專利名稱：：流感病毒裂解疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及正黏液病毒科的醫(yī)用微生物，具體為一種流感病毒裂解疫苗。技術(shù)背景流感是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，具有傳染性強(qiáng)、傳播快、潛伏期短、發(fā)病率高的特點(diǎn)，嚴(yán)重者可致人死亡。對(duì)于流感尚無有效的治療藥物，接種流感疫苗是當(dāng)今預(yù)防流感疾病發(fā)生、流行的最為有效的手段。'美國幾乎每年冬季發(fā)生流感流行，其中以兒童發(fā)病率最高，而65歲以上的老人和身體狀況不佳者患流感并發(fā)癥的發(fā)病率和死亡率最高。據(jù)估計(jì)，美國每年感染流感的居民約有1020%，平均每年會(huì)有114000人由于流感相關(guān)的并發(fā)癥而住院，有36000美國人死于流感。我國也是流感的多發(fā)地區(qū)。我國人口眾多，東南沿海地區(qū)人口密度大，北方氣候偏冷干燥，易于暴發(fā)流感，尤其近幾年來，全國范圍內(nèi)都有流感流行的報(bào)道，甚至造成醫(yī)院人滿為患，影響正常的工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和學(xué)生上課。此外，2003年SARS的暴發(fā)，2004年禽流感的流行，使得有效的預(yù)防流感的發(fā)生顯得更為重要。流感疫苗應(yīng)用30多年的過程充分證明了接種流感疫苗對(duì)保護(hù)人類的健康起了很大作用，研究表明，現(xiàn)行疫苗約可預(yù)防70%90%的65歲以下健康人，3040%的老年人發(fā)病，80%有效預(yù)防由于流感而導(dǎo)致的死亡。因此，開發(fā)并生產(chǎn)流感疫苗具有廣闊的市場(chǎng)前景和臨床價(jià)值。目前，國際上使用的流感疫苗有滅活疫苗和減毒活疫苗兩類。減毒活疫苗中含有的病毒成份具有復(fù)制能力，通過鼻腔噴霧接種，但只允許在549歲健康成人中接種；滅活疫苗接種范圍更廣，可以接種6月以上的健康人群及慢性病患者;目前中國尚未引進(jìn)減毒活疫苗。國際t所使用的流感滅活疫苗有三種類型全病毒滅活疫苗、裂解疫苗和亞單位疫苗。全病毒的制備簡單，但是容易引起不良反應(yīng)；裂解疫苗已去除主要引起副反應(yīng)的病毒類脂層，大大提高了安全性，免疫效果接近全病毒疫苗；亞單位疫苗只含病毒的表面抗原，抗體應(yīng)答效果差，同時(shí)造價(jià)極高。制備流感疫苗的難點(diǎn)在于1.病毒培養(yǎng)包括病毒的接種量，病毒的培養(yǎng)溫度和病毒的培養(yǎng)時(shí)間等。2.病毒純化包括目的病毒的回收及雜質(zhì)的去除效果等。3.裂解方法比較在不同的裂解劑的安全性、裂解效果及易去除效果等。
發(fā)明內(nèi)容為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種安全可靠副作用小的預(yù)防流感的手段，本發(fā)明公開了一種流感病毒裂解疫苗。本發(fā)明通過如下的技術(shù)方案達(dá)到發(fā)明目的采用甲型和乙型流感病毒分別無菌操作接種于雞胚尿囊腔，置33—35'C溫度培育50~70小時(shí)；選擇活胚經(jīng)2—8'C冷卻過夜后，收獲尿囊液，加入終濃度為0.02%的甲醛溶液進(jìn)行病毒滅活，超濾濃縮10倍以上，超速離心純化，按照病毒峰收集純化的病毒懸液；加入等量的乙醚裂解病毒，裂解后去除乙醚，除菌過濾，制得單價(jià)病毒原液；根據(jù)各亞型病毒原液的血凝素含量，按每型30pg/ml的比例混合稀釋，加入硫柳汞至終濃度為60—lOOpg/ml制成疫苗半成品；再依法進(jìn)行分包裝即得流感病毒裂解疫苗。本發(fā)明采用世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦并經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的甲型和乙型流感病毒，采用新工藝及技術(shù)生產(chǎn)出病毒滴毒和安全性高的流感病毒裂解疫苗，有如下優(yōu)點(diǎn)1.培養(yǎng)的病毒滴度很高，12雞胚就能生產(chǎn)出l人份疫苗；2.選擇合適的超濾方法，濃縮效率及回收率很高，同時(shí)去雜質(zhì)的效果很好；3.病毒的純化工藝先進(jìn)，純化效果好，雜蛋白含量低，內(nèi)毒素很低，極大保證疫苗的安全性；4.采用先滅活后超濾的方法，最人可能保護(hù)操作人員安全，符合GMP要求。本發(fā)明連續(xù)試制了3批中試產(chǎn)品，經(jīng)全方位質(zhì)量評(píng)價(jià)包括疫苗成分及純度、裂解效果、雜蛋白含量、有害物質(zhì)等的去除、異常毒性檢查、動(dòng)物過敏性試驗(yàn)、疫苗的有效性及穩(wěn)定性等研究，表明研制的產(chǎn)品安全、有效、穩(wěn)定。與國際知名制造商巴斯德公司的流感病毒裂解疫苗產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)比較(見表1)，本發(fā)明性能上與其相當(dāng)，有部分技術(shù)指標(biāo)甚至高于巴斯德疫苗表1本發(fā)明與巴斯德公司的流感病毒裂解疫苗產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)比較<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>具體實(shí)施方式以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明:實(shí)施例1(1)采用甲型和乙型流感病毒分別無菌操作接種于雞胚尿囊腔，置33'C溫度培育50小時(shí)；(2)選擇活胚經(jīng)2'C冷卻過夜后，收獲尿囊液，加入終濃度為0.02%的甲醛溶液進(jìn)行病毒滅活，超濾濃縮10倍，超速離心純化，按照病毒峰收集純化的病毒懸液；(3)加入等量的乙醚裂解病毒，裂解后去除乙醚，除菌過濾，制得單價(jià)病毒原液；(4)根據(jù)各亞型病毒原液的血凝素含量，按每型30嗎/ml的比例混合稀釋，加入硫柳汞至終濃度為60pg/ml制成疫苗半成品；(5)再依法進(jìn)行分包裝即得流感病毒裂解疫苗。實(shí)施例2(1)采用甲型和乙型流感病毒分別無菌操作接種于雞胚尿囊腔，置34。C溫度培育60小時(shí)；(2)選擇活胚經(jīng)5。C冷卻過夜后，收獲尿囊液，加入終濃度為0.02%的甲醛溶液進(jìn)行病毒滅活，超濾濃縮12倍，超速離心純化，按照病毒峰收集純化的病毒懸液；(3)加入等量的乙醚裂解病毒，裂解后去除乙醚，除菌過濾，制得單價(jià)病毒原液；(4)根據(jù)各亞型病毒原液的血凝素含量，按每型30pg/ml的比例混合稀釋，加入硫柳汞至終濃度為80pg/ml制成疫苗半成品；(5)再依法進(jìn)行分包裝即得流感病毒裂解疫苗。實(shí)施例3(1)采用甲型和乙型流感病毒分別無菌操作接種于雞胚尿囊腔，置35t:溫度培育70小時(shí)；(2)選擇活胚經(jīng)8X:冷卻過夜后，收獲尿囊液，加入終濃度為0.02%的甲醛溶液進(jìn)行病毒滅活，超濾濃縮15倍，超速離心純化，按照病毒峰收集純化的病毒懸液；(3)加入等量的乙醚裂解病毒，裂解后去除乙醚，除菌過濾，制得單價(jià)病毒原液；(4)根據(jù)各亞型病毒原液的血凝素含量，按每型30pg/ml的比例混合稀釋，加入硫柳汞至終濃度為10(^g/ml制成疫苗半成品；(5)再依法進(jìn)行分包裝即得流感病毒裂解疫苗。權(quán)利要求1.一種流感病毒裂解疫苗，通過如下方法制備而成(1)采用甲型和乙型流感病毒分別無菌操作接種于雞胚尿囊腔，置33-35℃溫度培育50-70小時(shí)；(2)選擇活胚經(jīng)2-8℃冷卻過夜后，收獲尿囊液，加入終濃度為0.02％的甲醛溶液進(jìn)行病毒滅活，超濾濃縮10倍以上，超速離心純化，按照病毒峰收集純化的病毒懸液；(3)加入等量的乙醚裂解病毒，裂解后去除乙醚，除菌過濾，制得單價(jià)病毒原液；(4)根據(jù)各亞型病毒原液的血凝素含量，按每型30μg/ml的比例混合稀釋，加入硫柳汞至終濃度為60-100μg/ml制成疫苗半成品；(5)再依法進(jìn)行分包裝即得流感病毒裂解疫苗。全文摘要一種流感病毒裂解疫苗，涉及正黏液病毒科的醫(yī)用微生物。本發(fā)明通過如下方法制備而成(1)采用甲型和乙型流感病毒分別培育；(2)選擇活胚冷卻收獲尿囊液，病毒滅活后超濾濃縮并超速離心純化，收集純化的病毒懸液；(3)裂解病毒，裂解后除菌過濾，制得單價(jià)病毒原液；(4)稀釋并制成疫苗半成品；(5)分包裝即得流感病毒裂解疫苗。本發(fā)明具有病毒滴度很高、濃縮效率及回收率很高、純化效果好、操作安全、副作用小的優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)A61K39/145GK101161285SQ20071004565公開日2008年4月16日申請(qǐng)日期2007年9月6日優(yōu)先權(quán)日2007年9月6日發(fā)明者朱紹榮申請(qǐng)人:上海榮盛生物技術(shù)有限公司