專利名稱：Ca19-9定量檢測試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物物質(zhì)檢測分析領(lǐng)域，特別涉及一種CA19-9定量檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
在過去二三十年以來，惡性腫瘤發(fā)病率一直呈上升的趨勢，每年以3 %至5 %的速度增加，成為人類死亡的重要原因。以2002年為例，當(dāng)年全世界新發(fā)腫瘤是1100萬例，死亡病例達(dá)到700萬，治愈和帶瘤生存達(dá)2500萬。腫瘤的早期診斷和治療對提高治愈率、改善生活質(zhì)量和延長生存期至關(guān)重要。腫瘤標(biāo)志物的血清含量水平一般與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、消退、復(fù)發(fā)等有良好的相關(guān)性，檢測這些腫瘤標(biāo)志物的血清水平，對相關(guān)惡性腫瘤的早期診斷、治療效果和預(yù)后轉(zhuǎn)歸判斷等有重要參考價值，目前已在臨床廣泛應(yīng)用。腫瘤標(biāo)志物是指在腫瘤發(fā)生和增殖過程中，由腫瘤細(xì)胞本身合成、釋放或者由機(jī)體對腫瘤細(xì)胞反應(yīng)而產(chǎn)生的 一類物質(zhì)。1978年由Herberman在美國召開的人類免疫與腫瘤免疫診斷會上提出，次年在英國第7屆腫瘤發(fā)生生物學(xué)和醫(yī)學(xué)會議被確認(rèn)并開始引用。糖類抗原CA19-9是一種重要的腫瘤標(biāo)志物之一。CA19-9是一種粘蛋白型的糖類蛋白腫瘤標(biāo)志物，為細(xì)胞膜上的糖脂質(zhì)，因由鼠單克隆抗體116NS19-9識別而命名。CA19-9是迄今報道的對胰腺癌敏感性最高的標(biāo)志物。在血清中它以唾液粘蛋白形式存在，分布于正常胎兒胰腺、膽囊、肝、腸和正常成年人胰腺、膽管上皮等處，是存在于血液循環(huán)的胃腸道腫瘤相關(guān)抗原。大部分胰腺癌患者血清CA19-9水平明顯增高。如果以正常參考范圍上限(37U/mL)為診斷標(biāo)準(zhǔn)，敏感性和特異性均可達(dá)90%以上。CA19-9水平與腫瘤的階段有關(guān)，血清中含量的高低提示手術(shù)的難易程度。術(shù)前CA19-9水平對預(yù)后有一定提示作用，低者預(yù)后較好，術(shù)后CA19-9水平降至正常者生存期長于未下降者。腫瘤復(fù)發(fā)時，CA19-9可再度升高，并且發(fā)生于影像學(xué)診斷之前。因此，CA19-9水平還可用作監(jiān)測腫瘤的復(fù)發(fā)。目前發(fā)現(xiàn)的用于腫瘤篩查診斷的標(biāo)志物大都在患者體內(nèi)含量很低，一般的檢測方法不夠敏感，難于精確定量測定。因此，敏感、準(zhǔn)確、簡便、快速的腫瘤標(biāo)志物檢測方法具有十分重要的臨床應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實施例提供一種CA19-9定量檢測試劑盒及其制備方法，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中無法實現(xiàn)定量測定微量標(biāo)志物的技術(shù)問題。本發(fā)明提供的一種CA19-9定量檢測試劑盒，包括:多個濃度不同的CA19-9校準(zhǔn)品，CA19-9抗體包被的微孔板，CA19-9抗體的酶標(biāo)記物，發(fā)光底物液和濃縮洗滌液。其中，多個CA19-9 校準(zhǔn)品為 6 個，濃度為 0U/mL、5U/mL、30U/mL、100U/mL、200U/mL和400U/mL。包被微孔板的包被濃度為5 μ g/mL。CA19-9抗體的酶標(biāo)記物為采用戊二醛二步法標(biāo)記的辣根過氧化物酶標(biāo)記CA19-9抗體，稀釋倍數(shù)為1: 2000。發(fā)光底物液為魯米諾發(fā)光底物液，魯米諾發(fā)光底物液包括底物A液和底物B液，其中底物A液包括1.8g/L的魯米諾和0.2g/L的對碘苯酚，底物B液包括0.5g/L的過氧化脲。本發(fā)明還提供一種CA19-9定量檢測試劑盒的制備方法，包括:制備多個濃度不同的CA19-9校準(zhǔn)品；制備CA19-9抗體包被的微孔板；制備CA19-9抗體的酶標(biāo)記物；制備化學(xué)發(fā)光底物液；以及制備濃縮洗滌液。其中，制備多個濃度不同的CA19-9校準(zhǔn)品包括:通過稀釋配制6個校準(zhǔn)品，濃度為0U/mL、5U/mL、30U/mL、100U/mL、200U/mL 和 400U/mL。制備CA19-9抗體包被的微孔板包括:將濃度為5 μ g/mLCA19_9抗體加入微孔板，置于4°C冰箱24小時；去除微孔板中的包被液后加入封閉液,置于4°C冰箱封閉24小時；去除微孔板中的封閉液后，置于37°C孵育箱8小時烘干。制備CA19-9抗體的酶標(biāo)記物包括:通過戊二醛二步法制得辣根過氧化物酶標(biāo)記的辣根過氧化物酶標(biāo)記CA19-9抗體，稀釋倍數(shù)為1: 2000?；瘜W(xué)發(fā)光底物液為魯米諾化學(xué)發(fā)光底物液，魯米諾化學(xué)發(fā)光底物液包括底物A液和底物B液；底物A液用0.05M pH8.6的Tris-HCl緩沖液溶解魯米諾和對碘苯酚制得，其中魯米諾濃度為1.8g/L，對碘苯酚濃度為0.2g/L ;底物B液用0.05M pH8.6的Tris-HCl緩沖液稀釋過氧化脲制得，其中過氧化脲的濃度為0.5g/L。本發(fā)明通過采用多個校準(zhǔn)品和增強(qiáng)型發(fā)光體系，具有靈敏度高，線性范圍寬，光信號持續(xù)時間長，分析簡便快速，結(jié)果穩(wěn)定，誤差小，安全性好，使用期長的有益效果。


此處所說明的附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本申請的一部分，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限定。在附圖中:圖1為本發(fā)明實施例一的CA19-9定量檢測試劑盒的制備方法的流程圖。圖2為本發(fā)明的試劑盒與進(jìn)口試劑盒所測CA19-9濃度的相關(guān)性分析圖。
具體實施例方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚明白，下面結(jié)合附圖對本發(fā)明實施例作進(jìn)一步詳細(xì)說明。在此，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，但并不作為對本發(fā)明的限定。實施例一本實施例提供一種CA19-9定量檢測試劑盒，包括:多個濃度不同的CA19-9校準(zhǔn)品，CA19-9抗體包被的包被微孔板，CA19-9抗體的酶標(biāo)記物，發(fā)光底物液和濃縮洗滌液。其中，優(yōu)選CA 19-9 校準(zhǔn)品為 6 個，濃度為 0U/mL、5U/mL、30U/mL、100U/mL、200U/mL和400U/mL。包被微孔板的濃度為5 μ g/mL。CA19-9抗體的酶標(biāo)記物為采用戊二醛二步法標(biāo)記的辣根過氧化物酶標(biāo)記CA19-9抗體，稀釋倍數(shù)為1: 2000。發(fā)光底物液為魯米諾發(fā)光底物液，魯米諾發(fā)光底物液包括底物A液和底物B液，其中底物A液包括1.8g/L的魯米諾和0.2g/L的對碘苯酚，底物B液包括0.5g/L的過氧化脲。濃縮洗滌液為30倍濃縮洗滌液，具體為加入濃度為1.5g/L的吐溫-20和濃度為0.05% PC300防腐劑的0.3M ρΗ7.4的磷酸鹽緩沖液。該CA19-9定量檢測試劑盒的使用步驟包括:
(I)用蒸餾水將30倍濃縮洗滌液稀釋30倍，混勻后使用；(2)在包被微孔板上設(shè)多個校準(zhǔn)品孔和樣品孔，優(yōu)選為6個校準(zhǔn)品孔；(3)校準(zhǔn)品孔加入校準(zhǔn)品，樣品孔加入待測樣品，每孔加入25UL，然后加入CA 19-9抗體的酶標(biāo)記物溶液75 μ L，37°C溫育60分鐘。(4)用洗滌液洗滌微孔板5次，拍干。(5)每孔加入發(fā)光底物A液和B液各50 μ I，混勻，室溫避光放置5 10分鐘。(6)用化學(xué)發(fā)光分析儀測量各孔的相對發(fā)光值(RLU)。(7)以校準(zhǔn)品測定結(jié)果繪制劑量-反應(yīng)曲線。(8)從劑量-反應(yīng)曲線上求出對應(yīng)樣本RLU的CA19-9含量，即為該樣品的CA19-9濃度。實施例二如圖1所示，圖1是本發(fā)明實施例提供的一種CA19-9定量測定試劑盒的制備方法流程圖，包括:步驟SllO:制備多個濃度不同的CA19-9校準(zhǔn)品；步驟S120:制備CA19-9抗體包被的包被微孔板；步驟S130:制備CA 19-9抗體的酶標(biāo)記物；步驟S140:制備化學(xué)發(fā)光底物液；步驟S150:制備濃縮洗滌液。對于上述方法，詳細(xì)說明如下:(一)CA 19-9校準(zhǔn)品的配制方法用稀釋液配制6管(A、B、C、D、E、F)校準(zhǔn)品，稀釋液含0.05M pH7.4的PBS，50%小牛血清，2%甘油和0.1 % PC300防腐劑。校準(zhǔn)品中CA19-9的濃度分別為A管OU/mL、B管5U/mL、C 管 30U/mL、D 管 100U/mL、E 管 200U/mL 及 F 管 400U/mL。其中 PC300 為防腐劑，其活性成分主要是2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(MCI)和5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉_3_酮(CMCI)。這兩種成分可以抑制細(xì)胞的生長，有效地控制體外診斷試劑中微生物的生長，是一種理想的可替代硫汞撒、疊氮化鈉和慶大霉素等的生物防腐劑。本實施例通過采用多個校準(zhǔn)品，使得檢測結(jié)果更準(zhǔn)確，更可靠。(二)CA 19-9抗體包被微孔板的制備微孔板為96孔的不透明聚苯乙烯微孔板。配制0.05M pH9.6碳酸鹽的緩沖液，配制方法是稱取2.2克的Na2CO3和1.0克NaHCO3溶于IOOml蒸餾水中，混勻備用。配制0.05M pH7.4PBS封閉液，配置方法是稱取0.3克NaH2PO4.2Η20、1.85克KH2PO4.3Η20和1.8克氯化鈉溶于200ml蒸餾水中，混勻后加入0.2克牛血清白蛋白和200 μ I PC300，混勻備用。包被步驟具體包括:(I)用緩沖液將CA19-9單抗稀釋成包被濃度為5 μ g/mL的包被液，以每孔100 μ I方式將包被液加入微孔板，然后置于4°C冰箱24小時。(2)除去微孔板中的包被液，以每孔150 μ I加入0.05Μ pH7.4PBS封閉液，置于4°C冰箱封閉24小時。
(3)除去封閉液后，置于37°C孵育箱8小時烘干。本申請制備的包被微孔板的產(chǎn)品性能穩(wěn)定，重復(fù)性好。(三)酶標(biāo)記CA19-9抗體的制備標(biāo)記用酶是辣根過氧化物酶，CA19-9抗體可以是單克隆抗體或者多克隆抗體。以戊二醛二步法進(jìn)行辣根過氧化物酶標(biāo)記為例說明本發(fā)明的酶標(biāo)記CA19-9抗體。標(biāo)記方法具體包括:(I)稱取辣根過氧化物酶25mg溶于0.5毫升1.25%戊二醛溶液中(用
0.1ΜρΗ6.8PBS配制)，于室溫靜置過夜。(2)次日，將酶與戊二醛反應(yīng)后的溶液用0.0lM Ph7.4PBS充分透析。(3)將待標(biāo)記的CA19-9抗體IOmg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入以上透析好的酶溶液中。(4)用IM PH9.5碳酸緩沖液0.25ml，繼續(xù)攪拌3小時。(5)加0.2M賴氨酸0.25ml，混勻后，置室溫2小時。(6)在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4°C I小時。(7)離心半小時(3000轉(zhuǎn)/分鐘)，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于0.5mL的0.15M PH7.4的PBS中。(8)將上述溶液裝入透析袋中，用0.15M PH7.4的PB緩沖鹽水透析去除銨離子后，離心30分鐘(10，000轉(zhuǎn)/分鐘)去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保存。酶標(biāo)記抗體的最佳使用稀釋倍數(shù)是用洗滌液作1: 2000稀釋。其中，然后加熱攪拌溶解后,室溫靜置過夜后,上清液即為飽和硫酸銨。取該上清液400毫升加20毫升IM的鹽酸，再補(bǔ)加380毫升蒸餾水，混勻后即為半飽和硫酸銨。(四)化學(xué)發(fā)光底物液的制備首先配制0.05M pH8.6的Tris-HCl緩沖液。配置方法是:稱取0.61克三羥甲基氨基甲烷溶于100毫升蒸餾水中，并加入105微升濃鹽酸，混勻后加入50 μ 1PC300防腐劑，混勻備用。底物液包括底物A液和底物B液。底物A液的配制方法是含1.8g/L魯米諾和0.2g/L對碘苯酚，用以上配制的0.05M ρΗ8.6的Tris-HCl緩沖液溶解。底物B液:含0.5g/L的過氧化脲，用以上配制的0.05M pH8.6的Tris-HCl緩沖液做稀釋液。使用時A液和B液等量混合后使用，每孔加100 μ I。如果發(fā)光底物的含量不在合適的范圍之內(nèi)，則發(fā)出的光粒子的量不能維持在恒定平臺期，會影響前后檢測時間差的重復(fù)性，即造成批間和批內(nèi)實驗的誤差擴(kuò)大。本發(fā)明提供的底物發(fā)光的平臺期長，靈敏度高、寬的線性動力學(xué)范圍、光信號持續(xù)時間長、分析方法簡便快速、結(jié)果穩(wěn)定、誤差小、安全性好及使用期長等特點，產(chǎn)品臨床性能優(yōu)異。(五)濃縮洗滌液的配制以IOOml 濃縮洗液為例，稱取 0.89 克 NaH2PO4.2Η20 和 5.56 克 KH2PO4.3Η20,加到IOOml水中，加入150 μ I吐溫-20和50 μ I PC300，攪勻。使用時，用蒸餾水作30倍稀釋。通過精密度測定、穩(wěn)定性試驗和臨床試驗顯示本發(fā)明提供的CA19-9定量檢測試劑盒在精密度高、穩(wěn)定性強(qiáng)和臨床檢測效果優(yōu)異。(一 )精密度測定
批內(nèi)精密度測定方法是按實施例一所述使用方法，重復(fù)10孔檢測I份精密度參考品，測定并計算其變異系數(shù)(CV)值。精密度(CV% ) = (SD/X)父100%，要求(^%彡15%。批內(nèi)精密度測定的發(fā)光值檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種CA19-9定量檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括: 多個濃度不同的CA19-9校準(zhǔn)品，CA 19-9抗體包被的微孔板，CA 19-9抗體的酶標(biāo)記物，發(fā)光底物液和濃縮洗滌液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于: 所述多個 CA 19-9 校準(zhǔn)品為 6 個，濃度為 0U/mL、5U/mL、30U/mL、100U/mL、200U/mL 和400U/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于: 所述包被微孔板的包被濃度為5 μ g/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于: 所述CA19-9抗體的酶標(biāo)記物為采用戊二醛二步法標(biāo)記的辣根過氧化物酶標(biāo)記CA19-9抗體，稀釋倍數(shù)為1: 2000。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于: 所述發(fā)光底物液為魯米諾發(fā)光底物液，所述魯米諾發(fā)光底物液包括底物A液和底物B液，其中所述底物A液包括1.8g/L的魯米諾和0.2g/L的對碘苯酚，所述底物B液包括0.5g/L的過氧化脲。
6.一種CA19-9定量檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，該方法包括: 制備多個濃度不同的CA19-9校準(zhǔn)品； 制備CA19-9抗體包被的微孔板； 制備CA 19-9抗體的酶標(biāo)記物； 制備化學(xué)發(fā)光底物液；以及 制備濃縮洗滌液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，制備多個濃度不同的CA19-9校準(zhǔn)品包括: 通過稀釋配制 6 個校準(zhǔn)品，濃度為 0U/mL、5U/mL、30U/mL、100U/mL、200U/mL 和 400U/mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，制備CA19-9抗體包被的包被微孔板包括: 將濃度為5 μ g/mLCA19-9抗體加入微孔板，置于4°C冰箱24小時； 去除微孔板中的包被液后加入封閉液，置于4°C冰箱封閉24小時； 去除微孔板中的封閉液后，置于37°C孵育箱8小時烘干。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，制備CA19-9抗體的酶標(biāo)記物包括: 通過戊二醛二步法制得辣根過氧化物酶標(biāo)記的辣根過氧化物酶標(biāo)記CA19-9抗體，稀釋倍數(shù)為1: 2000。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于: 所述化學(xué)發(fā)光底物液為魯米諾化學(xué)發(fā)光底物液，所述魯米諾化學(xué)發(fā)光底物液包括底物A液和底物B液； 所述底物A液用0.05M pH8.6的Tris-HCl緩沖液溶解魯米諾和對碘苯酚制得，其中魯米諾濃度為1.8g/L，對碘苯酚濃度為0.2g/L ； 所述底物B液用0.05M pH8.6的Tris-HCl緩沖液稀釋過氧化脲制得，其中過氧化脲的濃度為0.5g/L。
全文摘要
本發(fā)明提供一種CA19-9定量檢測試劑盒，包括多個濃度不同的CA19-9校準(zhǔn)品，CA19-9抗體包被的微孔板，CA19-9抗體的酶標(biāo)記物，發(fā)光底物液和濃縮洗滌液。本發(fā)明的CA19-9定量檢測試劑盒具有靈敏度高，線性范圍寬，光信號持續(xù)時間長，分析簡便快速，結(jié)果穩(wěn)定，誤差小，安全性好，使用期長等有益效果。
文檔編號G01N33/68GK103175970SQ20131004371
公開日2013年6月26日 申請日期2013年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月5日
發(fā)明者吳玉水, 戴志文, 蔡祥霞, 謝玉玲 申請人:福建省洪誠生物藥業(yè)有限公司