專利名稱：動(dòng)物疫病三色熒光rt-pcr檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中的熒光PCR試劑盒，尤其是涉及用于禽流感、新城疫病毒野毒及禽傳染性支氣管炎病毒野毒的三色熒光RT-PCR檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
禽流感與新城疫同屬國際獸醫(yī)局指定的A類烈性禽類傳染病，具有傳播快、發(fā)病急、死亡率高的特征，在國家動(dòng)物防疫法上同被列為ー類動(dòng)物疫病。禽傳染性支氣管炎是由ー種冠狀病毒引起的僅發(fā)生于禽的急性、高度接觸性呼吸道疾病。禽流感(記為AIV)、新城疫(記為NDV)及禽傳染性支氣管炎(記為AIBV)的癥狀相似、病理進(jìn)程難以區(qū)分，而社會(huì)危害相差懸殊目前對(duì)這三種疫病采取的控制及撲殺的規(guī)定不同，禽流感特別是高致病性禽流感如H5N1、H7等可以突破種群傳播的界限，能夠?qū)е乱赘腥巳喊l(fā)病，具有極高的致死率； 而新城疫及禽傳染性支氣管炎屬于嚴(yán)格的禽類傳染病，一般對(duì)人不致病。所以一旦誤診誤判，后果將不堪想象。禽流感病毒屬于正粘病毒科甲型流感病毒屬(基因組分為節(jié)段的RNA，容易發(fā)生重排)；新城疫病毒是副粘病毒科(基因組為單股不分節(jié)的RNA);而禽傳染性支氣管炎病毒是冠狀病毒科冠狀病毒屬(基因組為單股不分節(jié)段的RNA)，因此，可以借助基因診斷等分子生物學(xué)手段進(jìn)行快速準(zhǔn)確的鑒別診斷。目前世界動(dòng)物衛(wèi)生組織規(guī)定對(duì)禽流感、新城疫病毒的檢驗(yàn)檢疫方法包括病毒的分離鑒定、瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、血凝和血凝抑制試驗(yàn)等。而禽傳染性支氣管炎病毒也是按照上述方法進(jìn)行檢測。病毒的分離與鑒定首先將樣品接種至無特定病原的禽胚，病毒會(huì)隨著禽胚的發(fā)育而増殖，經(jīng)一星期后抽取禽胚的尿囊液，進(jìn)行血凝和血凝抑制試驗(yàn)，從而可以判定檢測樣本中是否含有病毒。該方法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，但是周期長，約需21天，而且工作量大，需要大量的人力物力。瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)最早由oudin于1946年進(jìn)行對(duì)抗原混合物進(jìn)行分析?；驹硎窃谝欢讖降哪z中，當(dāng)抗原與抗體分子相遇時(shí)，形成抗原抗體復(fù)合物，若兩者比例適當(dāng)，則復(fù)合物分子量増大，顆粒増大，不再繼續(xù)擴(kuò)散而產(chǎn)生沉淀線。不同的抗原所形成的沉淀有各自的位置，從而可以將抗原分開。該方法的優(yōu)點(diǎn)是簡單易行，不需要特殊儀器，但是由于抗體分子與抗原決定簇的結(jié)合并不是一一對(duì)應(yīng)的，而且，由于離子強(qiáng)度、PH等因素，致使該方法的特異性較低。血凝和血凝抑制試驗(yàn)其基本原理是某些病毒或者病毒的血凝素，能選擇性的使幾種動(dòng)物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集，這種凝集紅細(xì)胞的現(xiàn)象稱為血凝。當(dāng)病毒的懸液中加入特異性抗體，且這種抗體的量足以抑制病毒顆?；蚱溲貢r(shí)，則紅細(xì)胞表面的受體就不能與病毒顆?；蚱溲刂苯咏佑|。這時(shí)紅細(xì)胞的凝集現(xiàn)象就被抑制，成為血凝抑制反應(yīng)。該方法的優(yōu)點(diǎn)是快速簡單，但是由于他檢測的是病毒抗體，而抗體必須在感染后相當(dāng)一段時(shí)間內(nèi)才能產(chǎn)生，因此，該方法的應(yīng)用范圍受到限制。隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，對(duì)禽流感、新城疫及禽傳染性支氣管炎病毒的檢測手段也有了快速的發(fā)展。例如采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。而普通的RT-PCR試驗(yàn)其結(jié)果的判斷需要對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，操作繁瑣。而三色熒光PCR技術(shù)原理是基于單色熒光PCR技術(shù)，是指在同一個(gè)熒光PCR擴(kuò)增試驗(yàn)中同時(shí)擴(kuò)增四個(gè)目的基因，探針為多種熒光標(biāo)記比如FAM、VIC、ROX、NED、HEX等，每種熒光標(biāo)記的探針在PCR擴(kuò)增過程中所產(chǎn)生的熒光信號(hào)不同。由于該方法引入了特異性擴(kuò)增引物和熒光探針，使得檢測的靈敏度和特異性得到很大程度的增強(qiáng)，從而避免了其他檢測方法特異性不高且容易漏檢的問題。但是，目前國內(nèi)外還沒有關(guān)于對(duì)禽流感、新城疫及禽傳染性支氣管炎進(jìn)行同步檢測的相關(guān)研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能夠同時(shí)在同一反應(yīng)管中實(shí)現(xiàn)樣本中禽流感、新城疫及禽傳染性支氣管炎病毒檢測的特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速準(zhǔn)確的動(dòng)物疫病三色熒光RT-PCR檢測試劑盒及其檢測方法
本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為
I、一種動(dòng)物疫病三色熒光RT-PCR檢測試劑盒，是在對(duì)禽流感病毒、新城疫病毒野毒及禽傳染性支氣管炎病毒野毒核酸序列分析的基礎(chǔ)上，通過生物信息學(xué)方法分析選取保守基因序列設(shè)計(jì)出特異性引物，利用熒光PCR技術(shù)對(duì)禽流感、新城疫病毒野毒及禽傳染性支氣管炎病毒野毒進(jìn)行檢測。此技術(shù)不僅能夠?qū)η萘鞲胁《究焖佟?zhǔn)確及特異的定性檢測，還能夠有效區(qū)分新城疫病毒野毒與疫苗毒、禽傳染性支氣管炎病毒野毒與疫苗毒。具體的說，本試劑盒包括多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)母液、陽性對(duì)照品、陰性對(duì)照品、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq聚合酶，其中多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)母液含有多重10X熒光RT-PCR反應(yīng)緩沖液、禽流感引物、禽流感探針、新城疫引物、新城疫探針、禽傳染性支氣管炎引物、禽傳染性支氣管炎探針、牛血清白蛋白；多重IOX熒光RT-PCR反應(yīng)緩沖液含有三羥甲基氨基甲烷鹽酸、氯化鉀、甘油、四種單核苷酸單體、氯化鎂，其中各引物及探針的序列如下，
依據(jù)禽流感病毒Matrix基因保守序列設(shè)計(jì)引物、探針
禽流感病毒上游引物 AIVPf: 5' -GTCTTCTAACCGAGGTCGAAAC-3'
禽流感病毒下游引物 AIVPr:5' -CCCTGCAAAGACATCTTCAAGT-3'
禽流感病毒熒光探針 AIVPb: 5' -FAM-CCCCTCAAAGCCGAGATCGCGC-BHQI-3'
依據(jù)新城疫病毒Fusion基因保守序列設(shè)計(jì)引物、探針
新城疫病毒上游引物 NDVPf: 5' - GCCGATAATGGCACCTATAAA-3'
新城疫病毒下游引物 NDVPr:5' - CCCTTGGTGATTCTATCCGC-3'
新城疫病毒熒光探針 NDVPbl :5' -HEX- CGTTTTTGTCTCCTTCCTCCAGACG-BHQI-3'
新城疫病毒熒光探針 NDVPb2 :5' -HEX- CGTCTCTGCCTCCTTCCTCCGGACG-BHQ1-3'
依據(jù)禽傳染性支氣管炎病毒Spike基因保守序列設(shè)計(jì)引物、探針
禽傳染性支氣管炎病毒上游引物AIBVPf: 5' -GCCTGGAAACGAACGGTAG-3'
禽傳染性支氣管炎病毒下游引物AIBVPr:5' -TCCTAGTGCTGTACCCTCGG-3'
禽傳染性支氣管炎病毒熒光探針AIBVPb: 5' -ROX-CCCCGGCACTGGCATCTTTATACCT-BHQl-3/ 。所述的陽性對(duì)照品為連接有設(shè)計(jì)禽流感病毒、新城疫病毒、禽傳染性支氣管炎病韋的引物、探針的基因保守序列的pUCm-T克隆載體。所述的陰性對(duì)照品為無RNA酶的DEPC水。所述的多重10 X PCR反應(yīng)緩沖液組成為三羥甲基氨基甲烷鹽酸終濃度為100禮、氯化鉀終濃度為500mM、甘油體積比為50%、四種單核苷酸單體(dATP、dGTP、dUTP、dGTP)終濃度為0. 4mM，氯化鎂終濃度為3mM及相應(yīng)體積的超純水。所述的多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)母液配制如下多重IOXPCR反應(yīng)緩沖液5ul ;濃度為20mg/ml的牛血清白蛋白Iul ;濃度均為IOOyM的引物AlVPf、AIVPr, NDVPf, NDVPr,AIBVPf 和 AIBVPr 各 0. 4ul ;濃度均為 50 u M 的探針 AIVPb、NDVPb 和 AIBVPb 各 0. 3ul ;無RNA酶DEPC水31. 5ul，配制混合后于冰箱_20°C保存。2、一種動(dòng)物疫病三色熒光RT-PCR檢測方法，其特征在于包括以下步驟 (1)樣品處理
采集活禽咽喉拭子和泄殖腔拭子，放入盛有2ml的含抗菌素的磷酸鹽緩沖液的試管，充分洗滌拭子，然后在管壁擠干液體，轉(zhuǎn)入無菌離心管中備用或者采集活禽新鮮肌肉或臟器，取待檢樣品2g于已洗浄、滅菌并烘干的研缽中充分研磨，加IOml磷酸鹽緩沖液混勻，取上清轉(zhuǎn)入無菌離心管中備用；
(2)病毒RNA的提取
將600ul的TRIZOL裂解液加入混勻器中，再分別加入待測樣本200ul和氯仿200ul，混勻器上振蕩混勻5s ;于12，OOOg離心15min后,加入于ー 20°C預(yù)冷的400ul異丙醇；吸取上清液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，顛倒混勻；將上清液于12，OOOg離心15min后，吸去上清，取固體沉淀物加入600ul的75%こ醇,顛倒洗漆,于12，OOOg離心IOmin ;輕輕倒去上清,倒置于吸水紙上，盡量沾干液體，取固體沉淀物干4，OOOg離心10s，將管壁上的殘余液體甩到管底部，用微量加樣器盡量將其吸干，室溫干燥5-10min，得到固體沉淀物為樣品核酸；
(3)50ul多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)液配制
取IOul提取的樣品核酸、IOul陽性對(duì)照品和IOul陰性對(duì)照品分別加入40ul多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)液至相應(yīng)的PCR管中進(jìn)行多重?zé)晒釸T-PCR擴(kuò)增，其中多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)液的配制如下多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)母液39ul ； AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(5U/ul) 0. 4ul ；Taq DNA聚合酶(5U/ul) 0. 6ul ；
(4)多重?zé)晒釸T-PCR擴(kuò)增檢測
在四色(或以上)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，探針檢測模式設(shè)置為FAM通道用于檢測禽流感病毒、HEX通道用于檢測新城疫病毒、ROX通道用于檢測禽傳染性支氣管炎病毒；反應(yīng)條件50°C 30分鐘I個(gè)循環(huán)；95 °C 3分鐘I個(gè)循環(huán)；95 °C 5秒，55°C 40秒，循環(huán)40次，設(shè)置完成后，保存文件，運(yùn)行程序；
(4)檢測結(jié)果分析
根據(jù)陰性對(duì)照品的陽性對(duì)照品的顯示結(jié)果，可得出檢測樣品如出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線，Ct值小于37為陽性結(jié)果；有擴(kuò)增曲線但不呈S形且閾值超過40或者沒有出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線為陰性結(jié)果；出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線，但Ct值大于37，小于40為可疑結(jié)果，對(duì)可疑結(jié)果，應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，如果重復(fù)實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照沒有污染，可判斷為陽性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明ー種禽流感病毒、新城疫病毒野毒及禽傳染性支氣管炎病毒野毒三色熒光PCR檢測試劑盒及檢測方法，由于該試劑盒引入了針對(duì)禽流感病毒、新城疫病毒野毒及禽傳染性支氣管炎病毒野毒核酸序列所設(shè)計(jì)的特異性擴(kuò)增引物和三色熒光探針，可以同時(shí)對(duì)禽流感病毒檢測以及有效區(qū)分新城疫病毒野毒與疫苗毒及禽傳染性支氣管炎病毒野毒與疫苗毒，從而實(shí)現(xiàn)了ー個(gè)標(biāo)本中同時(shí)檢測三種病毒的目的，既節(jié)約了生產(chǎn)成本和檢測成本，又提高了檢測效率及縮短了時(shí)間，一般來說，從處理樣本到結(jié)果的判斷僅需要2小時(shí)左右。綜上所述，本發(fā)明ー種用于快速實(shí)時(shí)定性檢測禽流感病毒、新城疫病毒野毒及禽傳染性支氣管炎病毒野毒的三色熒光PCR檢測試劑盒及檢測方法，病毒的檢測敏感性高，特異性好，降低了常規(guī)PCR擴(kuò)增的假陽性率，可實(shí)現(xiàn)對(duì)禽流感病毒、新城疫病毒野毒及禽傳染性支氣管炎病毒野毒同時(shí)快速、準(zhǔn)確及特異檢測。


圖I為本發(fā)明動(dòng)物疫病三色熒光RT-PCR擴(kuò)增圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步詳細(xì)描述。具體實(shí)施例一
禽流感病毒、新城疫病毒野毒及禽傳染性支氣管炎病毒野毒三色熒光RT-PCR檢測試
劑盒
I、RT-PCR檢測試劑盒組成
本試劑盒包括多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)母液、陽性對(duì)照品、陰性對(duì)照品、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq聚合酶。其中多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)母液含有多重IOX熒光RT-PCR反應(yīng)緩沖液、禽流感引物、禽流感探針、新城疫引物、新城疫探針、禽傳染性支氣管炎引物、禽傳染性支氣管炎探針、牛血清白蛋白；多重IOX熒光RT-PCR反應(yīng)緩沖液含有三羥甲基氨基甲烷鹽酸、氯化鉀、甘油、四種單核苷酸單體、氯化鎂。其中多重10XPCR反應(yīng)緩沖液組成為三羥甲基氨基甲烷鹽酸終濃度為100禮、氯化鉀終濃度為500mM、甘油體積比為50% (甘油的體積為多重10XPCR反應(yīng)緩沖液體積的50%)、四種單核苷酸單體(dATP、dGTP、dUTP、dGTP)終濃度為0. 4mM，氯化鎂終濃度為3mM及相應(yīng)體積的超純水。其中多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)母液配制如下(括號(hào)內(nèi)為相應(yīng)的物質(zhì)的濃度)
多重10XPCR反應(yīng)緩沖液5ul
牛血清白蛋白(20mg/ml)Iul
AIVPf 和 AIVPr (IOOuM)各 0. 4ul
NDVPf 和 NDVPr (IOOuM)各 0. 4ul
AIBVPf■和 AIBVPr (IOOuM)各 0. 4ul
AIVPb 和 NDVPb 和 AIBVPb (50uM) 各 0. 3ul 無 RNA 酶 DEPC 水31.5ul
配制混合后于冰箱_20°C保存。上述陽性對(duì)照品為連接有設(shè)計(jì)禽流感病毒、新城疫病毒、禽傳染性支氣管炎病毒的引物、探針的基因保守序列的PUCm-T克隆載體，陰性對(duì)照品為無RNA酶的DEPC水。
2、引物、探針設(shè)計(jì)與合成
從GenBank下載所有禽流感病毒、新城疫病毒及禽傳染性支氣管炎病毒的基因序列，經(jīng)過生物信息學(xué)分析反復(fù)比對(duì)，選擇如下區(qū)域作為擴(kuò)增禽流感病毒、新城疫病毒及禽傳染性支氣管炎病毒的特異性目標(biāo)區(qū)域
依據(jù)禽流感病毒Matrix基因保守序列設(shè)計(jì)引物、探針
禽流感病毒上游引物 AIVPf: 5' -GTCTTCTAACCGAGGTCGAAAC-3'
禽流感病毒下游引物 AIVPr:5' -CCCTGCAAAGACATCTTCAAGT-3'
禽流感病毒熒光探針 AIVPb: 5' -FAM-CCCCTCAAAGCCGAGATCGCGC-BHQI-3'
依據(jù)新城疫病毒Fusion基因保守序列設(shè)計(jì)引物、探針
新城疫病毒上游引物 NDVPf: 5' - GCCGATAATGGCACCTATAAA-3'
新城疫病毒下游引物 NDVPr:5' - CCCTTGGTGATTCTATCCGC-3'
新城疫病毒熒光探針 NDVPbl :5' -HEX- CGTTTTTGTCTCCTTCCTCCAGACG-BHQ I -3'
新城疫病毒熒光探針 NDVPb2 :5' -HEX- CGTCTCTGCCTCCTTCCTCCGGACG-BHQ1-3'
依據(jù)禽傳染性支氣管炎病毒Spike基因保守序列設(shè)計(jì)引物、探針
禽傳染性支氣管炎病毒上游引物AIBVPf: 5' -GCCTGGAAACGAACGGTAG-3'
禽傳染性支氣管炎病毒下游引物AIBVPr:5' -TCCTAGTGCTGTACCCTCGG-3'
禽傳染性支氣管炎病毒熒光探針AIBVPb: 5' -ROX-CCCCGGCACTGGCATCTTTATACCT-BHQl-3/ 。具體實(shí)施例ニ
禽流感病毒、新城疫病毒野毒及禽傳染性支氣管炎病毒野毒三色熒光RT-PCR檢測方法，毎次檢測均應(yīng)設(shè)立陽性對(duì)照組及陰性對(duì)照組
1、樣品處理
若樣品為活禽，建議取咽喉拭子和泄殖腔拭子取咽喉拭子時(shí)將拭子深入喉頭ロ及上顎裂來回刮幾次取咽喉分泌液，取泄殖腔拭子時(shí)將拭子伸入瀉殖腔轉(zhuǎn)ー圈沾取糞便。然后將拭子一起放入盛有2ml磷酸鹽(PBS)緩沖液(含抗菌素)的試管，充分洗滌拭子，然后在管壁擠干液體，轉(zhuǎn)入無菌離心管中備用；若樣品為新鮮肌肉或臟器，取待檢樣品2g于已洗凈、滅菌并烘干的研缽中充分研磨，加IOml PBS混勻，取上清轉(zhuǎn)入無菌離心管中備用。為使樣品的代表性更強(qiáng)，也可取50克肉樣,加入50ml無菌的PBS液,用Bagmixer均質(zhì)器處理后，取上清備用；
2、病毒RNA的提取
將600ul的TRIZOL裂解液(產(chǎn)地Invitrogen，貨號(hào)15596018)加入混勻器中，再分別加入待測樣本200ul和氯仿200ul,混勻器上振蕩混勻5s ;于12，OOOg離心15min后，加入于ー 20°C預(yù)冷的400ul異丙醇；吸取上清液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，顛倒混勻；將上清液于12，OOOg離心15min后，吸去上清，取固體沉淀物加入600ul的75%こ醇，顛倒洗滌，于12，OOOg離心IOmin ;輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體，取固體沉淀物干4，OOOg離心10s，將管壁上的殘余液體甩到管底部，用微量加樣器盡量將其吸干，室溫干燥5-10min,得到固體沉淀物為樣品核酸；
3、50ul多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)液配制 取IOul提取的樣品核酸、IOul陽性對(duì)照品和IOul陰性對(duì)照品分別加入40ul多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)液至相應(yīng)的PCR管中進(jìn)行多重?zé)晒釸T-PCR擴(kuò)增(陽性對(duì)照品、陰性對(duì)照品相應(yīng)的作為陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組)，其中多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)液的配制如下多重?zé)晒釸T-PCR 反應(yīng)母液 39ul ； AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶(5U/ul) 0. 4ul ；Taq DNA 聚合酶(5U/ul) 0. 6ul ；
4、多重?zé)晒釸T-PCR擴(kuò)增檢測
在四色(或以上)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，探針檢測模式設(shè)置為FAM通道用于檢測禽流感病毒、HEX通道用于檢測新城疫病毒、ROX通道用于檢測禽傳染性支氣管炎病毒；反應(yīng)條件50°C 30分鐘I個(gè)循環(huán)；95°C 3分鐘I個(gè)循環(huán)；95 °C 5秒，55°C 40秒，循環(huán)40次，設(shè)置完成后，保存文件，運(yùn)行程序；
5、檢測結(jié)果分析
根據(jù)陰性對(duì)照品的陽性對(duì)照品的顯示結(jié)果，由此判斷檢測樣品 陽性出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線，Ct值小于37 ；
可疑出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線，但Ct值大于37，小于40 ；
陰性沒有出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線；或者曲線雖然超過閾值40，但不呈S形；
對(duì)可疑結(jié)果，應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，如果重復(fù)實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照沒有污染，可判斷為陽性。具體何種病毒感染鑒定按照下表進(jìn)行表I檢測結(jié)果判斷
權(quán)利要求
1.一種動(dòng)物疫病三色熒光RT-PCR檢測試劑盒，包括多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)母液、陽性對(duì)照品、陰性對(duì)照品、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq聚合酶，其特征在于多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)母液含有多重IOX熒光RT-PCR反應(yīng)緩沖液、禽流感引物、禽流感探針、新城疫引物、新城疫探針、禽傳染性支氣管炎引物、禽傳染性支氣管炎探針、牛血清白蛋白，其中各引物及探針的序列如下 禽流感病毒上游引物 AIVPf: 5' -GTCTTCTAACCGAGGTCGAAAC-3' 禽流感病毒下游引物 AIVPr:5' -CCCTGCAAAGACATCTTCAAGT-3' 禽流感病毒熒光探針 AIVPb: 5' -FAM-CCCCTCAAAGCCGAGATCGCGC-BHQI-3' 新城疫病毒上游引物 NDVPf :5/ - GCCGATAATGGCACCTATAAA-3' 新城疫病毒下游引物 NDVPr:5' - CCCTTGGTGATTCTATCCGC-3' 新城疫病毒熒光探針 NDVPbl :5' -HEX- CGTTTTTGTCTCCTTCCTCCAGACG-BHQ1-3' 新城疫病毒熒光探針 NDVPb2 :5' -HEX- CGTCTCTGCCTCCTTCCTCCGGACG-BHQ1-3' 禽傳染性支氣管炎病毒上游引物AIBVPf: 5' -GCCTGGAAACGAACGGTAG-3' 禽傳染性支氣管炎病毒下游引物AIBVPr:5' -TCCTAGTGCTGTACCCTCGG-3' 禽傳染性支氣管炎病毒熒光探針AIBVPb: 5' -ROX-CCCCGGCACTGGCATCTTTATACCT-BHQ1-3'。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的動(dòng)物疫病三色熒光RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于所述的多重10XPCR反應(yīng)緩沖液組成如下三羥甲基氨基甲烷鹽酸終濃度為100禮、氯化鉀終濃度為500mM、甘油體積比為50%、四種單核苷酸單體終濃度為O. 4mM，氯化鎂終濃度為3mM及相應(yīng)體積的超純水。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的動(dòng)物疫病三色熒光RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于所述的多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)母液配制如下多重10XPCR反應(yīng)緩沖液5ul ;濃度為20mg/ml的牛血清白蛋白 Iul ;濃度均為 ΙΟΟμΜ 的引物 AIVPf、AIVPr、NDVPf、NDVPr、AIBVPf 和 AIBVPr 各O.4ul ;濃度均為5(^] 的探針41￥ 13、冊(cè)￥ 13和418￥ 13各0.3111 ;無RNA酶DEPC水 31. 5ul,配制混合后于冰箱-20°C保存。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求I所述的動(dòng)物疫病三色熒光RT-PCR的檢測方法，其特征在于包括以下步驟 (1)樣品處理 采集活禽咽喉拭子和泄殖腔拭子，放入盛有2ml的含抗菌素的磷酸鹽緩沖液的試管，充分洗滌拭子，然后在管壁擠干液體，轉(zhuǎn)入無菌離心管中備用或者采集活禽新鮮肌肉或臟器，取待檢樣品2g于已洗凈、滅菌并烘干的研缽中充分研磨，加IOml磷酸鹽緩沖液混勻，取上清轉(zhuǎn)入無菌離心管中備用； (2)病毒RNA的提取 將600ul的TRIZOL裂解液(Invitrogen，15596018)加入混勻器中，再分別加入待測樣本200ul和氯仿200ul，混勻器上振蕩混勻5s ;于12，OOOg離心15min后，加入于一 20°C預(yù)冷的400ul異丙醇；吸取上清液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，顛倒混勻；將上清液于12，OOOg離心15min后，吸去上清，取固體沉淀物加入600ul的75%乙醇，顛倒洗滌，于12，OOOg離心IOmin ;輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體，取固體沉淀物于4，OOOg離心10s，將管壁上的殘余液體甩到管底部，用微量加樣器盡量將其吸干，室溫干燥5-10min，得到固體沉淀物為樣品核酸； (3)多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)液配制 取IOul提取的樣品核酸、IOul陽性對(duì)照品和IOul陰性對(duì)照品分別加入40ul多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)液至相應(yīng)的PCR管中進(jìn)行多重?zé)晒釸T-PCR擴(kuò)增，其中多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)液的配制如下多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)母液39ul ;濃度為5U/ul的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶O. 4ul ;濃度為 5U/ul 的 Taq DNA 聚合酶 O. 6ul ； (4)多重?zé)晒釸T-PCR擴(kuò)增檢測 在四色熒光定量PCR儀上進(jìn)行，探針檢測模式設(shè)置為FAM通道用于檢測禽流感病毒、HEX通道用于檢測新城疫病毒、ROX通道用于檢測禽傳染性支氣管炎病毒；反應(yīng)條件50°C30分鐘I個(gè)循環(huán)；95°C 3分鐘I個(gè)循環(huán)；95°C 5秒，55°C 40秒，循環(huán)40次，設(shè)置完成后，保存文件，運(yùn)行程序； (4)檢測結(jié)果分析 根據(jù)陰性對(duì)照品的陽性對(duì)照品的顯示結(jié)果，可得出檢測樣品如出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線，Ct值小于37為陽性結(jié)果；有擴(kuò)增曲線但不呈S形且閾值超過40或者沒有出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線為陰性結(jié)果；出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線，但Ct值大于37，小于40為可疑結(jié)果，對(duì)可疑結(jié)果，應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，如果重復(fù)實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照沒有污染，可判斷為陽性。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的動(dòng)物疫病三色熒光RT-PCR的檢測方法，其特征在于所述的多重10XPCR反應(yīng)緩沖液組成如下三羥甲基氨基甲烷鹽酸終濃度為100禮、氯化鉀終濃度為500mM、甘油體積比為50%、四種單核苷酸單體終濃度為O. 4mM，氯化鎂終濃度為3mM及相應(yīng)體積的超純水。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的動(dòng)物疫病三色熒光RT-PCR的檢測方法，其特征在于所述的多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)母液配制如下多重10XPCR反應(yīng)緩沖液5ul ;濃度為20mg/ml的牛血清白蛋白 Iul ;濃度均為 100 μ M 的引物 AIVPf、AIVPr、NDVPf、NDVPr、AIBVPf 和 AIBVPr 各O.4ul ;濃度均為5(^] 的探針41￥ 13、冊(cè)￥ 13和418￥ 13各0.3111 ;無RNA酶DEPC水 31. 5ul,配制混合后于冰箱-20°C保存。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的動(dòng)物疫病三色熒光RT-PCR的檢測方法的檢測方法，其特征在于禽流感病毒上游引物AIVPf如SEQ ID NO. I，其下游引物AIVPr如SEQ ID NO. 2所示，禽流感病毒熒光探針AIVPb如SEQ ID NO. 3所示；新城疫病毒上游引物NDVPf如SEQ IDNO. 4，其下游引物NDVPr如SEQ ID NO. 5所示，新城疫病毒熒光探針NDVPbl如SEQ ID NO. 6所示，新城疫病毒熒光探針NDVPb2如SEQ ID NO. 7所示；禽傳染性支氣管炎病毒上游引物AIBVPf如SEQ ID NO. 8所示，其下游引物AIBVPr如SEQ ID NO. 9所示，禽傳染性支氣管炎病毒熒光探針AIBVPb如SEQ ID NO. 10所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種動(dòng)物疫病三色熒光RT-PCR檢測試劑盒及檢測方法，特點(diǎn)是該試劑盒包括多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)母液、陽性對(duì)照品、陰性對(duì)照品、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq聚合酶，其中多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)母液含有多重10×熒光RT-PCR反應(yīng)緩沖液、禽流感引物和探針、新城疫引物和探針、禽傳染性支氣管炎引物和探針、牛血清白蛋白，其中其中各上、下游引物、特異性探針序列如SEQIDNO.1、NO.2、NO.3、NO.4、NO.5、NO.6、NO.7、NO.8、NO.9、NO.10所示，優(yōu)點(diǎn)是能夠同時(shí)在同一反應(yīng)管中實(shí)現(xiàn)樣本中禽流感、新城疫及禽傳染性支氣管炎病毒檢測，并且特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速準(zhǔn)確。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102851392SQ201210251620
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月20日
發(fā)明者周冬根, 孫大為, 曹雪春, 李紅, 張升, 王燕, 岑晨霞 申請(qǐng)人:寧波檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院