專利名稱：：水痘減毒活疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及皰疹病毒科的醫(yī)用微生物，具體為一種水痘減毒活疫苗。技術(shù)背景水痘是由水痘-帶狀皰疹病毒(vzv)引起的髙度接觸傳播的常見呼吸道傳染病，水痘病毒是一種人a-皰疹病毒，能導(dǎo)致兩種人類疾病:.初次感染好發(fā)年齡為10歲以下兒童，導(dǎo)致兒童水痘，此后病毒變?yōu)闈摲⒊３Ｖ丶せ?通常幾十年后)產(chǎn)生帶狀皰疹。原發(fā)感染可致患者不同程度的典型疾病，尤其對(duì)免疫功能低下及接觸免疫抑制劑治療者，后果更為嚴(yán)重?；妓粫r(shí)，病毒透入外周神經(jīng)系統(tǒng)并潛伏直至以痛苦的帶狀皰疹形式重激活。由于病毒是潛伏的，大部分病毒基因的表達(dá)被抑制。VZV感染具有存在最小量的自由病毒的特征，在潛伏狀態(tài)和重激活時(shí)，病毒主要在細(xì)胞內(nèi)。相應(yīng)的，甚至使用高濃度中和抗體和依賴于細(xì)胞介導(dǎo)免疫的病毒控制也不能預(yù)防復(fù)發(fā)疾病。目前對(duì)水痘的治療并無(wú)專用有效藥物及治療方法，常規(guī)以預(yù)防為主，通過(guò)接診水痘疫苗的方法預(yù)防感染水痘-帶狀皰疹病毒(VZV),因此用安全有效的水痘疫苗對(duì)高危人群進(jìn)行免疫已日益受到人們的重視。在國(guó)內(nèi)由于國(guó)家對(duì)預(yù)防的日益重視，水痘疫苗市場(chǎng)的增長(zhǎng)速度呈快速增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)。雖然目前中國(guó)水痘疫苗市場(chǎng)還處于萌芽狀態(tài)，但市場(chǎng)潛力巨大。我國(guó)每年出生嬰兒超過(guò)1500萬(wàn)，存在著巨大的兒童免疫接種市場(chǎng)；同時(shí)隨著人民生活水平的進(jìn)一步提高，由消費(fèi)者自己負(fù)擔(dān)的成人有價(jià)免疫市場(chǎng)也將會(huì)有大幅度的提高。依據(jù)有關(guān)資料顯示，國(guó)內(nèi)水痘疫苗市場(chǎng)增長(zhǎng)率將達(dá)到15%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于全球10%的增長(zhǎng)率。我國(guó)擁有將近13億的人口，根據(jù)全國(guó)人口和經(jīng)濟(jì)實(shí)力，可以將市場(chǎng)定位于城f^人口，按中小學(xué)生和兒童以及老年人的數(shù)量計(jì)算，應(yīng)在l億以t，按其中的20%的人進(jìn)行預(yù)防接種，全國(guó)的潛在市場(chǎng)應(yīng)為2000萬(wàn)人份左右，同時(shí)隨著人民生活水平的提高和市場(chǎng)宣傳的深化，最新疫苗技術(shù)的創(chuàng)新及人們對(duì)免疫和病原體抵抗力認(rèn)識(shí)的進(jìn)展，市場(chǎng)將逐步擴(kuò)大。要獲得安全有效的水痘疫苗，需解決的主要關(guān)鍵技術(shù)及試驗(yàn)內(nèi)容有1.病毒培養(yǎng)包括細(xì)胞培養(yǎng)的條件，病毒的接種量，病毒的培養(yǎng)條件和收獲條件以及細(xì)胞培養(yǎng)液和病毒培養(yǎng)液的成分等。2.病毒純化包括病毒超聲的時(shí)間、頻率等。3.凍干方法比較在不同的凍干工藝下生成的疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量。4.疫苗穩(wěn)定劑的配方比較不同配方的疫苗穩(wěn)定劑對(duì)疫苗的質(zhì)量及其穩(wěn)定性情況的影響。
發(fā)明內(nèi)容為了克服現(xiàn)有預(yù)防水痘手段的不足，提供一種安全有效的預(yù)防水痘的手段，本發(fā)明公開了一種水痘減毒活疫苗。本發(fā)明通過(guò)如下技術(shù)手段達(dá)到發(fā)明目的一種水痘減毒活疫苗，按如下方法制備而成(1)將MRC-5細(xì)胞在細(xì)胞瓶中連續(xù)傳代不超過(guò)33代；(2)至細(xì)胞生長(zhǎng)至一定規(guī)模后，將毒種接種至細(xì)胞中，進(jìn)行兩次連續(xù)感染，M.O.I分別為0.0010.002和0.010.03;(3)加入含23。/。胎牛血清的MEM培養(yǎng)液，置于3537X:培養(yǎng)；(4)當(dāng)MRC-5細(xì)胞病變程度達(dá)到++~+++時(shí)，倒去培養(yǎng)液，以PBS洗液洗滌細(xì)胞表面，洗去牛血清；(5)加入0.05n/。的EDTA溶液洗脫感染細(xì)胞，將細(xì)胞懸液收集于離心管中，在48r下以1800ipm離心5分鐘，棄上清，加入含有穩(wěn)定劑的疫苗液，混勻，收集，吸樣做單瓶無(wú)菌檢測(cè)，-sox:凍存；(6)將單瓶無(wú)菌檢測(cè)合格者，移入超聲瓶中進(jìn)行超聲破碎，超聲波頻率30KHz，0.10.2秒/ml，以lOOOrpm離心10分鐘，收集上清，即為病毒原液；(7)將病毒原液合并、稀釋成半成品，吸樣進(jìn)行無(wú)菌檢測(cè)，并立即進(jìn)行分裝、凍干，即得到水痘減毒活疫苗。所述的水痘減毒活疫苗，制備方法第(5)〗j(luò);中所加入的穩(wěn)定劑配方如下序號(hào)組分重量份數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>將以上各組分均溶于重量份數(shù)為IOOO的去離子水中，即得穩(wěn)定劑。本發(fā)明選用唯一被WHO推薦用于生產(chǎn)水痘活疫苗的減毒株Oka水痘減毒株和MRC-5細(xì)胞，Oka水痘減毒株是1974年由日本大阪大學(xué)微生物病研究會(huì)(BKEN)髙橋理明博士研究成功的，經(jīng)過(guò)15年的臨床試驗(yàn)，證明該病毒株具有很好的有效性和安全性，是最為理想的活疫苗株。采用自行研制的不含明膠的穩(wěn)定劑，生產(chǎn)出具有較髙病毒滴度和良好安全性的水痘疫苗，有效解決了部分注射人群的過(guò)敏性問(wèn)題。以前的水痘疫苗穩(wěn)定劑配方中多含有明膠，由于明膠是一種潛在的過(guò)敏原，大多數(shù)對(duì)水痘疫苗的接種過(guò)敏反應(yīng)是由疫苗中作為穩(wěn)定劑的明膠所致。在曾經(jīng)統(tǒng)計(jì)過(guò)的30例水痘疫苗過(guò)敏反應(yīng)的兒童中，7例反應(yīng)嚴(yán)重，7例輕微，14例全身皮膚反應(yīng)，30人中有27人具有抗明膠IgE抗體。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，嚴(yán)重過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生率為每100萬(wàn)劑10.3例。因此，開發(fā)不含明膠的水痘疫苗穩(wěn)定劑，可以避免部分注射人群的過(guò)敏性問(wèn)題，己經(jīng)成為水痘疫苗的一個(gè)發(fā)展方向。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)2年的穩(wěn)定性研究表明，利用本發(fā)明的穩(wěn)定劑生產(chǎn)的水痘減毒活疫苗具有良好的穩(wěn)定性，在28C放置2年以上仍然具有較髙的病毒滴度。在生產(chǎn)水痘疫苗的過(guò)程中，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，最終選用的毒株為世界公認(rèn)的Oka水痘減毒株，細(xì)胞基質(zhì)為由國(guó)家藥品管理當(dāng)局認(rèn)可的MRC-5細(xì)胞，從而保證了生產(chǎn)出來(lái)的水痘疫苗具有良好的安全性和免疫原性。以本發(fā)明為試驗(yàn)疫苗，并選用上海生物制品研究所生產(chǎn)的水痘疫苗為對(duì)照疫苗，開始水痘減毒活疫苗的臨床試驗(yàn)研究。研究釆用隨機(jī)、盲法試驗(yàn)。研究對(duì)象為112歲人群，分為兩個(gè)年齡段入組，1~5歲和6~12歲各300人，以隨機(jī)方式接種1針試驗(yàn)疫苗或1針對(duì)照疫苗，采集免前和免后4-6周血樣評(píng)估免疫原性效果，以主動(dòng)隨訪和受試者自動(dòng)報(bào)告方式進(jìn)行安全性觀察。1.安全性觀察通過(guò)對(duì)400名接種試驗(yàn)疫苗和200名接種對(duì)照疫苗的受試者進(jìn)行注射后至10天內(nèi)精細(xì)觀察以及30天內(nèi)不良事件收集試驗(yàn)組和對(duì)照組總反應(yīng)率為31.75%和35.0%，中度以上反應(yīng)率8.5%和10.5%;試驗(yàn)組和對(duì)照組局部反應(yīng)率為2.25%和1.50%;試驗(yàn)組全身反應(yīng)率29.5%,中度以上反應(yīng)率8.5%;對(duì)照組全身反應(yīng)率33.5%，中度以上反應(yīng)率10.0%。兩組間總反應(yīng)率、局部和全身反應(yīng)率比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.免疫原性效果受試者免疫后經(jīng)血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明試驗(yàn)組和對(duì)照組受試者免疫后抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率分別為100.0%和98.74°/0，4倍增長(zhǎng)率為89.66%和卯.91%，陽(yáng)性率為訴.30%和97.79%。試驗(yàn)組和對(duì)照組抗體陽(yáng)性率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=0.1659，P=0.6832)。試驗(yàn)組免后抗體GMT為57.90，較免疫前平均增長(zhǎng)約21倍；對(duì)照組免后抗體GMT為46.79，較免疫前平均增長(zhǎng)約18倍。試驗(yàn)組與對(duì)照組的抗體GMT比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.5329,P=0.0004)，但免疫前后抗體增長(zhǎng)倍數(shù)無(wú)差異(t=1.3892，P=0.0827)。具體實(shí)施方式以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例l一種水痘減毒活疫苗，按如下方法制備而成(1)將MRC-5細(xì)胞在細(xì)胞瓶中連續(xù)傳代20代；(2)至細(xì)胞生長(zhǎng)至一定規(guī)模后，將毒種接種至細(xì)胞中，進(jìn)行兩次連續(xù)感染，M.O.I分別為0.001和0.01,以擴(kuò)大病鳥液的收獲量；(3)加入含2%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液，置于35X:培養(yǎng)；(4)3皿05細(xì)胞病變朽:度達(dá)到+++++時(shí)，倒去培養(yǎng)液，以PBS洗液洗滌細(xì)胞表面，洗去牛血清；(5)加入0.05。/。的EDTA溶液洗脫感染細(xì)胞，將細(xì)胞懸液收集于離心管中，在4r下以1800rpm離心5分鐘，棄上清，加入含有穩(wěn)定劑的疫苗液，混勻，收集，吸樣做單瓶無(wú)菌檢測(cè)，-sox:凍存；其中，穩(wěn)定劑配方如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>將以上各組分均溶于重量份數(shù)為1000的去離子水中，即得穩(wěn)定劑。(6)將單瓶無(wú)菌檢測(cè)合格者，移入超聲瓶中進(jìn)行超聲破碎，超聲波頻率30KHz,0.1秒/ml，以1000rpm離心10分鐘，收集上清，即為病毒原液；(7)將病毒原液合并、稀釋成半成品，吸樣進(jìn)行無(wú)菌檢測(cè)，并立即進(jìn)行分裝、凍干，即得到水痘減毒活疫苗。實(shí)施例2一種水痘減毒活疫苗，按如下方法制備而成(1)將MRC-5細(xì)胞在細(xì)胞瓶中連續(xù)傳代不超過(guò)25代；(2)至細(xì)胞生長(zhǎng)至一定規(guī)模后，將毒種接種至細(xì)胞中，進(jìn)行兩次連續(xù)感染，M.O.I分別為0.0015和0.02，以擴(kuò)大病毒液的收獲量；(3)加入含2.5。/。胎牛血清的MEM培養(yǎng)液，置于36"C培養(yǎng)；(4)當(dāng)MRC-5細(xì)胞病變程度達(dá)到+++++時(shí)，倒去培養(yǎng)液，以PBS洗液洗滌細(xì)胞表面，洗去牛血清(5)加入0.05。/。的EDTA溶液洗脫感染細(xì)胞，將細(xì)胞懸液收集于離心管中，在6'C下以1800rpm離心5分鐘，棄上清，加入含有穩(wěn)定劑的疫苗液，混3,收集，吸樣做單瓶無(wú)菌檢測(cè)，-sox:凍存;其中，穩(wěn)定劑配方如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>將以上各組分均溶于重量份數(shù)為iooo的去離子水中，即得穩(wěn)定劑。(6)將單瓶無(wú)菌檢測(cè)合格者，移入超聲瓶中進(jìn)行超聲破碎，超聲波頻率30KHz，0.1秒/ml，以lOOOrpm離心10分鐘，收集上清，即為病毒原液；(7)將病毒原液合并、稀釋成半成品，吸樣進(jìn)行無(wú)菌檢測(cè)，并立即進(jìn)行分裝、凍干，即得到水痘減毒活疫苗。實(shí)施例1一種水痘減毒活疫苗，按如下方法制備而成(1)將MRC-5細(xì)胞在細(xì)胞瓶中連續(xù)傳代不超過(guò)33代；(2)至細(xì)胞生長(zhǎng)至一定規(guī)模后，將毒種接種至細(xì)胞中，進(jìn)行兩次連續(xù)感染，M.O.I分別為0.002和0.03，以擴(kuò)大病毒液的收獲量；(3)加入含3。/。胎牛血清的MEM培養(yǎng)液，置于37X:培養(yǎng)；(4)當(dāng)MRC-5細(xì)胞病變程度達(dá)到++~+++時(shí)，倒去培養(yǎng)液，以PBS洗液洗滌細(xì)胞表面，洗去牛血清；(5)加入0.05。/。的EDTA溶液洗脫感染細(xì)胞，將細(xì)胞懸液收集于離心管中，在8'C下以1800rpm離心5分鐘，棄上清，加入含有穩(wěn)定劑的疫瞎液，混勻，收集，吸樣做單瓶無(wú)菌檢測(cè)，-SO'C凍存；其中，穩(wěn)定劑配方如下序號(hào)組分重量份數(shù)1NaCl32KC10,13KH2P040.24Na2HP0412H203.3蔗糖506谷氨酸鈉0.47卡那霉素(100單位/ml)0.18紅霉素(30單位/ml)0.03將以上各組分均溶于重量份數(shù)為IOOO的去離子水中，即得穩(wěn)定劑。(6)將單瓶無(wú)菌檢測(cè)合格者，移入超聲瓶中進(jìn)行超聲破碎，超聲波頻率30KHz，0.2秒/ml，以lOOOrpm離心10分鐘，收集上清，即為病毒原液；(7)將病毒原液合并、稀釋成半成品，吸樣進(jìn)行無(wú)菌檢測(cè)，并立即進(jìn)行分裝、凍干，即得到水痘減毒活疫苗。權(quán)利要求1.一種水痘減毒活疫苗，按如下方法制備而成(1)將MRC-5細(xì)胞在細(xì)胞瓶中連續(xù)傳代不超過(guò)33代；(2)至細(xì)胞生長(zhǎng)至一定規(guī)模后，將毒種接種至細(xì)胞中，進(jìn)行兩次連續(xù)感染，M.O.I分別為0.001～0.002和0.01～0.03；(3)加入含2～3％胎牛血清的MEM培養(yǎng)液，置于35～37℃培養(yǎng)；(4)當(dāng)MRC-5細(xì)胞病變程度達(dá)到++～+++時(shí)，倒去培養(yǎng)液，以PBS洗液洗滌細(xì)胞表面，洗去牛血清；(5)加入0.05％的EDTA溶液洗脫感染細(xì)胞，將細(xì)胞懸液收集于離心管中，在4～8℃下以1800rpm離心5分鐘，棄上清，加入含有穩(wěn)定劑的疫苗液，混勻，收集，吸樣做單瓶無(wú)菌檢測(cè)，-80℃凍存；(6)將單瓶無(wú)菌檢測(cè)合格者，移入超聲瓶中進(jìn)行超聲破碎，超聲波頻率30KHz，0.1～0.2秒/ml，以1000rpm離心10分鐘，收集上清，即為病毒原液；(7)將病毒原液合并、稀釋成半成品，吸樣進(jìn)行無(wú)菌檢測(cè)，并立即進(jìn)行分裝、凍干，即得到水痘減毒活疫苗。2.如權(quán)利要求1所述的水痘減毒活疫苗，其特征在于制備方法第(5)步中所加入的穩(wěn)定劑配方如下<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>將以上各組分均溶于重量份數(shù)為IOOO的去離子水中，即得穩(wěn)定劑。全文摘要本發(fā)明涉及皰疹病毒科的醫(yī)用微生物，具體為一種水痘減毒活疫苗。本發(fā)明通過(guò)如下方法制備而成(1)將MRC-5細(xì)胞連續(xù)傳代；(2)接種至細(xì)胞并連續(xù)感染；(3)加入培養(yǎng)液；(4)洗滌細(xì)胞表面；(5)洗脫感染細(xì)胞，離心分離，加入含穩(wěn)定劑的疫苗液凍存；(6)超聲破碎并離心分離得病毒原液；(7)合并稀釋，并立即進(jìn)行分裝、凍干，即得到水痘減毒活疫苗。穩(wěn)定劑是將NaCl、KCl、KH₂PO₄、Na₂HPO₄·12H₂O、蔗糖、谷氨酸鈉、卡那霉素、紅霉素和去離子水以重量比3∶0.1∶0.2∶3.3∶50∶0.4∶0.1∶0.03∶1000溶于水制得。本發(fā)明具有良好的安全性和免疫原性的優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)A61K39/275GK101161286SQ20071004565公開日2008年4月16日申請(qǐng)日期2007年9月6日優(yōu)先權(quán)日2007年9月6日發(fā)明者朱紹榮申請(qǐng)人:上海榮盛生物技術(shù)有限公司