿刻。Y(jié)構(gòu)太簡(jiǎn)單，不具有免疫原性，必須將其與大分子物質(zhì)偶聯(lián)制備成人工完全抗原，才能用于免疫動(dòng)物制備抗體。因此，精心設(shè)計(jì)半抗原結(jié)構(gòu)，選擇合適的方法將半抗原偶聯(lián)于大分子載體，獲取良好的人工抗原，就成為建立半抗原免疫檢測(cè)的前提和關(guān)鍵。只有制備出高質(zhì)量的人工抗原，才可能進(jìn)一步制備檢測(cè)所需抗體。目前，國內(nèi)外有關(guān)化學(xué)污染物免疫分析的研究已涉及到農(nóng)藥、獸藥、生物毒素等對(duì)象，但針對(duì)3-氯-1，2-丙二醇的免疫檢測(cè)研究尚未見任何報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明用3-氯乳酸作為半抗原，將3-氯乳酸與陽離子化載體在偶聯(lián)劑作用下偶聯(lián)，制備出3-氯-1，2-丙二醇的人工抗原。其中偶聯(lián)所用載體為陽離子化的載體，該陽離子化載體可為陽離子化試劑處理過的蛋白質(zhì)或其片段或合成多肽或半合成多肽，優(yōu)選的是陽離子化試劑處理過的牛血清白蛋白；載體陽離子化處理所用試劑為乙二胺；半抗原與陽離子化載體偶聯(lián)所用偶聯(lián)劑為水溶性碳二亞胺鹽酸鹽。
具體實(shí)施例方式(1)配置乙二胺溶液配置10％(v/v)的乙二胺溶液1mL，用6mol/L的鹽酸調(diào)整pH至6.0。
(2)乙二胺活化載體給乙二胺溶液中加入3mL 6.1mg/mL蛋白或多肽或合成多肽或半合成多肽水溶液，如牛血清白蛋白、L-多聚賴氨酸水溶液等，再加入0.8mg水溶性碳二亞胺鹽酸鹽，室溫反應(yīng)15min。
(3)脫鹽用0.15mol/L NaCL溶液平衡Sephadex G-25柱后，將乙二胺活化的載體蛋白溶液上柱，紫外監(jiān)測(cè)280nm吸收情況，收集第一峰組分。
(4)濃縮將收集液用透析袋濃縮至2mL，將濃縮液轉(zhuǎn)移至一小燒杯。
(5)偶聯(lián)給濃縮液中加入3mmol 3-氯乳酸半抗原，立即加入100uL0.1mol/L，pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)，再加入0.8mg水溶性碳二亞胺鹽酸鹽，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí)。
(6)透析反應(yīng)液用PBS(0.1mol/L，pH7.8)透析48小時(shí)，分裝。
(7)紫外掃描鑒定可見偶聯(lián)物在240-280nm間的吸收曲線為一肩峰吸收帶，明顯不同于陽離子化牛血清白蛋白吸收特征，表明偶聯(lián)成功。
用這種方法制備的人工抗原免疫Balb/c小鼠，經(jīng)過間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA鑒定，表明針對(duì)3-氯-1，2-丙二醇的抗體產(chǎn)生，進(jìn)一步表明人工抗原制備成功。
本方法使用3-氯乳酸作為半抗原，最大程度保留了3-氯-1，2-丙二醇的結(jié)構(gòu)，有利于提高抗體的特異性；采用乙二胺活化載體蛋白，使得載體蛋白表面帶大量正電荷，有利于半抗原3-氯乳酸的羧基與蛋白表面大量帶正電荷的氨基偶聯(lián)；另外，乙二胺可以充當(dāng)手臂，使得半抗原離蛋白較遠(yuǎn)，避免了蛋白對(duì)半抗原的掩蔽效應(yīng)。因此，制備出的3-氯-1，2-丙二醇人工抗原免疫原性較好，可用于制備抗體，用于建立免疫檢測(cè)方法。這對(duì)于保障食品安全，提高食品殘留物分析水平都具有非常重要的意義。
實(shí)施例3-氯-1，2-丙二醇人工抗原制備(1)為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取下列措施配置乙二胺溶液配置10％(v/v)的乙二胺溶液1mL，用6mol/L的鹽酸調(diào)整pH至6.0。
(2)乙二胺活化載體給乙二胺溶液中加入3mL 6.1mg/mL牛血清白蛋白或多肽或合成多肽或半合成多肽水溶液，再加入0.8mg水溶性碳二亞胺鹽酸鹽，室溫反應(yīng)15min。
(3)脫鹽用0.15mol/L NaCL溶液平衡Sephadex G-25柱后，將乙二胺活化的載體蛋白溶液上柱，紫外監(jiān)測(cè)280nm吸收情況，收集第一峰組分。
(4)濃縮將收集液用透析袋濃縮至2mL，將濃縮液轉(zhuǎn)移至一小燒杯。
(5)偶聯(lián)給濃縮液中加入3mmol 3-氯乳酸半抗原，立即加入100uL0.1mol/L，pH7.4的PBS，再加入0.8mg水溶性碳二亞胺鹽酸鹽，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí)。
(6)透析反應(yīng)液用PBS(0.1mol/L，pH 7.8)透析48小時(shí)，分裝。
3-氯-1，2-丙二醇人工抗原紫外光譜鑒定對(duì)透析后的偶聯(lián)產(chǎn)物采用紫外掃描鑒定，可見偶聯(lián)物在240-280nm間的吸收曲線為一強(qiáng)吸收帶，明顯不同于陽離子化牛血清白蛋白吸收特征，表明3-氯乳酸與牛血清白蛋白發(fā)生反應(yīng)，表明偶聯(lián)成功。
3-氯-1，2-丙二醇人工抗原動(dòng)物免疫效果鑒定取健康5周齡雌性二級(jí)Balb/c小鼠2只進(jìn)行免疫。第一次基礎(chǔ)免疫將0.3mL 2mg/mL的3-氯-1，2-丙二醇人工抗原與等量完全弗氏佐劑用攪拌器充分混勻乳化，進(jìn)行腹腔注射，注射量0.2mL/只。3周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，佐劑換為不完全弗氏佐劑，每隔兩周加強(qiáng)免疫一次。第三次加強(qiáng)免疫后，尾靜脈采血，分離血清。以卵清白蛋白與3-氯乳酸的偶聯(lián)物為包被抗原，包被抗原制備方法同于牛血清白蛋白與3-氯乳酸的偶聯(lián)方法，倍比稀釋血清，一行每孔都加入50uL 300mg/mL的3-氯-1，2-丙二醇，另一行每孔都加入50uL空白稀釋液PBST，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA鑒定血清特異性，結(jié)果如下，每個(gè)OD為三次重復(fù)測(cè)定平均值

從以上表格數(shù)據(jù)可以看出，相同反應(yīng)條件下，含有3-氯-1，2-丙二醇的孔的OD明顯低于不含3-氯-1，2-丙二醇的孔的OD，表明3-氯-1，2-丙二醇可以與血清反應(yīng)，即說明抗3-氯-1，2-丙二醇的抗體產(chǎn)生，進(jìn)一步證明3-氯-1，2-丙二醇人工抗原合成成功。
權(quán)利要求
1.3-氯-1，2-丙二醇人工抗原制備方法，采用偶聯(lián)劑將半抗原偶聯(lián)于載體，其特征在于用3-氯乳酸作為半抗原，將3-氯乳酸與陽離子化載體在偶聯(lián)劑作用下偶聯(lián)，制備出3-氯-1，2-丙二醇的人工抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人工抗原制備方法，其特征在于偶聯(lián)所用載體為陽離子化的載體，該陽離子化載體為陽離子化試劑處理過的蛋白質(zhì)或其片段或合成多肽或半合成多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人工抗原制備方法，其特征在于載體陽離子化處理所用試劑為乙二胺。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人工抗原制備方法，其特征在于半抗原與陽離子化載體偶聯(lián)所用偶聯(lián)劑為水溶性碳二亞胺鹽酸鹽。
全文摘要
本發(fā)明涉及3－氯－1，2－丙二醇人工抗原制備方法。利用3－氯乳酸為半抗原，以水溶性碳二亞胺鹽酸鹽為偶聯(lián)劑，將半抗原3－氯乳酸與陽離子化載體偶聯(lián)，制備出3－氯－1，2－丙二醇的人工抗原。該人工抗原可用于制備3－氯－1，2－丙二醇的抗體，也可進(jìn)一步用于建立3－氯－1，2－丙二醇免疫檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)G01N33/544GK1727897SQ20051003524
公開日2006年2月1日 申請(qǐng)日期2005年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月20日
發(fā)明者黃曉鈺, 雷紅濤, 孫遠(yuǎn)明, 吳青, 王弘, 諶國蓮, 高秀杰, 陳家貴, 肖治理 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)