專利名稱：人類腸道病毒四色熒光rt-pcr檢測試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中的熒光PCR試劑盒，尤其是涉及用于人類腸道病毒通用檢測及腸道病毒EV71型、CoxA16型分型檢測的包含內(nèi)対照的四色熒光RT-PCR檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
腸道病毒包括脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒(Coxsackievirus)、致腸細(xì)胞病變?nèi)斯聝翰№f(enterocytopathic human orphan virus ECHO簡稱埃可病韋)及新型腸道病韋共71個(gè)血清型。而由腸道病毒引起的手足ロ病是ー類急性傳染病，臨床表現(xiàn)以發(fā)熱和手、
足、口腔等部位的皮疹為主要臨床特征，本病急性起病，發(fā)熱，口腔粘膜出現(xiàn)散在皰疹，手、足和臀部出現(xiàn)斑丘疹、皰疹，多發(fā)生于學(xué)齡前兒童，尤以3歲以下年齡組發(fā)病率最高。本類疾病分布于世界各地，在熱帶和亞熱帶全年都有。引起手足ロ病的主要為小核糖核酸病毒科(Picornaviriade)腸道病毒屬的柯薩奇病毒(Coxsackie virus)A組的4型、5型、7型、9型等；柯薩奇病毒B組的2型、5型；部分埃可病毒(ECHO-viruses)和腸道病毒71型。最常見為柯薩奇病毒A組16型(CoxA16)及腸道病毒71型(EV71)，二者在遺傳學(xué)上密切相關(guān)，常為混合感染和交替感染。我國手足ロ病流行，其病原主要為EV71型和CoxA16型。通常情況下，EV71與CoxA16引起的手足ロ在臨床癥狀上難以區(qū)別。腸道病毒感染的特異性診斷方法有三種，即病毒分離鑒定、血清學(xué)檢測和分子生物學(xué)技木。病毒的分離培養(yǎng)和血清學(xué)方法，繁雜費(fèi)吋，無法滿足病毒流行期間同時(shí)處理大量樣本的需要。分子生物學(xué)特別是PCR技術(shù)，由于其檢測材料用量少、快速、靈敏度高且具有很高的特異性，在病毒感染的診斷中發(fā)揮越來越重要的作用。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)是先將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后利用DNA聚合酶在體外快速擴(kuò)增目的DNA片段的技術(shù)。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)在普通RT-PCR的基礎(chǔ)上，在擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入ー對或多對特異性PCR引物同時(shí)加入相對應(yīng)的特異性熒光探針，該探針為兩端分別標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸。在探針完整的時(shí)候，報(bào)告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測不到信號。而在PCR擴(kuò)增吋，探針同模板上目的擴(kuò)增片段雜交，由于DNA聚合酶具有5'端到3'端的外切酶活性將探針切斷，報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號。所以，每經(jīng)過ー個(gè)PCR循環(huán)，熒光信號也和目的片段一祥，有ー個(gè)同步指數(shù)增長的過程。中國專利名稱為腸道病毒71型核酸檢測試劑盒及檢測方法(申請?zhí)?01010105088. 5)公開了ー種腸道病毒71型核酸檢測試劑盒，包括PCR反應(yīng)酶、PCR反應(yīng)液及腸道病毒71型正向引物和反向引物及特異性的熒光探針；中國專利名稱為腸道病毒CoxA16核酸熒光定量RT-PCR檢測試劑盒(申請?zhí)?00810121454. 9)公開了ー種腸道病毒柯薩奇A16檢測試劑盒的上下游引物和特異性探針；中國專利名稱為腸道病毒核酸熒光定量RT-PCR檢測試劑盒(申請?zhí)?00810121453. 4)公開了ー種腸道病毒的上下游引物和特異性探針。上述檢測試劑盒用于檢測相應(yīng)的腸道病毒具有特異、靈敏、快速、操作簡便的優(yōu)點(diǎn)，但是上述試劑盒都無法在同一反應(yīng)管中實(shí)現(xiàn)腸道病毒的通用檢測以及腸道病毒EV71型、CoxAie型的分型檢測，同時(shí)大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，在糞便、直腸拭子、咽喉拭子樣本中，PCR抑制物存在的比例為I. 8% 3. 4%，表明內(nèi)對照對監(jiān)控PCR抑制物的存在具有重要作用，而目前現(xiàn)有手足ロ病的體外診斷試劑盒都沒有內(nèi)對照而且存在特異性和靈敏度較低，檢測步驟繁瑣等缺陷，需要進(jìn)ー步提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能夠同時(shí)在同一反應(yīng)管中實(shí)現(xiàn)人類腸道病毒的通用檢測及EV71亞型、CoxAie亞型分型快速檢測的特異性強(qiáng)、靈敏度高、可靠性強(qiáng)、無假陰性結(jié)果的人類腸道病毒四色熒光RT-PCR檢測試劑盒及檢測方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為
I、腸道病毒四色熒光RT-PCR試劑盒(簡稱試劑盒)，本試劑盒是在對人類腸道病毒核酸 序列分析的基礎(chǔ)上，通過生物信息學(xué)方法分析選取保守基因序列設(shè)計(jì)出特異性引物，利用熒光PCR技術(shù)對腸道病毒進(jìn)行檢測。在按下述方法設(shè)計(jì)的引物、探針存在下，在熒光PCR儀中對病毒核酸進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，來實(shí)現(xiàn)對腸道病毒的檢測。具體的說，本試劑盒包括多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)母液、陽性對照品、陰性對照品、內(nèi)對照、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq聚合酶，其中多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)母液含有多重10X熒光RT-PCR反應(yīng)緩沖液、EV通用型引物、EV通用型探針、EV71型引物、EV71型探針、CoxA16型引物、CoxA16型探針、內(nèi)對照引物、內(nèi)對照探針、牛血清白蛋白；多重IOX熒光RT-PCR反應(yīng)緩沖液含有三羥甲基氨基甲烷鹽酸、氯化鉀、甘油、四種單核苷酸單體、氯化鎂，其中各引物及探針的序列如下，
依據(jù)腸道病毒EV71型VPl基因保守序列設(shè)計(jì)引物、探針
EWlPf 上游引物5' -0GCAAATGCGTAGAAAGGT-3'19bp ；
EWlPr 下游引物:5' -GGAGCAATTGTGGGACAACT-3'20bp ；
EV71Pb 探針5' -FAM-AGCTATTCACCTACATGCGCTTTGATGC-BHQ1-3'28bp ；
依據(jù)腸道病毒CoxAie型VPl基因保守序列設(shè)計(jì)引物、探針
CoxA16Pf 上游弓丨物:5' -GAACCATCACTCCACACAGGAG-3'22bp ；
CoxA16Pr 下游引物:5' -GTACCTGTGGTGGGCATTG-3'19bp ；
CoxA16Pb 探針5' -HEX-CAGCCATTGGGAATTTCTTTAGCCGTG-BHQ1-3'27bp ；
依據(jù)腸道病毒EV基因5'非翻譯區(qū)設(shè)計(jì)通用引物、探針
EVPf 上游弓丨物:5' HimMTGOGGCrMTOC-3'19bp ；
EVPr 下游弓丨物:5' -GATTGTCA0CATMGCAGCCA-3'21bp ；
EVPb 探針5, -ROX-MCCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTC-BHQト3'28bp ；
內(nèi)對照序列為
5 ' -GTGCTCACAC CAGTTGCCGC GGAAAGTATG TGGAATGTTA ACACACCCACACCACACCCACACACGTGTT GGATCAATTT CGAGATGCGA GCTGCCAAGC-3 'IOObp ；
依據(jù)內(nèi)對照序列設(shè)計(jì)內(nèi)對照引物、探針I(yè)CPf 上游弓丨物:5' ^TGCTCACA(XAGTTGC0GC-3'20bp ；
ICPr 下游弓丨物:5' "GCTTGGCAGCTOGCATCTOHB'20bp ；
mMfB2p,所述的陽性對照品為連接有設(shè)計(jì)腸道病毒通用型、EV71型、CoxAie型的引物、探針的基因保守序列的pUCm-T克隆載體。所述的陰性對照品為無RNA酶的DEPC水。所述的內(nèi)對照為連接有內(nèi)對照人工設(shè)計(jì)序列的pUCm-T克隆載體，所述的內(nèi)對照的濃度為 104copies/ml。所述的多重10 X PCR反應(yīng)緩沖液組成為三羥甲基氨基甲烷鹽酸終濃度為100禮、 氯化鉀終濃度為500mM、甘油體積比為50%、四種單核苷酸單體(dATP、dGTP、dUTP、dCTP)終濃度為0. 4mM，氯化鎂終濃度為3mM及相應(yīng)體積的超純水。所述的多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)母液配制多重10 X PCR反應(yīng)緩沖液5ul ;濃度20mg/ml的牛血清白蛋白Iul ;濃度均為IOOiiM的引物EVPf、EVPr、EV71Pf和EV71Pr各0. 4ul ;濃度均為 IOOii M 的引物 CoxA16Pf 和 CoxA16Pr 各 0. 5ul ;濃度均為 50 y M 探針 EVPb、EV71Pb和CoxA16Pb各0. 3ul ;濃度均為100 u M的引物ICPf和ICPr各0. 2ul ;濃度為50 u M的探針I(yè)CPb 0. Iul ;無RNA酶DEPC水31. lul，混合后于冰箱_20°C保存。2、人類腸道病毒四色熒光RT-PCR檢測方法
(1)樣品處理
采集疑似病人咽拭子、皰疹液、腦脊液或人類腸道病毒分離培養(yǎng)物，迅速放入裝有l(wèi)-2ml的病毒保存液的商品化采樣管(友康基業(yè)，MT0301-1)中作為待測樣品使用；
(2)病毒核酸RNA的提取
嚴(yán)格按照商品化核酸RNA提取試劑盒QIAGEN Viral RNA Mini ExtractionKit(QIAGEN, CAT:52904)操作，從臨床標(biāo)本或病毒分離培養(yǎng)物中提取病毒RNA ;每份樣品均加入IOul的濃度為104copies/ml的內(nèi)對照同步參與核酸樣品的提??；
(3)多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)液配制
取IOul提取的樣品核酸、IOul陽性對照品和IOul陰性對照品分別加入40ul多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)液至相應(yīng)的PCR管中進(jìn)行多重?zé)晒釸T-PCR擴(kuò)增，其中多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)液配制如下多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)母液39ul ;濃度5U/ul的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶0. 4ul ;濃度5U/ul 的 Taq DNA 聚合酶 0. 6ul ；
(4)四色熒光RT-PCR擴(kuò)增檢測
在四色熒光定量PCR儀上進(jìn)行，探針檢測模式設(shè)置為FAM通道用于檢測EV71型、HEX通道用于檢測CoxAie型、ROX通道用于檢測EV通用型及CY5通道用于檢測內(nèi)對照，反應(yīng)條件50°C 30分鐘I個(gè)循環(huán)；95°C 3分鐘I個(gè)循環(huán)；95°C 5秒，55°C 40秒，循環(huán)40次；設(shè)置完成后，保存文件，運(yùn)行程序；
(4)檢測結(jié)果分析
內(nèi)對照擴(kuò)增曲線正常，按以下規(guī)則判斷結(jié)果
出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線，Ct值小于37為陽性結(jié)果；有擴(kuò)增曲線但不呈S形且閾值超過40或者沒有出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線為陰性結(jié)果；出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線，但Ct值大于37，小于40為可疑結(jié)果，對可疑結(jié)果，應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，如果重復(fù)實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線，陰性對照沒有污染，可判斷為陽性。所述的多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)母液配制多重10 X PCR反應(yīng)緩沖液5ul ;濃度20mg/ml的牛血清白蛋白Iul ;濃度均為IOOiiM的引物EVPf、EVPr、EV71Pf和EV71Pr各0. 4ul ;濃度均為 IOOii M 的引物 CoxA16Pf 和 CoxA16Pr 各 0. 5ul ;濃度均為 50 y M 探針 EVPb、EV71Pb和CoxA16Pb各0. 3ul ;濃度均為100 u M的引物ICPf和ICPr各0. 2ul ;濃度為50 u M的探針I(yè)CPb 0. Iul ；RNA酶DEPC水31. lul，混合后于冰箱_20°C保存。所述的多重10 X PCR反應(yīng)緩沖液組成為三羥甲基氨基甲烷鹽酸終濃度為100禮、氯化鉀終濃度為500mM、甘油體積比為50%、四種單核苷酸單體(dATP、dGTP、dUTP、dGTP)終濃度為0. 4mM，氯化鎂終濃度為3mM及相應(yīng)體積的超純水。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明人類腸道病毒四色熒光PCR檢測試劑盒及檢測方法，由于該試劑盒引入了針對腸道病毒EV71型、柯薩奇病毒A組16型及腸道病毒通用型核酸序列所設(shè)計(jì)的特異性擴(kuò)增引物和四色熒光探針，可以同時(shí)對腸道病毒通用檢
測以及腸道病毒71型及柯薩奇病毒A組16型進(jìn)行分型檢測，從而實(shí)現(xiàn)了一個(gè)標(biāo)本中同時(shí)檢測三種病毒的目的，既節(jié)約了生產(chǎn)成本和檢測成本，又提高了檢測效率及縮短了時(shí)間，一般來說，從處理樣本到結(jié)果的判斷僅需要2小時(shí)左右；而且更重要的是引入了內(nèi)對照，能夠有效地監(jiān)控樣本中的抑制物，還能避免了操作誤差及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染所造成的假陰性，使得檢測具有更好的靈敏度和特異性，從而避免了其他檢測方法特異性不高的問題。綜上所述，本發(fā)明ー種用于快速實(shí)時(shí)定量檢測人類腸道病毒的四色熒光PCR檢測試劑盒，病毒的檢測敏感性高，特異性好，降低了常規(guī)PCR擴(kuò)增的假陽性率，還能夠有效解決常規(guī)PCR的易污染問題；具有非競爭性內(nèi)對照體系，可靠性強(qiáng)，無假陰性結(jié)果，可實(shí)現(xiàn)對腸道病毒EV71型、CoxAie型及腸道病毒通用型同時(shí)快速、準(zhǔn)確及特異檢測。


圖I為本發(fā)明人類腸道病毒四色熒光RT-PCR擴(kuò)增圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)ー步詳細(xì)描述。具體實(shí)施例一
腸道病毒四色熒光RT-PCR試劑盒
I、RT-PCR試劑盒組成
本試劑盒包括多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)母液、陽性對照品、陰性對照品、內(nèi)對照、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq聚合酶。其中多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)母液含有多重IOX熒光RT-PCR反應(yīng)緩沖液、EV通用型引物、EV通用性探針、EV71型引物、EV71型探針、CoxA16型引物、CoxA16型探針、內(nèi)對照引物、內(nèi)對照探針、牛血清白蛋白；多重IOX熒光RT-PCR反應(yīng)緩沖液含有三羥甲基氨基甲烷鹽酸、氯化鉀、甘油、四種單核苷酸單體、氯化鎂。其中多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)母液配制如下(括號內(nèi)所示為相應(yīng)的物質(zhì)濃度)
多重IOXPCR反應(yīng)緩沖液5ul
牛血清白蛋白(20mg/ml)Iul
EVPf 和 EVPr (IOOuM)各 0. 4ulEV71Pf 和 EV71r (IOOuM)各 0. 4ul
CoxA16Pf 和 CoxA16Pr (100 ii M)各 0. 5ul
EVPb、EV71Pb 和 CoxA16Pb (50uM) 各 0. 3ul ICPf 和 ICPr (100 uM)各 0. 2ul
ICPb (50u M)0. Iul
無 RNA 酶 DEPC 水31. Iul
配制混合后于冰箱_20°C保存。其中多重10XPCR反應(yīng)緩沖液組成為三羥甲基氨基甲烷鹽酸終濃度為100禮、氯化鉀終濃度為500mM、甘油體積比為50% (甘油的體積為多重10XPCR反應(yīng)緩沖液體積的 50%)、四種單核苷酸單體(dATP、dGTP、dUTP、dGTP)終濃度為0. 4mM，氯化鎂終濃度為3mM及相應(yīng)體積的超純水。陰性對照品為無RNA酶的DEPC水，陽性對照品為含有腸道病毒通用型、EV71型、CoxA16型的引物、探針的基因保守序列的pUCm-T克隆載體質(zhì)粒；內(nèi)對照為連接有內(nèi)對照人エ設(shè)計(jì)序列的PUCm-T克隆載體，內(nèi)對照濃度為104COpieS/ml。本發(fā)明試劑盒保存于_20°C，盡量減少反復(fù)凍融。2、引物、探針設(shè)計(jì)與合成
從GenBank下載所有腸道病毒EV71型、柯薩奇病毒A組16型及腸道病毒其它各亞型病毒的基因序列，經(jīng)過生物信息學(xué)分析反復(fù)比對，選擇如下區(qū)域作為擴(kuò)增腸道病毒EV71型、柯薩奇病毒A組16型及腸道病毒通用型的特異性目標(biāo)區(qū)域,應(yīng)用Primer Premier及Oligo等軟件設(shè)計(jì)并篩選EV通用引物、EV通用熒光探針、EV71型引物、EV71型探針、CoxA16型弓I物、CoxAie型探針、內(nèi)對照引物及內(nèi)對照探針，內(nèi)對照序列采用Perl軟件設(shè)計(jì)
腸道病毒EV71型引物、探針
上游弓 I物 EWlPf 5' -0GCAMTGCGTAGAMGGT-3'19bp ；
下游弓 I物 EWlRr 5' -GGAGCMTTGTGGGACMCT-3'20bp ；
探針 EV71Pb:5' -FAM-AGCTATTCACCTACATGCGCTTTGATGC-BHQ1-3'28bp
腸道病毒CoxAie型引物、探針
上游弓 I物 CoxA16Pf :5' -GAACCATCACTCCACACAGGAG-3'22bp ；
下游引物 CoxA16Pr :5' -GTACCTGTGGTGGGCATTG-3'19bp
探針 CoxA16Pb :5' -HEX-CAGCCATTGGGAATTTCTTTAGCCGTG-BHQ1-3'27bp
腸道病毒通用型引物、探針
上游弓 I物 EVPf 5' HirroMTGCGGCTMTOC-3'19bp
下游弓 I物 EVPr 5' -GATTGTCA0CATMGCAGCCA-3'21bp
探針 EVPb 5' -ROX-AACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTC-BHQI-3'28bp
內(nèi)對照序列
5' -GTGCTCACAC CAGTTGCCGC GGAAAGTATG TGGAATGTTA ACACACCCAC ACCACACCCACACACGTGTT GGATCAATTT CGAGATGCGA GCTGCCAAGC-3'IOObp
內(nèi)對照引物、探針
ICPf :5' -GTGCTCACACCAGTTGC0GC-3'20bp
ICPr :5, "GCTTGGCAGCTOGCATCTOHB,20bpICPb :5' -CY5-ATTGTGTGGGTGTGGTGTGGGTGTGTGC-BHQ2-3'28bp。上述腸道病毒EV71型突光探針5'端標(biāo)記FAM突光報(bào)告基團(tuán),腸道病毒CoxA16型熒光探針5'端標(biāo)記HEX熒光報(bào)告基團(tuán)，腸道病毒通用型熒光探針5'端標(biāo)記JOE熒光報(bào)告基團(tuán)，內(nèi)標(biāo)熒光探針5'端標(biāo)記CY5熒光報(bào)告基團(tuán)，腸道病毒EV71型熒光探針3'端、腸道病毒CoxAie型熒光探針3'端和腸道病毒通用型熒光探針3'端分別標(biāo)記BHQl熒光淬滅基團(tuán)，內(nèi)對照熒光探針3'端標(biāo)記BHQ2熒光淬滅基團(tuán)。具體實(shí)施例ニ
人類腸道病毒四色熒光RT-PCR檢測方法，毎次檢測均應(yīng)設(shè)立陽性對照及陰性對照
1、樣品處理
采集疑似病人咽拭子、皰疹液、腦脊液或人類腸道病毒分離培養(yǎng)物，迅速放入裝有
l-2ml的病毒保存液的商品化采樣管(友康基業(yè)，MT0301-1)中作為待測樣品使用；
2、病毒核酸RNA的提取
嚴(yán)格按照商品化核酸RNA提取試劑盒QIAGEN Viral RNA Mini ExtractionKit(QIAGEN, CAT:52904)操作，從臨床標(biāo)本或病毒分離培養(yǎng)物中提取病毒RNA ;每份樣品均加入IOul內(nèi)對照(濃度為104copies/ml)同步參與核酸樣品的提取；
3、RT-PCR反應(yīng)體系配制
取IOul提取的樣品核酸、IOul陽性對照品和IOul陰性對照品分別加入40ul多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)液至相應(yīng)的PCR管中進(jìn)行多重?zé)晒釸T-PCR擴(kuò)增，其中多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)液配制如下多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)母液39ul ;濃度5U/ul的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶0. 4ul ;濃度5U/ul 的 Taq DNA 聚合酶 0. 6ul ；
其中多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)母液配制多重10XPCR反應(yīng)緩沖液5ul ;濃度20mg/ml的牛血清白蛋白Iul ;濃度均為IOOiiM的引物EVPf、EVPr、EV71Pf和EV71Pr各0. 4ul ;濃度均為 100 u M 的引物 CoxA16Pf 和 CoxA16Pr 各 0. 5ul ;濃度均為 50 ii M 探針 EVPb、EV71Pb 和CoxA16Pb各0. 3ul ;濃度均為100 u M的引物ICPf和ICPr各0. 2ul ;濃度為50 u M的探針I(yè)CPb 0. Iul ；RNA酶DEPC水31. lul，混合后于冰箱_20°C保存；
其中多重10XPCR反應(yīng)緩沖液組成為三羥甲基氨基甲烷鹽酸終濃度為100禮、氯化鉀終濃度為500mM、甘油體積比為50%、四種單核苷酸單體(dATP、dGTP、dUTP、dGTP)終濃度為
0.4mM,氯化鎂終濃度為3mM及相應(yīng)體積的超純水；
4、四色熒光RT-PCR擴(kuò)增檢測
在四色熒光定量PCR儀上進(jìn)行，探針檢測模式設(shè)置為FAM通道用于檢測EV71型、HEX通道用于檢測CoxAie型、ROX通道用于檢測EV通用型及CY5通道用于檢測內(nèi)對照，反應(yīng)條件50°C 30分鐘I個(gè)循環(huán)；95°C 3分鐘I個(gè)循環(huán)；95°C 5秒，55°C 40秒，循環(huán)40次；設(shè)置完成后，保存文件，運(yùn)行程序；
5、檢測結(jié)果分析
內(nèi)對照擴(kuò)增曲線正常，按以下規(guī)則判斷結(jié)果
出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線，Ct值小于37為陽性結(jié)果；沒有出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線或者有擴(kuò)增曲線但不呈S形且閾值超過40為陰性結(jié)果；出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線，但Ct值大于37，小于40為可疑結(jié)果，對可疑結(jié)果，應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，如果重復(fù)實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線，陰性對照沒有污染，可判斷為陽性。
具體型別鑒定按照下表進(jìn)行表I檢測結(jié)果判斷
權(quán)利要求
1.一種人類腸道病毒四色熒光RT-PCR檢測試劑盒，包括多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)母液、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶液、Taq DNA聚合酶液、陽性對照品、陰性對照品，其特征在于還包括內(nèi)對照、所述的多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)母液包括多重IOXPCR反應(yīng)緩沖液、牛血清白蛋白及各上、下游引物及各特異性探針，其中所述的各上、下游引物序列、所述的特異性探針序列以及內(nèi)對照序列如下腸道病毒 EV71 型上游弓 I 物 EV7 IPf 如 SEQ ID NO. I 所示，5' -CGCAMTGCGTAGAMGGT-3'；腸道病毒 EV71 型下游弓丨物 EV71Pr 如 SEQ ID NO. 2 所示，5' -GGAGCAATTGTGGGACAACT-3'； 腸道病毒EV71型熒光探針EV71Pb如SEQ ID NO. 3所示，5' -FAM-AGCTATTCACCTACATGCGCTTTGATGC-BHQ1 -3/ ；腸道病毒 CoxA16 型上游弓丨物 CbxA16Pf 如 SEQ ID NO. 4 所示，5' _ GMOCATCACTOCACACAGGAG-3'；腸道病毒 CoxA16 型下游弓丨物 CoxA16Pr 如 SEQ ID NO. 5 所示，5' - GTACCTGTGGTGGGCATTG-3'；腸道病毒CoxA16型熒光探針CoxA16Pb如SEQ ID NO. 6所示，5' -HEX- CAGCCATTGGGAATTTCTTTAGCCGTG-BHQI- 3'； 腸道病毒通用型上游引物EVPf如SEQ ID NO. 7所示，5 ^ -CCCTGAATGCGGCTAATCC-3;； 腸道病毒通用型下游引物EVPr如SEQ ID NO. 8所示，5' -GATTGTCACCATMGCAGCCA-3'； 腸道病毒通用型熒光探針VPb如SEQ ID NO. 9所示，5' -ROX-AACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTC-BHQI- 3'； 內(nèi)對照序列如SEQ ID NO. 10所示 5' ■GKDmomiEEMMGMmAMIDCAIMMOmM' ΟΜΜΥ SKMSK Ο 3Μ￡-3'； 內(nèi)對照上游引物 ICPf 如 SEQ ID NO. 11 所示，5' - GATTAGTATGTCGGCTGCAGGTA -3'； 內(nèi)對照下游引物 ICPr 如 SEQ ID NO. 12 所示，5' - CAAGGCTCATAGCGCGTATC -3'；內(nèi)對照熒光探針 CPb 如 SEQ ID NO. 13 所示，5' -CY5- COGGTACATCOGAOGGAGCGTC - BHQ2-3'。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的人類腸道病毒四色熒光RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于所述的多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)母液配制如下多重IOXPCR反應(yīng)緩沖液5ul ;濃度20mg/ml的牛血清白蛋白Iul ;濃度均為100 μ M的引物EVPf、EVPr、EV71Pf和EV71Pr各O. 4ul ;濃度均為100 μ M的引物CoxA16Pf和CoxA16Pr各O. 5ul ;濃度均為50 μ M探針EVPb、EV71Pb和CoxA16Pb各O. 3ul ;濃度均為100 μ M的引物ICPf和ICPr各O. 2ul ;濃度為50 μ M的探針I(yè)CPb O. Iul ；RNA酶DEPC水31. lul，混合后于冰箱_20°C保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人類腸道病毒四色熒光RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于所述的多重10 X PCR反應(yīng)緩沖液組成為三羥甲基氨基甲烷鹽酸終濃度為100禮、氯化鉀終濃度為500mM、甘油體積比為50%、四種單核苷酸單體終濃度為O. 4mM，氯化鎂終濃度為3mM及相應(yīng)體積的超純水。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的人類腸道病毒四色熒光RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于所述的陽性對照品為連接有設(shè)計(jì)腸道病毒通用型、EV71型、CoxAie型的引物、探針的基因保守序列的PUCm-T克隆載體；所述的陰性對照品為無RNA酶的DEPC水，所述的內(nèi)對照為連接有內(nèi)對照人工設(shè)計(jì)序列的pUCm-T克隆載體,所述的內(nèi)對照的濃度為104copies/ml。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求I所述的人類腸道病毒四色熒光RT-PCR的檢測方法，其特征在于包括以下步驟 (I)樣品處理采集疑似病人咽拭子、皰疹液、腦脊液或人類腸道病毒分離培養(yǎng)物，迅速放入裝有l(wèi)-2ml的病毒保存液的采樣管中作為待測樣品使用； (2)病毒核酸RNA的提取 嚴(yán)格按照商品化核酸RNA提取試劑盒QIAGEN Viral RNA Mini Extraction Kit操作，從臨床標(biāo)本或病毒分離培養(yǎng)物中提取病毒RNA ;每份樣品均加入IOul的濃度為IO4Copies/ml的內(nèi)對照同步參與樣品核酸的提取； (3)四色熒光RT-PCR擴(kuò)增檢測 取IOul提取的樣品核酸、IOul陽性對照品和IOul陰性對照品分別加入40ul多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)液至相應(yīng)的PCR管中進(jìn)行多重?zé)晒釸T-PCR擴(kuò)增，四色熒光RT-PCR反應(yīng)程序在四色熒光定量PCR儀上進(jìn)行，探針檢測模式設(shè)置FAM通道用于檢測EV71型、HEX通道用于檢測CoxA16型、ROX通道用于檢測EV通用型及CY5通道用于檢測內(nèi)對照，反應(yīng)條件50°C30分鐘I個(gè)循環(huán)；95°C 3分鐘I個(gè)循環(huán)；95°C 5秒，55°C 40秒，循環(huán)40次；其中RT-PCR反應(yīng)液的配制如下多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)母液39ul、濃度為5U/ul的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶O. 4ul、濃度為5U/ul的Taq DNA聚合酶O. 6ul、RNA核酸樣品IOul ； (4)檢測結(jié)果分析 內(nèi)對照擴(kuò)增曲線正常，按以下規(guī)則判斷結(jié)果出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線，Ct值小于37為陽性結(jié)果；有擴(kuò)增曲線但不呈S形且閾值超過40或者沒有出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線為陰性結(jié)果；出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線，但Ct值大于37，小于40為可疑結(jié)果，對可疑結(jié)果，應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，如果重復(fù)實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線，陰性對照沒有污染，可判斷為陽性。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的人類腸道病毒四色熒光RT-PCR的檢測方法，其特征在于所述的多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)母液配制如下多重10XPCR反應(yīng)緩沖液5ul ;濃度20mg/ml的牛血清白蛋白Iul ;濃度均為100 μ M的引物EVPf、EVPr、EV71Pf和EV71Pr各O. 4ul ;濃度均為100 μ M的引物CoxA16Pf和CoxA16Pr各O. 5ul ;濃度均為50 μ M探針EVPb、EV71Pb和CoxA16Pb各O. 3ul ;濃度均為100 μ M的引物ICPf和ICPr各O. 2ul ;濃度為50 μ M的探針I(yè)CPb O. Iul ；RNA酶DEPC水31. lul，混合后于冰箱_20°C保存。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的人類腸道病毒四色熒光RT-PCR的檢測方法，其特征在于 腸道病毒EV71型上游引物如SEQ ID NO. 1，其下游引物如SEQ ID NO. 2所示， 腸道病毒EV71型熒光探針如SEQ ID NO. 3所示； 腸道病毒CoxA16型上游引物如SEQ ID NO. 4，其下游引物如SEQ ID NO. 5所示， 腸道病毒CoxA16型熒光探針如SEQ ID NO. 6所示； 腸道病毒通用型上游引物如SEQ ID NO. 7所示，其下游引物如SEQ ID NO. 8所示， 腸道病毒通用型熒光探針如SEQ ID NO. 9所示；內(nèi)對照序列如SEQ ID NO. 10所示， 內(nèi)對照上游引物如SEQ ID NO. 11所示，其下游引物如SEQ ID NO. 12所示， 內(nèi)對照熒光探針如SEQ ID NO. 13所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的人類腸道病毒四色熒光RT-PCR檢測方法，其特征在于所述的多重10XPCR反應(yīng)緩沖液組成為三羥甲基氨基甲烷鹽酸終濃度為100禮、氯化鉀終濃度為500mM、甘油體積比為50%、四種單核苷酸單體終濃度為O. 4mM，氯化鎂終濃度為3mM及相應(yīng)體積的超純水。
全文摘要
本發(fā)明公開了人類腸道病毒的四色熒光PCR檢測試劑盒及其檢測方法，該試劑盒包括多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)母液、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶液、TaqDNA聚合酶液、陽性對照品、陰性對照品，特點(diǎn)是還包括內(nèi)對照、多重10×PCR反應(yīng)緩沖液、濃度為20mg/ml的牛血清白蛋白及濃度均為100μM的各上、下游引物及濃度均為50μM的各特異性探針，其中各上、下游引物、特異性探針序列以及內(nèi)對照序列如SEQIDNO.1、NO.2、NO.3、NO.4、NO.5、NO.6、NO.7、NO.8、NO.9、NO.10、NO.11、NO.12及NO.13所示，優(yōu)點(diǎn)是檢測敏感性高，特異性好、準(zhǔn)確快速、無假陽性。
文檔編號C12R1/93GK102851391SQ201210251520
公開日2013年1月2日 申請日期2012年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月20日
發(fā)明者孫大為, 周冬根, 倪敏君, 岑晨霞, 陳麗, 翟敏, 曹雪春 申請人:寧波檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院