四種常見人皰疹病毒熒光定量pcr檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種同時檢測常見人皰疹病毒HSV-1、HSV-2、EBV和HCMV的實時熒光定量PCR試劑盒，由定量PCR反應液、定量反應液、HSV-1標準品、HSV-2標準品、EBV標準品、HCMV標準品、陰性對照品、HSV-1陽性對照品、HSV-2陽性對照品、EBV陽性對照品、HCMV陽性對照品、說明書和盒體組成。本發(fā)明試劑盒采用實時熒光定量PCR技術和同一反應體系中雙特異熒光探針，檢測范圍涵蓋最常見的四種人皰疹病毒，對樣品中的四種人皰疹病毒能進行同時分型檢測，能實時準確定量，可滿足早期、快速、準確診斷的需要，為流行病學調(diào)查和及時制定針對性治療方案提供有力依據(jù)。
【專利說明】四種常見人皰疹病毒熒光定量PCR檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬生物【技術領域】，涉及熒光定量PCR檢測試劑盒，具體涉及一種實時熒光定量PCR檢測患者血液、尿液、腦脊液等樣本中單純皰疹病毒I型(HSV-1)、單純皰疹病毒2型(HSV-2)、愛潑斯坦-馬爾病毒(EBV)和人巨細胞病毒(HCMV)四種常見人皰疹病毒的新型試劑盒。
【背景技術】
[0002]皰疹病毒科是一群中等大小、有包膜的DNA病毒，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)100種以上。已知與人類疾病相關的皰疹病毒包括單純皰疹病毒I型和2型(HSV-1、HSV-2)、水痘一帶狀皰疹病毒(VZV)、愛潑斯坦一馬爾病毒(EBV)、人巨細胞病毒(HCMV)、人皰疹病毒6型、7型和8型(HHV-6、HHV-7、HHV-8)，臨床上最常見的為前四種病毒。當機體免疫功能低下或受抑制時，易引起皰疹病毒感染，導致嚴重致死性疾病，而早期診斷和及時抗病毒治療可明顯改善預后，降低病死率。因皰疹病毒感染的臨床表現(xiàn)多樣，且不同病毒感染的癥狀和體征多無特異性，因此早期診斷和及時治療需依賴實驗室檢測。
[0003]傳統(tǒng)的皰疹病毒檢測方法主要包括病毒分離培養(yǎng)和血清學檢測，前者曾為皰疹病毒的診斷“金標準”，但存在需時長(3-30天)、敏感性低(尤其在抗病毒藥物治療后)、分型困難等缺陷；后者又分為抗原直接檢測法和抗體間接檢測法，抗原直接檢測法由于某些病毒不產(chǎn)生可檢測的抗原而導致敏感性低，抗體間接檢測法由于皰疹病毒感染后需I周左右才產(chǎn)生有效濃度的抗體而無法進行早期診斷，且不同皰疹病毒間存在交叉反應，抗體特異性不聞。
[0004]隨著分子生物學技術的迅速發(fā)展，聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)技術，特別是近幾年興起的實時熒光定量PCR技術為病原微生物的檢測提供了新方向。實時熒光定量PCR技術的基本原理是利用Taq酶的5’_3’外切酶核酸活性，在普通PCR基礎上設計熒光雙標記探針，兩端分別標記熒光報告基團(R)和淬滅基團(Q);探針保持完整時R基團的熒光信號被Q基團抑制，一旦探針被切斷，Q基團的抑制作用消失，R基團的熒光信號就可被檢測到。該技術通過對熒光信號的檢測實現(xiàn)對PCR過程中產(chǎn)物量的實時監(jiān)測，并可精確計算初始模板量，除具有定量準確、檢測快速等優(yōu)點外，最大的優(yōu)勢是采用完全閉管檢測，省去了對PCR產(chǎn)物的后處理，避免了交叉污染。
[0005]目前的實時熒光定量PCR技術隨著材料和儀器的進一步發(fā)展，通過在熒光探針的5’端標記不同的熒光染料(FAM、HEX、R0X等)及多通道熒光定量PCR儀，可以實現(xiàn)基因分型、基因突變檢測、SNP分析等研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供一種同時檢測常見人皰疹病毒HSV-1、HSV-2、EBV和HCMV的實時熒光定量PCR試劑盒，由定量PCR反應液、定量反應液、HSV-1標準品、HSV-2標準品、EBV標準品、HCMV標準品、陰性對照品、HSV-1陽性對照品、HSV-2陽性對照品、EBV陽性對照品、HCMV陽性對照品、說明書和盒體組成，
其中定量PCR反應液含有PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、耐熱DNA聚合酶、通用上游擴增引物、通用下游擴增引物、HSV-1熒光探針和HSV-2熒光探針。
[0007]定量反應液含有PCR緩沖液、MgCl2, dNTPs、耐熱DNA聚合酶、通用上游擴增引物、通用下游擴增引物、EBV下游擴增引物、EBV熒光探針和HCMV熒光探針。
[0008]PCR擴增弓丨物序列為:
通用上游擴增引物:5’ -TCATCTACGGGGACACGGAC-3’ ；
通用下游擴增引物:5’ -CGCACCAGATCCACGCCCTT-3’ ；
EBV 下游擴增引物:5，-GAGCTCCACCCCCTTCATC-3’。
[0009]檢測各皰疹病毒的熒光探針和熒光標記物為:
HSV-1 熒光探針:5’ FAM-GCGGCACAGCACAAAGATG-BHQ-1-3’ ；
HSV-2 熒光探針:5’ HEX-GCGGCACAAAACGAAAATG-BHQ-1-3’ ；
EBV 熒光探針:5’ FAM- GCACTCGATAAACAGCGAG-BHQ-1-3’ ；
HCMV 熒光探針:5’ HEX- GAAAGCGGACAAACACGCT-BHQ-1-3’。
[0010]HSV-1 標準品序列為:TCATCTACGG GGACACGGAC TCCATCTTTG TGCTGTGCCGCGGCCTCACG GCCGCCGGGC TGACGGCCGT GGGCGACAAG ATGGCGAGCC ACATCTCGCG CGCGCTGTTTCTGTCCCCCA TCAAACTCGA GTGCGAAAAG ACGTTCACCA AGCTGCTGCT GATCGCCAAG AAAAAGTACATCGGCGTCAT CTACGGGGGT AAGATGCTCA TCAAGGGCGT GGATCTGGTG CG。
[0011]HSV-2 標準品序列為:TCATCTACGG GGACACGGAC TCCATTTTCG TTTTGTGCCGCGGCCTCACG GCCGCGGGCC TGGTGGCCAT GGGCGACAAG ATGGCGAGCC ACATCTCGCG CGCGCTGTTCCTCCCCCCGA TCAAGCTCGA GTGCGAAAAA ACGTTCACCA AGCTGCTGCT CATCGCCAAG AAAAAGTACATCGGCGTCAT CTGCGGGGGC AAGATGCTCA TCAAGGGCGT GGATCTGGTG CG。
[0012]EBV 標準品序列為:TCATCTACGG GGACACGGAC TCGCTGTTTA TCGAGTGCCGGGGGTTTTCA GAGAGCGAGA CCCTGCGCTT TGCCGAGGCC CTGGCCGCCC ACACCACCCG GAGCCTGTTTGTGGCCCCCA TCTCCCTGGA GGCCGAGAAG ACCTTCTCCT GCCTGATGCT GATTACAAAG AAGAGATATGTGGGGGTGCT GACGGACGGC AAGACCCTGA TGAAGGGGGT GGAGCTC。
[0013]HCMV 標準品序列為:TCATCTACGG GGACACGGAC AGCGTGTTTG TCCGCTTTCGTGGCCTGACG CCGCAGGCTC TGGTGGCGCG TGGGCCCAGC CTGGCGCACT ACGTGACGGC CTGTCTTTTTGTGGAGCCCG TCAAGCTGGA GTTTGAAAAG GTCTTCGTCT CTCTTATGAT GATCTGCAAG AAACGTTACATCGGCAAAGT GGAGGGCGCC TCGGGTCTGA GCATGAAGGG CGTGGATCTG GTGCG。
[0014]陰性對照為無菌注射用水樣品，HSV-1陽性對照1、HSV-2陽性對照2、EBV陽性對照3、HCMV陽性對照4分別為HSV-1、HSV-2、EBV、HCMV滅活病毒株樣品。
[0015]本發(fā)明試劑盒應保存于_20°C，盡量減少反復凍融。
[0016]本發(fā)明試劑盒使用方法:
每次檢測均應設立陽性對照和陰性對照，標準品用無菌去離子水稀釋為IXlO4 -1 X IO7拷貝。
[0017]皰疹病毒DNA的提取:嚴格按照商品化的QIAamp DNA抽提試劑盒操作，從臨床標本或病毒分離培養(yǎng)物中提取皰疹病毒DNA。
[0018]PCR擴增檢測:在雙色(或以上)熒光定量PCR儀上進行，每個模板(提取的皰疹病毒DNA、標準品、陽性或陰性對照)分別加入2個PCR反應體系，每個PCR反應體系的總體積為25ml，其中包括20mlPCR反應液I或PCR反應液2和5ml模板。探針檢測模式為:在加PCR反應液I的體系中，F(xiàn)AM和HEX通道分別用于檢測HSV-1和HSV-2 ;在加PCR反應液2的體系中，F(xiàn)AM和HEX通道分別用于檢測EBV和HCMV。PCR反應條件:94°C 5分鐘預變性，940C 20秒一60°C 60秒，共40個循環(huán)。設置完成后，保存文件，運行程序。
[0019]熒光定量結(jié)果報告:①檢測樣品的擴增曲線無對數(shù)增長期或雙探針CT(threshold cycle)值均> 40為陰性；②檢測樣品某一探針CT值< 38且擴增曲線有明顯對數(shù)增長期，則該探針對應的皰疹病毒為陽性；同一反應體系中雙探針CT值均< 38且擴增曲線有明顯對數(shù)增長期，則為兩種皰疹病毒混合陽性；③檢測樣品某一探針38 < CT值< 40，需對樣品重新進行DNA提取和PCR檢測。
[0020]本發(fā)明采用實時熒光定量PCR技術和同一反應體系中雙特異熒光探針，開發(fā)研制了用于常見人皰疹病毒HSV-1、HSV-2、EBV和HCMV分型和定量檢測的試劑盒。該發(fā)明試劑盒的檢測范圍涵蓋了臨床感染中最常見的四種人皰疹病毒，對臨床樣品中的HSV-1、HSV-2、EBV和HCMV不僅能進行同時分型檢測，而且對陽性病毒能進行實時準確定量，可滿足臨床早期、準確診斷HSV-1、HSV-2、EBV和HCMV這四種常見人皰疹病毒感染的迫切需要，為及時制定針對性治療方案提供有力依據(jù)。本發(fā)明基于上述技術背景，設計針對HSV-1、HSV-2、EBV和HCMV這四種臨床最常見皰疹病毒的特異性探針，開發(fā)能同時分型和定量這四種皰疹病毒的熒光定量PCR檢測試劑盒，旨在滿足臨床常見皰疹病毒感染早期、快速診斷的需求，為臨床常見皰疹病毒感染的流行病學調(diào)查和針對性治療提供幫助。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為本發(fā)明試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0022]圖2為HSV-1、HSV-`2、EBV和HCMV濃度梯度標準品的標準曲線。
【具體實施方式】
[0023]本發(fā)明結(jié)合實施例和附圖作進一步說明。應該理解，這些實施例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0024]實施例1
參見圖1，本發(fā)明提供的四種常見人皰疹病毒熒光定量PCR檢測試劑盒，由定量PCR反應液1、定量反應液2、HSV-1標準品3、HSV-2標準品4、EBV標準品5、HCMV標準品6、陰性對照品7、HSV-1陽性對照品8、HSV-2陽性對照品9、EBV陽性對照品10、HCMV陽性對照品
11、說明書12和盒體13組成。
[0025]其中定量PCR反應液含有PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、耐熱DNA聚合酶、上游擴增引物1、下游擴增引物2、HSV-1熒光探針和HSV-2熒光探針；
定量反應液含有PCR緩沖液、MgCl2, dNTPs、耐熱DNA聚合酶、上游擴增引物1、下游擴增引物2、下游擴增引物3、EBV熒光探針和HCMV熒光探針。
[0026]PCR擴增弓丨物序列為:
通用上游擴增引物:5’ -TCATCTACGGGGACACGGAC-3’ ；
通用下游擴增引物:5’ -CGCACCAGATCCACGCCCTT-3’ ；[0027]
【權(quán)利要求】
1.四種常見人皰疹病毒熒光定量PCR檢測試劑盒，所述常見人皰疹為HSV-1、HSV-2、EBV和HCMV，該檢測試劑盒由定量PCR反應液(I )、定量反應液(2)、HSV_1標準品(3)、HSV_2標準品(4 )、EBV標準品(5 )、HCMV標準品(6 )、陰性對照品(7 )、HSV-1陽性對照品(8 )、HSV-2陽性對照品(9)、EBV陽性對照品(10)、HCMV陽性對照品(11)、說明書(12)和盒體(13)組成； 其中定量PCR反應液含有PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、耐熱DNA聚合酶、通用上游擴增引物、通用下游擴增引物、HSV-1熒光探針和HSV-2熒光探針， 定量反應液含有PCR緩沖液、MgCl2, dNTPs、耐熱DNA聚合酶、通用上游擴增引物、通用下游擴增引物、EBV下游擴增引物、EBV熒光探針和HCMV熒光探針， 通用上游擴增引物:5’ -TCATCTACGGGGACACGGAC-3’， 通用下游擴增引物:5，-CGCACCAGATCCACGCCCTT-3，， EBV 下游擴增引物:5，-GAGCTCCACCCCCTTCATC-3’， HSV-1 熒光探針:5’ FAM-GCGGCACAGCACAAAGATG-BHQ-1-3’， HSV-2 熒光探針:5’ HEX-GCGGCACAAAACGAAAATG-BHQ-1-3’， EBV 熒光探針:5’ FAM- GCACTCGATAAACAGCGAG-BHQ-1-3’， HCMV 熒光探針:5’ HEX- GAAAGCGGACAAACACGCT-BHQ-1-3’，
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四種常見人皰疹病毒熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于，陰性對照為無菌注射用水樣品，HSV-1陽性對照、HSV-2陽性對照、EBV陽性對照、HCMV陽性對照分別為HSV-1、HSV-2、EBV、HCMV滅活病毒株樣品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四種常見人皰疹病毒熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于，本發(fā)明試劑盒保存于-20°C，減少反復凍融。
【文檔編號】C12R1/93GK103820573SQ201410026784
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年1月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月21日
【發(fā)明者】舒強, 尚世強, 杜立中, 陶然, 李偉 申請人:浙江大學