同時(shí)檢測人類皰疹病毒及腸道病毒的基因芯片的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及同時(shí)檢測人類皰疹病毒及腸道病毒的基因芯片，包括核苷酸提取試劑盒、DNA與RNA同時(shí)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA與RNA同時(shí)PCR擴(kuò)增試劑盒、連接有特異探針的基因芯片。本發(fā)明僅用100μl腦脊液即可實(shí)現(xiàn)多種皰疹病毒、腸道病毒核酸同時(shí)提取、擴(kuò)增和檢測，所需樣本量少，提取快捷，擴(kuò)增效率高，結(jié)果可靠，特異性強(qiáng)，可以實(shí)現(xiàn)對上述病毒引起的臨床病毒性腦炎、腦膜炎的早期診斷和治療，解決了目前臨床腦脊液中病毒檢測的瓶頸問題。
【專利說明】同時(shí)檢測人類皰疹病毒及腸道病毒的基因芯片
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及同時(shí)檢測人類皰疹病毒及腸道病毒的基因芯片，屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]病毒性腦炎、腦膜炎是由病毒感染引起的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損害為主的傳染病，常見的病毒主要包括皰疹病毒科的單純皰疹病毒I型和2型(HSV1和HSV2)、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、人巨細(xì)胞病毒(HCMV)、人類皰疹病毒6型(HHV6)和7型(HHV7)以及引起手足口病的腸道病毒(EVs)如腸道病毒71型(EV71)、柯薩奇病毒A16型(CoxA16)和柯薩奇B組5型(CoxB5)等。由單純皰疹病毒引起的單純皰疹病毒腦炎是散發(fā)性腦炎及腦膜炎最常見的病原體，若不及時(shí)用無環(huán)鳥苷進(jìn)行抗病毒治療，則死亡率可高達(dá)70%.而近年亞洲地區(qū)流行的手足口病，規(guī)模呈上升趨勢，并發(fā)重癥CNS感染而導(dǎo)致死亡的病例也逐漸增多，可引起無菌性腦膜炎、腦干腦炎、急性脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹、腦脊髓炎、神經(jīng)源性肺水腫，甚至導(dǎo)致死亡，重癥存活患者常伴有神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。
[0003]由于不同的病毒感染，病變范圍、程度相差懸殊，臨床表現(xiàn)十分復(fù)雜，缺乏特異性，給診斷帶來困難，確診的主要依據(jù)是腦脊液的病原學(xué)診斷，但腦脊液中病毒含量甚低，其病毒培養(yǎng)檢測不但費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，而且敏感性和特異性很差，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床要求，嚴(yán)重滯后于臨床治療；而組織學(xué)和免疫學(xué)檢測方法需要在疾病中后期取材才可能得到陽性結(jié)果，由此延誤治療造成該類疾病的死亡率居高不下或病后嚴(yán)重的后遺癥，對人民身體健康和生命質(zhì)量造成嚴(yán)重危害。
[0004]分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為解決這一難題提供了條件，PCR是一種簡便和快速的體外DNA擴(kuò)增技術(shù)，是以樣本中的DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下，特異性地在體外擴(kuò)增所需要的目的基因，以檢測DNA病毒；RT-PCR技術(shù)是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上建立起來的，以樣本中的RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測RNA病毒的感染。兩者因其簡便、快速、靈敏、特異等優(yōu)點(diǎn)已成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最有價(jià)值的研究手段和病毒學(xué)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。皰疹病毒為一組有包膜的DNA病毒，而包括手足口病毒在內(nèi)的腸道病毒是一組正義單鏈RNA病毒，由于DNA病毒和RNA病毒基因組核酸提取方法及擴(kuò)增程序都不同，目前所建立的檢測腦脊液皰疹病毒和腸道病毒的方法仍需將DNA病毒與RNA病毒分別進(jìn)行核酸提取，DNA病毒的核酸提取多采用蛋白酶K/酚-氯仿-異戊醇提取法，再將提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；RNA病毒的核酸提取多采用Trizol/氯仿-異丙醇提取法，再將提取的RNA進(jìn)行RT-PCR檢測。
[0005]中國專利文獻(xiàn)CN103614371A(申請?zhí)?01310594174.0)公開了一種同時(shí)提取血清、雙拭子中動(dòng)物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法,該發(fā)明公開了一種同時(shí)提取血清、雙拭子中動(dòng)物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法，包括步驟:對待提取物使用異硫氰酸胍裂解液裂解；硅膠膜吸附RNA ;洗液I除去雜蛋白；洗液II洗去雜質(zhì)；DEPC水洗脫核酸；上述異硫氰酸胍裂解液包括 3-7M 異硫氰酸胍、0.6% -1.0% TriTon-100,30-50mM Tris-Cl、5_15mMDTT,60-90y g/mL 蛋白酶 K、10_30mM EDTA, PH 在 4.3-4.6 ;上述洗液 I 包括 5-6M 鹽酸胍，53-59%無水乙醇，Κ70-90μ g/mL蛋白酶，PH在6.4-6.6 ;上述洗液II包括70-80%乙醇。該發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于提取過程簡單、周期短、成本低、能同時(shí)提取動(dòng)物血清樣本、雙拭子樣本中的RNA病毒和DNA病毒核酸。
[0006] 雖然上述文獻(xiàn)公開了同時(shí)提取DNA和RNA的方法，但所含試劑多、成分復(fù)雜、操作較為繁瑣，更重要的是該方法僅針對動(dòng)物血清及雙拭子樣本中的RNA病毒和DNA病毒核酸，因這些樣本通常含有的RNA病毒和DNA病毒核酸濃度較高，易于提取分離，但如應(yīng)用于病毒含量較低的腦脊液樣本，可造成腦脊液本身低濃度的病毒丟失使結(jié)果呈現(xiàn)假陰性，因而不適宜腦脊液中病毒的提取。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種同時(shí)檢測人類皰疹病毒及腸道病毒的基因芯片，僅通過一次提取、擴(kuò)增和雜交即可同時(shí)檢測出腦脊液中上述病毒的靶基因，時(shí)間僅需
5.5小時(shí)。
[0008]本發(fā)明技術(shù)方案如下:
[0009]一種同時(shí)檢測腦脊液中人類皰疹病毒及腸道病毒的基因芯片，包括核苷酸提取試劑盒、DNA與RNA同時(shí)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA與RNA同時(shí)PCR擴(kuò)增試劑盒、連接有特異探針的基因芯片；其特征在于:
[0010]所述的DNA與RNA同時(shí)PCR擴(kuò)增試劑盒中的引物由Biotin-HHVl，2，4，5-f、HHVI, 2，5-r、HHV4_r、Biotin-EV-f和EV_r五種引物混合，核苷酸序列分別如下:
[0011]HHV1, 2, 4, 5-f:5/ -TCATCTACGGGGACACGGAC-3'；
[0012]HHV1,2,5-r: 5' -CGCACCAGATCCACGCCCTT-3'；
[0013]HHV4-r:5' -GAGCTCCACCCCCTTCATC-3'；
[0014]EV-f:5' -TTAAAACAGCCTGTGGGTTG-3'；
[0015]EV-r:5' -TGACTCATCGACCTGATCTACA-3 ；
[0016]其中HHVl, 2，4，5-f 為擴(kuò)增 HSV1、HSV2、EBV, CMV 的上游引物；
[0017]HHVl, 2，5-r 為擴(kuò)增 HSV1、HSV2、CMV 的下游引物；
[0018]HHV4-r為擴(kuò)增EBV的下游引物；
[0019]Biotin-HHVl, 2，4，5-f 和 Biotin-EV-f 為在兩條上游引物 HHV1, 2，4，5-f 和 EV_f的5’端添加生物素Biotin作為標(biāo)記物；
[0020]所述的特異性探針分為腸道病毒特異性探針和人類皰疹病毒特異性探針，腸道病毒特異性探針序列如下:
[0021 ] EV71-P:GATCGTGGTTCGCTGCTTCTA ；
[0022]CA16-P:CACTATTGGTCGTGATTGTACAAAG ；
[0023]CB5-P:TGCCTACTATTGATCGAGGTGTATTG ；
[0024]人類皰疹病毒特異性探針序列如下:
[0025]HSV1-P:GGCACAGCACAAAGATGGA ；
[0026]HSV2-P:GGCACAAAACGAAAATGGA ；
[0027]HHV3-P:GTTTGTTATGACGGCCGAG ；[0028]HHV5-P:ACGAAAGCGGACAAACACG。
[0029]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述核苷酸提取試劑盒中的提取裂解液，每百毫升組分如下:
[0030]硫氰酸胍47.264g, N-月桂酰肌氨酸0.5g, 二硫蘇糖醇15.425mg,梓檬酸鈉736.25mg，糖原 IOmg, DEPC_ddH20 加至 100mL ；
[0031]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述的DNA與RNA同時(shí)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中的特異性逆轉(zhuǎn)錄引物序列如下:
[0032]EV-r:5' -TGACTCATCGACCTGATCTACA-3'；
[0033]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述的DNA與RNA同時(shí)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，反應(yīng)體系如下:
[0034]5XRT Buffer2y I, RT Enzyme Mix0.5 μ 1，2 μ M 特異性逆轉(zhuǎn)錄引物 0.5 μ 1，核酸模板 2 μ I，DEPC-ddH20 加至 10 μ I。
[0035]逆轉(zhuǎn)錄試劑盒除引物外的其它試劑也可采用本領(lǐng)域市售產(chǎn)品。
[0036]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述的DNA與RNA同時(shí)PCR擴(kuò)增試劑盒中，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下:
[0037]IOXPCR Bufferl.5 μ I, dNTP(10mM each) 0.4 μ 1，MgCl2 (IOmM) 0.6 μ 1，混合引物10.4 μ 1，PCR 模板 1.Ομ I, Taq 聚合酶 0.5μ 1，加 ddH20 至 15μ I。
[0038]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述的PCR擴(kuò)增的引物由Biotin-HHVl，2，4，5-f,HHVl, 2，5-r、HHV4-r、Biotin-EV-f 和 EV-r 五種引物按摩爾比 4.5:0.6:0.2:4.5:0.6 的比
例混合。
[0039]本發(fā)明所應(yīng)用的雜交緩沖液、洗漆液和Cy3_Streptavidin溶液為普通市售試劑。
[0040]利用上述基因芯片同時(shí)檢測腦脊液中人類皰疹病毒及腸道病毒的方法，步驟如下:
[0041](I)取腦脊液100μ 1，加入200 μ I硫氰酸胍核酸提取裂解液，渦旋振蕩器混勻30sec，室溫靜置IOmin ；
[0042](2)加入250 μ I預(yù)冷的異丙醇，冰上放置5min ;12000rpm,4°C離心10min ;棄上清，DEPC配制的體積百分比為75%乙醇750μ I洗滌沉淀，12000rpm，4°C離心10min ;風(fēng)干，
10μ I DEPC-ddH20溶解后做為核酸模板；
[0043](3)取步驟(2)制得的核酸模板，利用DNA與RNA同時(shí)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RT-PCR，制得逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物；
[0044]RT-PCR 反應(yīng)體系:
[0045]5 X RT Buffer2 μ I，加入 RT Enzyme Mix0.5 μ I，2 μ M 特異性逆轉(zhuǎn)錄弓丨物 0.5 μ I，核酸模板2 μ 1，DEPC-ddH20加至10 μ 1，混勻；
[0046]RT-PCR 反應(yīng)條件:42°C 15min,85°C 5sec ；
[0047]所述的PCR擴(kuò)增為非對稱的生物素標(biāo)記引物擴(kuò)增，兩條上游引物5’端的標(biāo)記物為生物素，所用熒光素為Cy3標(biāo)記的鏈霉親和素； [0048](4)取步驟(3)制得的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物為模板，利用DNA與RNA同時(shí)PCR擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0049]PCR反應(yīng)體系:
[0050]10XPCR Bufferl.5 μ 1，dNTP(10mM each) 0.4 μ 1，MgCl2 (IOmM) 0.6 μ I，混合引物10.4 μ 1，PCR 模板 1.0 μ 1，Taq 聚合酶 0.5 μ 1，加 ddH20 至 15μ I ；
[0051]PCR反應(yīng)條件:
[0052]95°C 預(yù)變性 5min ;95°C 變性 30sec、58°C退火 30sec、72°C 延伸 30sec，35 個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min。
[0053](5)取步驟⑷制得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于95 V變性3min，冰中冷卻，與等量雜交緩沖液混勻，與連接有特異分子探針的基因芯片雜交，48 °C避光2h，洗滌之后與Cy3-Streptavidin溶液在室溫反應(yīng)30min,洗漆,離心干燥,進(jìn)行掃描分析。
[0054]有益效果
[0055]1、本發(fā)明克服了臨床腦脊液樣本中不同DNA、RNA病毒核酸提取和擴(kuò)增的限制，實(shí)現(xiàn)了對腦脊液DNA病毒和RNA病毒基因進(jìn)行同時(shí)提取和擴(kuò)增，與DNA、RNA分別提取再進(jìn)行PCR和RT-PCR擴(kuò)增的結(jié)果一致；
[0056]2、本發(fā)明僅用100μ I腦脊液即可實(shí)現(xiàn)多種皰疹病毒、腸道病毒核酸同時(shí)提取、擴(kuò)增和檢測，所需樣本量少，提取快捷，擴(kuò)增效率高，結(jié)果可靠，特異性強(qiáng)，可以實(shí)現(xiàn)對上述病毒引起的臨床病毒性腦炎、腦膜炎的早期診斷和治療，解決了目前臨床腦脊液中病毒檢測的瓶頸問題；
[0057]3、本發(fā)明所述的基因芯片可以一次性快速檢測四種皰疹病毒:單純皰疹病毒I型和2型(HSV1和HSV2)、EB病毒(EBV)、人巨細(xì)胞病毒(HCMV)，和三種腸道病毒:腸道病毒71型(EV71)、柯薩奇病毒A組16型(CoxA16)和柯薩奇B組5型(CoxB5)，具有平行、準(zhǔn)確、省時(shí)、省力、樣本用量少的特點(diǎn)。
[0058]4、本發(fā)明以腦脊液為主要樣本的RNA病毒和DNA病毒核酸提取方法，結(jié)合快速擴(kuò)增及病毒芯片技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)僅通過一次提取、擴(kuò)增和雜交即可同時(shí)檢測腦脊液中常見的人類皰疹病毒和腸道病毒的靶基因。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0059]圖1、人類皰疹病毒DNA和腸道病毒RNA同時(shí)提取擴(kuò)增與分別提取擴(kuò)增結(jié)果；
[0060]圖中:左側(cè)為本發(fā)明的DNA/RNA同時(shí)提取擴(kuò)增的結(jié)果；右側(cè)為DNA、RNA分別提取后再行PCR、RT-PCR的結(jié)果；
[0061]其中M為DL-2000DNA Marker ；HSV1為單純皰疹病毒I型；HSV2為單純皰疹病毒2型；EBV為EB病毒；CMV為人巨細(xì)胞病毒；EV71為腸道病毒71型；CA16為柯薩奇病毒A組16型；CB5為柯薩奇病毒B組5型。
[0062]圖2、典型樣本的病毒芯片雜交結(jié)果；
[0063]其中:1.為HSVl陽性樣本雜交結(jié)果；2.為HSV2陽性樣本雜交結(jié)果；3.為EBV陽性樣本雜交結(jié)果；4.為CMV陽性樣本雜交結(jié)果；5.為EV71陽性樣本雜交結(jié)果；6.為CA16陽性樣本雜交結(jié)果；7.為CB5陽性樣本雜交結(jié)果；8.為EBV和CMV雙陽性樣本雜交結(jié)果；
[0064]圖3、病毒檢測探針排布圖；
[0065]
【權(quán)利要求】
1.一種同時(shí)檢測腦脊液中人類皰疹病毒及腸道病毒的基因芯片，包括核苷酸提取試劑盒、DNA與RNA同時(shí)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA與RNA同時(shí)PCR擴(kuò)增試劑盒、連接有特異探針的基因芯片；其特征在于: 所述的DNA與RNA同時(shí)PCR擴(kuò)增試劑盒中的引物由Biotin-HHVl, 2，4，5_f、HHVI, 2，5-r、HHV4_r、Biotin-EV-f和EV_r五種引物混合，核苷酸序列分別如下:
HHVI, 2，4，5-f:5/ -TCATCTACGGGGACACGGAC-3'；
HHV1, 2, 5-r: 5' -CGCACCAGATCCACGCCCTT-3'； HHV4-r:5' -GAGCTCCACCCCCTTCATC-3'； EV-f:5' -TTAAAACAGCCTGTGGGTTG-3'； EV-r:5' -TGACTCATCGACCTGATCTACA-3 ； 其中HHVI, 2，4，5-f為擴(kuò)增HSV1、HSV2、EBV、CMV的上游引物； HHVI, 2，5-r為擴(kuò)增HSV1、HSV2、CMV的下游引物； HHV4-r為擴(kuò)增EBV的下游引物； Biotin-HHVl, 2， 4，5-f 和 Biotin-EV-f 為在兩條上游引物 HHVI, 2，4，5-f 和 EV-f 的 5，端添加生物素Biotin作為標(biāo)記物； 所述的特異性探針分為腸道病毒特異性探針和人類皰疹病毒特異性探針，腸道病毒特異性探針序列如下:
EV71-P:GATCGTGGTTCGCTGCTTCTA ；
CA16-P:CACTATTGGTCGTGATTGTACAAAG ；
CB5-P:TGCCTACTATTGATCGAGGTGTATTG ； 人類皰疹病毒特異性探針序列如下:
HSVl-P:GGCACAGCACAAAGATGGA ；
HSV2-P:GGCACAAAACGAAAATGGA ；
HHV3-P:GTTTGTTATGACGGCCGAG ；
HHV5-P:ACGAAAGCGGACAAACACG。
2.如權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述核苷酸提取試劑盒中的提取裂解液，每百毫升組分如下: 硫氰酸胍47.264g,N-月桂酰肌氨酸0.5g, 二硫蘇糖醇15.425mg,檸檬酸鈉736.25mg,糖原 10mg，DEPC-ddH20 加至 100ml。
3.如權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述的DNA與RNA同時(shí)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中的特異性逆轉(zhuǎn)錄引物序列如下:
EV-r:5/ -TGACTCATCGACCTGATCTACA-3'。
4.如權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述的DNA與RNA同時(shí)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，反應(yīng)體系如下: 5XRT Buffer2y I, RT Enzyme Mix0.5 μ 1，2 μ M 特異性逆轉(zhuǎn)錄引物 0.5 μ 1，核酸模板。2 μ I，DEPC-ddH20 加至 10 μ L.
5.如權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述的DNA與RNA同時(shí)PCR擴(kuò)增試劑盒中，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下:
IOXPCR Bufferl.5 μ I,每種濃度均為 IOmM 的 dNTP0.4 μ 1，IOmM 的 MgCl20.6 μ 1，混合引物 10.4μ 1，PCR 模板 1.0 μ 1，Taq 聚合酶 0.5 μ 1，加 ddH20 至 15μ I。
6.如權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述的PCR擴(kuò)增的引物由Biotin-HHVl, 2，4，5-f,HHVI, 2，5_r、HHV4_r、Biotin-EV-f 和 EV-r 五種引物按摩爾比 4.5:.0.6:0.2:4.5:0.6 的比例混合。
7.利用權(quán)利要求1所述基因芯片同時(shí)檢測腦脊液中人類皰疹病毒及腸道病毒的方法，其特征在于，步驟如下: (1)取腦脊液100μ1，加入200μ I硫氰酸胍核酸提取裂解液，渦旋振蕩器混勻30sec，室溫靜置IOmin ； (2)加入250μI預(yù)冷的異丙醇，冰上放置5min ; 12000rpm，4°C離心10min ;棄上清，DEPC配制的體積百分比為75%乙醇750 μ I洗滌沉淀，12000rpm，4°C離心10min ;風(fēng)干，.10 μ I DEPC-ddH20溶解后做為核酸模板； (3)取步驟(2)制得的核酸模板，利用DNA與RNA同時(shí)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RT-PCR，制得逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物； RT-PCR反應(yīng)體系 : . 5 X RT Buffer2y 1，加入 RT Enzyme Mix0.5 μ 1，2 μ M 特異性逆轉(zhuǎn)錄引物 0.5 μ 1，核酸模板 2 μ 1，DEPC-ddH20 加至 10 μ 1，混勻；
RT-PCR 反應(yīng)條件:42°C 15min，85°C 5sec ； 所述的PCR擴(kuò)增為非對稱的生物素標(biāo)記引物擴(kuò)增，兩條上游引物5’端的標(biāo)記物為生物素，所用熒光素為Cy3標(biāo)記的鏈霉親和素； (4)取步驟(3)制得的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物為模板，利用DNA與RNA同時(shí)PCR擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； PCR反應(yīng)體系:
10XPCR Bufferl.5 μ I, dNTP(10mM each) 0.4 μ I, MgCl2 (IOmM) 0.6 μ I,混合弓丨物.10.4 μ 1，PCR 模板 1.0 μ 1，Taq 聚合酶 0.5 μ 1，加 ddH20 至 15μ I ； PCR反應(yīng)條件: . 95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30sec、58°C退火30sec、72°C延伸30sec，35個(gè)循環(huán)；最后.72°C 延伸 5min ； (5)取步驟(4)制得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于95°C變性3min，冰中冷卻，與等量雜交緩沖液混勻，與連接有特異分子探針的基因芯片雜交，48°C避光2h，洗滌之后與Cy3-Str印tavidin溶液在室溫反應(yīng)30min，洗滌，離心干燥，進(jìn)行掃描分析。
【文檔編號】C12Q1/70GK103981289SQ201410249930
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年6月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月6日
【發(fā)明者】劉毅, 段春紅, 馬衍輝 申請人:山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院