人皰疹病毒hsv-1、hsv-2和hcmv三聯檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種人皰疹病毒HSV-1、HSV-2和HCMV三聯檢測試劑盒，由定量PCR反應液、HSV-1標準品、HSV-2標準品、HCMV標準品、陰性對照品、HSV-1陽性對照品、HSV-2陽性對照品、HCMV陽性對照品、說明書和盒體組成，其中定量PCR反應液含有PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、耐熱DNA聚合酶、上游擴增引物、下游擴增引物、HSV-1熒光探針、HSV-2熒光探針和HCMV熒光探針。本發(fā)明試劑盒采用實時熒光定量PCR技術和三色特異性熒光探針，對樣品中的常見人皰疹病毒HSV-1、HSV-2和HCMV能進行同時分型檢測，對陽性病毒能實時準確定量，節(jié)約生產成本和檢測成本，提高檢測效率，可滿足診斷需求，有助于及時制定針對性治療方案。
【專利說明】人皰疹病毒HSV-1、HSV-2和HCMV三聯檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬生物【技術領域】，涉及熒光定量PCR檢測試劑盒，具體涉及一種三探針實時熒光定量PCR檢測患者血液、尿液、腦脊液等樣本中單純皰疹病毒I型(HSV-1)、單純皰疹病毒2型(HSV-2)和人巨細胞病毒(HCMV)三種常見人皰疹病毒的新型試劑盒，能同時對HSV-U HSV-2和HCMV進行分型和定量檢測。
【背景技術】
[0002]皰疹病毒科是一群中等大小、有包膜的DNA病毒，現已發(fā)現100種以上。已知與人類疾病相關的皰疹病毒包括單純皰疹病毒I型和2型(HSV-1、HSV-2)、水痘一帶狀皰疹病毒(VZV)、愛潑斯坦一馬爾病毒(EBV)、人巨細胞病毒(HCMV)、人皰疹病毒6型、7型和8型(HHV-6、HHV-7、HHV-8)，臨床上最常見的為HSV-1、HSV_2和HCMV感染。當機體免疫功能低下或受抑制時，易引起皰疹病毒感染，導致嚴重致死性疾病，而早期診斷和及時抗病毒治療可明顯改善預后，降低病死率。因皰疹病毒感染的臨床表現多樣，且不同病毒感染的癥狀和體征多無特異性，因此早期診斷和及時治療需依賴實驗室檢測。
[0003]傳統(tǒng)的皰疹病毒檢測方法主要包括病毒分離培養(yǎng)和血清學檢測，前者曾為皰疹病毒的診斷“金標準”，但存在需時長(3-30天)、敏感性低(尤其在抗病毒藥物治療后)、分型困難等缺陷；后者又分為抗原直接檢測法和抗體間接檢測法，抗原直接檢測法由于某些病毒不產生可檢測的抗原而導致敏感性低，抗體間接檢測法由于皰疹病毒感染后需I周左右才產生有效濃度的抗體而無法進行早期診斷，且不同皰疹病毒間存在交叉反應，抗體特異性不聞。
[0004]隨著分子生物學技術的迅速發(fā)展，聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)技術，特別是近幾年興起的實時熒光定量PCR技術為病原微生物的檢測提供了新方向。實時熒光定量PCR技 術的基本原理是利用Taq酶的5’_3’外切酶核酸活性，在普通PCR基礎上設計熒光雙標記探針，兩端分別標記熒光報告基團(R)和淬滅基團(Q);探針保持完整時R基團的熒光信號被Q基團抑制，一旦探針被切斷，Q基團的抑制作用消失，R基團的熒光信號就可被檢測到。該技術通過對熒光信號的檢測實現對PCR過程中產物量的實時監(jiān)測，并可精確計算初始模板量，除具有定量準確、檢測快速等優(yōu)點外，最大的優(yōu)勢是采用完全閉管檢測，省去了對PCR產物的后處理，避免了交叉污染。
[0005]目前的實時熒光定量PCR技術隨著材料和儀器的進一步發(fā)展，通過在熒光探針的5’端標記不同的熒光染料(FAM、HEX、R0X等)及多通道熒光定量PCR儀，可以實現基因分型、基因突變檢測、SNP分析等研究。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種人皰疹病毒HSV-1、HSV_2和HCMV三聯檢測試劑盒，是一種同時檢測常見人皰疹病毒HSV-1、HSV-2和HCMV的三聯實時熒光定量PCR試劑盒，由定量PCR反應液、HSV-1標準品、HSV-2標準品、HCMV標準品、陰性對照品、HSV-1陽性對照品、HSV-2陽性對照品、HCMV陽性對照品、說明書和盒體組成，其中定量PCR反應液含有PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、耐熱DNA聚合酶、上游擴增引物、下游擴增引物、HSV-1熒光探針、HSV-2熒光探針和HCMV熒光探針。
[0007]PCR擴增弓丨物序列為:
【權利要求】
1.一種人皰疹病毒HSV-1、HSV-2和HCMV三聯檢測試劑盒，由定量PCR反應液(I)、HSV-1標準品(2 )、HSV-2標準品(3 )、HCMV標準品(4 )、陰性對照品(5 )、HSV-1陽性對照品(6)、HSV-2陽性對照品(7)、HCMV陽性對照品(8)、說明書(9)和盒體(10)組成； 其中定量PCR反應液含有PCR緩沖液、MgCl2, dNTPs、耐熱DNA聚合酶、上游擴增引物、下游擴增引物、HSV-1熒光探針、HSV-2熒光探針和HCMV熒光探針； 上游擴增引物序列:5’ -TCATCTACGGGGACACGGAC-3’ ； 下游擴增引物序列:5’ -CGCACCAGATCCACGCCCTT-3’ ；
HSV-1 熒光探針:5’ FAM-GCGGCACAGCACAAAGATG-BHQ-1-3’ ；
HSV-2 熒光探針:5’ HEX-GCGGCACAAAACGAAAATG-BHQ-1-3’ ；
HCMV 熒光探針:5’ ROX- GAAAGCGGACAAACACGCT-BHQ-2-3’ ； HSV-1 標準品序列為:TCATCTACGG GGACACGGAC TCCATCTTTG TGCTGTGCCG CGGCCTCACGGCCGCCGGGC TGACGGCCGT GGGCGACAAG ATGGCGAGCC ACATCTCGCG CGCGCTGTTT CTGTCCCCCATCAAACTCGA GTGCGAAAAG ACGTTCACCA AGCTGCTGCT GATCGCCAAG AAAAAGTACA TCGGCGTCATCTACGGGGGT AAGATGCTCA TCAAGGGCGT GGATCTGGTG CG ； HSV-2 標準品序列為:TCATCTACGG GGACACGGAC TCCATTTTCG TTTTGTGCCG CGGCCTCACGGCCGCGGGCC TGGTGGCCAT GGGCGACAAG ATGGCGAGCC ACATCTCGCG CGCGCTGTTC CTCCCCCCGATCAAGCTCGA GTGCGAAAAA ACGTTCACCA AGCTGCTGCT CATCGCCAAG AAAAAGTACA TCGGCGTCATCTGCGGGGGC AAGATGCTCA TCAAGGGCGT GGATCTGGTG CG ； HCMV 標準品序列為:TCATCTACGG GGACACGGAC AGCGTGTTTG TCCGCTTTCG TGGCCTGACGCCGCAGGCTC TGGTGGCGCG TGGGCCCAGC CTGGCGCACT ACGTGACGGC CTGTCTTTTT GTGGAGCCCGTCAAGCTGGA GTTTGAAAAG GTCTTCGTCT CTCTTATGAT GATCTGCAAG AAACGTTACA TCGGCAAAGTGGAGGGCGCC TCGGGTCTGA GCATGAAGGG CGTGGATCTG GTGCG。
2.根據權利要求1所述的一種人皰疹病毒HSV-1、HSV-2和HCMV三聯檢測試劑盒，其特征在于，陰性對照為無菌注射用水樣品，HSV-1陽性對照、HSV-2陽性對照、HCMV陽性對照分別為HSV-1、HSV-2、HCMV滅活病毒株樣品。
3.根據權利要求1所述的一種人皰疹病毒HSV-1、HSV-2和HCMV三聯檢測試劑盒，其特征在于，本發(fā)明試劑盒保存于-20°C，減少反復凍融。
【文檔編號】C12Q1/68GK103773898SQ201410026783
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月21日 優(yōu)先權日:2014年1月21日
【發(fā)明者】陶然, 尚世強, 杜立中, 舒強, 李偉 申請人:浙江大學