專利名稱：柯薩奇病毒a4核酸檢測用引物、探針及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物檢測技術，具體地說涉及柯薩奇病毒A4核酸檢測用引物、探針及試劑盒。
背景技術：
柯薩奇病毒A4 (coxsackievirus A4,簡稱CVA4)為單股正鏈RNA病毒，屬小RNA病毒科(Picoranviridae),根據其分子遺傳特征，CVA4屬于人類腸道病毒A類(humanenterovirus A,簡稱HEV-A)。CVA4作為人類感染性疾病的一種病原,能引起多種疾病，如手足口病、皰疹性咽峽、類感冒發(fā)熱疾病、心肌心包炎及急性腸道感染性疾病等。近些年爆發(fā)的手足口病的病原學調查顯示，除主要病原體人類腸道病毒71 (human enterovirus 7LHEV71)外，還有多種HEV-A參與感染，其中CVA4就是常見的一種。并且，最近韓國爆發(fā)的心肌心包炎、俄羅斯的急性腸道感染性疾病病原學調查以及中國的手足口病的病原學調查發(fā)現都與CVA4有關。CVA 4的感染一年四季均可發(fā)生，其主要通過糞-口途徑在人群中傳播,帶毒的糞便可通過污染的手、餐具、食物經口進入人體，咳嗽、打噴嚏形成的飛沫可直接或間接進行傳播，另外，接觸病人破潰的皰疹液等也受到感染。CVA 4作為一種潛在的威脅，為了更好地應對CVA4的感染所引發(fā)的疾病流行，提供一種快速、準確的檢測技術顯的尤為重要。本發(fā)明選擇柯薩奇病毒A4的VPl基因設計用于熒光RT-PCR檢測的引物及探針序列，建立了柯薩奇病毒A4熒光RT-PCR檢測技術，反應結束即可根據擴增曲線判定是否感染柯薩奇病毒A4。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的在于提供用于柯薩奇病毒A4實時熒光RT-PCR檢測的引物、探針及試劑盒。本發(fā)明在分析已報道的柯薩奇病毒A4VP1基因序列基礎上，分別設計引物及熒光探針，所述的引物由正向引物和反向引物組成，其核苷酸序列分別如SEQ ID No:l和SEQIDNo: 2 所示。本發(fā)明設計的探針的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，該探針一端標記有報告熒光基團，另一端標記有淬滅熒光基團。其中，報告熒光基團可以采用下列熒光基團中的任意一種FAM、HEX、TET、J0E、R0X和 CY5，淬滅熒光基團可以采用下列熒光基團中的任意一種TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2 和 BHQ3。根據TaqMan技術,在常規(guī)PCR的基礎上添加了一條標記有兩個突光基團的核苷酸探針，例如將報告熒光基團標記在探針的5’端，淬滅熒光基團標記在探針的3’端，兩者構成能量轉移結構，即報告熒光基團所發(fā)射的熒光可被淬滅熒光基團吸收，當二者距離變遠時，抑制作用減弱，報告熒光基團信號增強。在擴增反應過程中，探針同模板上的目的擴增片段雜交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在擴增延伸階段將探針切斷，淬滅熒光基團的抑制作用消失，報告熒光基團信號增強，從而實現對柯薩奇病毒A4核酸的實時檢測。本發(fā)明提供的試劑盒，包括上述正向弓丨物和反向引物。優(yōu)選地,試劑盒還包括上述探針。優(yōu)選地，試劑盒還包括實時熒光RT-PCR反應液，與所述正向引物、反向引物和探針共同構成實時熒光RT-PCR檢測體系，2 5 μ I所述實時熒光RT-PCR檢測體系的配置為2X0neSt印RT-PCR Buffer 12. 5 μ 1，10 μ M所述正向引物2 μ 1，10 μ M所述反向引物2 μ 1,10 μ M 所述探針 I μ I, 5U/μ I Ex Taq HS O. 5 μ 1,40U/ μ I PrimeScript RT enzymeMix O. 5 μ I, RNA5 μ I, RNase Free dH20 I. 5 μ I。優(yōu)選地，試劑盒的檢測反應條件為42°C反轉錄25min，95°C變性15s，以95°C 10s，53 °C Imin擴增45個循環(huán)。 當然，可以根據本發(fā)明給出的引物對或者其擴增產物序列設計其他類型的探針，以適用不同方法的熒光PCR檢測。本發(fā)明根據柯薩奇病毒A4VP1基因序列設計引物及熒光探針，該引物特異性強，用于熒光PCR檢測的靈敏度高。用本發(fā)明引物及探針，通過RT-PCR檢測，能夠快速簡單地判斷樣品是否有柯薩奇病毒A4,而且檢測準確性高、靈敏度高，因此能夠為柯薩奇病毒A4感染的相關疾病診斷提供科學依據。


圖I是實時熒光RT-PCR技術柯薩奇病毒A4核酸檢測的特異性實驗的檢測結果圖；圖2是本發(fā)明檢測方法的靈敏度實驗的檢測結果圖。
具體實施例方式下面實施例用于對本發(fā)明的進一步說明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例I :引物及探針的設計和合成比對并分析GenBank中分離自全球的柯薩奇病毒A4的同源VPl基因序列,利用生物軟件01igo7. O分別在其保守位點設計引物和Taqman探針,利用在線的OligoAnalyzer3. I分析其Hairpin, Self-Dimer和Δ G值,并通過NCBI數據庫的Blast程序進行特異性驗證。所設計的引物及探針序列為CVA4-F325 (正向引物)5’ -TGGGATATTGACATCATGGCGTT-3，；即 SEQ ID No: ICVA4-R469 (反向引物)5’ -GCACATACATGTATTGGATCACACT-3’ ；即 SEQ IDNo: 2CVA4-P367(探針)5，-FAM-CTTGAGGCATTCACATACATGCG-TAMRA-3，；即 SEQ ID No:3,該探針的5’端標記有報告熒光基團FAM，3’端標記有淬滅熒光基團TAMRA。實施例2 =RNA的提取以糞便樣品為例在抽提前加O. OlM PBS,PH7. 5，其中，O. 5g糞便樣品(O. 5ml液態(tài)糞便)加5mL PBS，振蕩混勻后將懸液1500 Xg離心20min，取上清液進行RNA抽提。病毒樣品RNA的抽提使用High Pure Viral RNA Kit (Roche, Germany),步驟按其操作說明書進行，具體的操作步驟如下I)向200 μ I的上清液中加入400 μ I的Binging Buffer,混勻后將混合液轉入裝有過濾管的收集管，8000 Xg離心15s ；2)將過濾管置于新的收集管中，向濾管中加500 μ I Inhibitor Removal Buffer,8000 X g 離心 Imin ；3)將過濾管置于新的收集管中，向濾管中加450 μ I Wash Buffer，8000X g離心Imin ；4)將過濾管置于新的收集管中，再一次向濾管中加450 μ I Wash Buffer, 8000X g離心Imin ；5)將過濾管置于新的收集管中，9300 Xg離心15s ；·
6)將過濾管置于新的離心管中，向離心管中加入50μ I的Elution Buffer,8000 X g離心Imin從而得到純凈的病毒RNA，提取的RNA于_80°C保存。實施例3 :Real-timeRT-PCR擴增方法的建立I、實時熒光RT-PCR反應體系以RNA為摸板，進行實時RT-PCR反應(反應用試劑購自TaKaRa)。熒光定量RT-PCR反應體系如下表
_m>_25μ1體積終濃度
2><One Step RT-PCR Buffer12,5μ1
Η向弓I物和反財I物(IO μΜ)各2μ1各0.8μΜ
探針(10μΜ>Ιμ 0.4 μΜ
Ex Taq HS(5 U/μΙ)0.5μ12.5U
PrimeScript RT enzyme Mix(40U/pl)0.5μ120 U
RNA5μΙ
RNase Free dHaO1.5μ12、實時熒光RT-PCR反應條件將樣品管放入ABI公司7500突光PCR儀后，設置如下條件進行反應42°C反轉錄25min，95°C變性15s (因不同廠家的Tap酶而不同)，以95°C 10s，53。。Imin (收集熒光信號FAM)擴增45個循環(huán)。每個循環(huán)結束采集數據。反應結束后根據擴增曲線判定結果。實施例4 :柯薩奇病毒A4核酸Real-time RT-PCR方法的特異性確定選取3株已確定型別的CVA4毒株和9株其他腸道病毒血清型(HEV71、coxsackievirusA16> coxsackievirus A6、 coxsackievirus A10、 coxsackievirus A8、coxsackievirus A5> coxsackievirus A2> coxsackievirus BI 和 coxsackievirus B3),利用建立起的熒光RT-PCR反應體系對這13株毒株進行檢測，檢測結果如圖I所示，3株CVA4 病毒(編號為 CVA4-JB141110102，CVA4-JB141110149 和 CVA4-JB141230059)出現相應的特異性熒光擴增曲線，呈陽性反應，而其他9株人類腸道病毒則均沒有熒光信號產生，在圖I中顯示為一平直的線，判為陰性。結果表明，所設計的引物探針只對目的病毒(即，CVA4)特異，與其它檢測對象無交叉反應。試驗結果以柯薩奇病毒A4的RNA為模板，通過實時熒光RT-PCR檢測可觀察到明顯的熒光強度變化，而其他病毒的熒光強度沒有變化。實施例5 :靈敏度實驗
將柯薩奇病毒A4體外轉錄RNA用DEPC處理的水分別稀釋，進行相對靈敏度檢測，在25 μ I反應體系中，1 應分別被稀釋成5.0\104、5.0\103、5.0\102、5.0\101拷貝數，檢測結果如圖2所示，可以看出，檢測限度低至為50個模板拷貝數。
權利要求
1.一種柯薩奇病毒A4核酸檢測用引物，由正向引物和反向引物組成，其核苷酸序列分別如 SEQ ID No: I 和 SEQ ID No:2 所示。
2.一種與權利要求I所述引物配合使用的探針，其核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，該探針一端標記有報告熒光基團，另一端標記有淬滅熒光基團。
3.如權利要求2所述的探針，其特征在于該探針5’端標記有FAM熒光基團，3’端標記有TAMRA熒光基團。
4.含有權利要求I所述正向引物和反向引物的試劑盒。
5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于還包括權利要求2或3所述的探針。
6.如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，還包括實時熒光RT-PCR反應液，與所述正向引物、反向引物和探針共同構成實時熒光RT-PCR檢測體系，25 所述實時熒光RT-PCR檢測體系的配置為2 X One Step RT-PCR Buffer 12. 5 yl，10 y M所述正向引物 l，10iiM 所述反向引物 l，10iiM 所述探針 Iii l，5U/ii I Ex Taq HS 0. 5 U 1,40U/U IPrimeScript RT enzyme Mix 0. 5 u I, RNA 5 u I, RNase Free dH20 L I。
7.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的檢測反應條件為42°C反轉錄 25min，95°C變性 15s，以 95°C 10s，53°C Imin 擴增 45 個循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種柯薩奇病毒A4核酸檢測用引物、探針及試劑盒，所述引物包括正向引物和反向引物，其核苷酸序列分別如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示，所述探針的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示。所述試劑盒包括所述正向引物和反向引物。本發(fā)明所設計的引物特異性好，靈敏度高，用本發(fā)明引物及探針，通過RT-PCR檢測，能夠快速簡單地判斷樣品是否有柯薩奇病毒A4，而且檢測準確性高、靈敏度高。
文檔編號C12Q1/68GK102816869SQ201210319288
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月31日 優(yōu)先權日2012年8月31日
發(fā)明者何雅青, 陳龍 申請人:何雅青, 陳龍