本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種天竺鯛科魚類——印度洋銀口天竺鯛的分子標(biāo)記引物及鑒別方法。

背景技術(shù)：

印度洋銀口天竺鯛(Jaydia striatodes)隸屬于鱸形目、鱸亞目，分布于印度洋東部和西北太平洋，于我國分布于南部沿海。印度洋銀口天竺鯛具有以下形態(tài)特征：背鰭鰭條數(shù)VII+I，9；臀鰭鰭條數(shù)II，8；胸鰭鰭條數(shù)15；側(cè)線鱗數(shù)24+3；背前鱗數(shù)4，為櫛鱗；第一鰓弓鰓耙數(shù)4–5+12–13(通常為5+13)；發(fā)達鰓耙數(shù)3+11–12(通常為3+12)；角鰓弓上的鰓耙數(shù)9；前鰓蓋骨邊緣轉(zhuǎn)折處具弱鋸齒，前鰓蓋骨脊邊緣光滑。該種與同屬的橫帶銀口天竺鯛(Jaydia striata)為姐妹群，兩者形態(tài)特征非常相似，前者在我國曾被鑒定為后者，兩者可通過發(fā)達上鰓耙數(shù)(3vs.2)、角鰓弓上的鰓耙數(shù)(9vs.8)和臀鰭顏色進行區(qū)分(臀鰭遠端黑色vs.臀鰭淺色)。但是由于根據(jù)形態(tài)特征進行鑒定對專業(yè)技能和經(jīng)驗要求較高，且形態(tài)特征有時會發(fā)生變異，僅依靠形態(tài)特征進行鑒定仍然較為困難。因此有必要提出區(qū)別兩種銀口天竺鯛屬魚類的有效基因特征，從分子層面為該種的鑒定提供可靠依據(jù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種鑒別印度洋銀口天竺鯛的方法，從基因特征上區(qū)別兩種銀口天竺鯛屬魚類，為該種的鑒定提供可靠依據(jù)，從而彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足。

本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：

一種鑒別印度洋銀口天竺鯛的分子標(biāo)記引物，所述的引物序列為FishF1:5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3′,

FishR2:5’-ACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3′。

本發(fā)明還提供一種鑒別印度洋銀口天竺鯛的方法，具體步驟如下：

提取印度洋銀口天竺鯛和橫帶銀口天竺鯛的DNA，對印度洋銀口天竺鯛和橫帶銀口天竺鯛的DNA中細胞色素c氧化酶I基因進行PCR擴增，擴增程序為94℃預(yù)變性5min，然后94℃變性45sec，50℃退火45sec，72℃延伸45sec，進行35個循環(huán)，最后72℃延伸10min，4℃保存∞；對擴增結(jié)果純化，測序，比對測序結(jié)果；印度洋銀口天竺鯛COI基因片段序列為：TATCTAGTTTTTGGTGCCTGAGCCGGAATAGTCGGCACAGCTCTTAGCTTGCTCATCCGGGCTGAACTAAGCCAACCAGGGGCCCTCCTTGGCGATGACCAAATCTACAATGTAATCGTTACGGCACATGCATTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCAATTATGATCGGAGGCTTTGGGAACTGACTAATTCCTCTGATGATTGGTGCTCCTGATATAGCATTCCCCCGAATGAACAACATAAGTTTCTGATTACTCCCTCCCTCGTTCCTTCTTCTACTTGCCTCCTCAGGCGTAGAAGCGGGAGCCGGGACAGGATGGACAGTGTACCCCCCTCTTGCAGGCAATCTTGCCCACGCAGGCGCCTCTGTTGACCTAACAATCTTCTCCCTGCATCTTGCAGGGATCTCCTCAATTCTAGGGGCTATCAACTTTATTACAACAATTATCAACATGAAACCACCTGCCATTACTCAGTACCAGACGCCGTTGTTTGTCTGAGCCGTCCTTATTACGGCTGTTCTTCTTCTTCTATCCCTCCCTGTACTAGCCGCCGGCATTACAATGCTCCTAACTGACCGAAACCTAAATACAACCTTCTTTGACCCAGCGGGAGGAGGGGA，種內(nèi)遺傳差異不大于1％；

所述步驟2的PCR擴增的反應(yīng)體系組成為：超純水17.5ul，10×buffer 2.5ul，dNTPs 2ul，rTaq 0.15ul，模板1ul，Primer各1ul。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果：

本發(fā)明對印度洋銀口天竺鯛和橫帶銀口天竺鯛線粒體DNA COI基因各一條626bp的序列進行比對，結(jié)果顯示存在66個變異位點，其中53個轉(zhuǎn)換，13個顛換。比對兩種魚類不同個體的相同序列，所得結(jié)果基本一致。計算種內(nèi)和種間遺傳距離，顯示印度洋銀口天竺鯛樣品與橫帶銀口天竺鯛樣品具有約12％的種間差異，而我國北部灣、越南、泰國灣和菲律賓的的印度洋銀口天竺鯛樣品和泰國灣和馬來西亞的橫帶銀口天竺鯛樣品分別具有0-1.0％和0-0.2％的種內(nèi)差異。COI基因片段能有穩(wěn)定有效地區(qū)分印度洋銀口天竺鯛和橫帶銀口天竺鯛。

本發(fā)明從分子水平探索了印度洋銀口天竺鯛與其姐妹種橫帶銀口天竺鯛線粒體COI基因片段序列的差異，提出了印度洋銀口天竺鯛和橫帶銀口天竺鯛的分子鑒別方法。

具體實施方式

下面結(jié)合實例對本發(fā)明進行詳細的描述。

實施例1：對采集自我國廣西北海市沿海的印度洋銀口天竺鯛與采集自馬來西亞的橫帶銀口天竺鯛進行區(qū)分。

合成引物FishF15’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3′,

FishR2:5’-ACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3′；提取所述印度洋銀口天竺鯛和橫帶銀口天竺鯛DNA,對其線粒體DNA中的細胞色素c氧化酶I基因(COI)進行PCR擴增，PCR擴增的反應(yīng)體系組成為：超純水17.5ul，10×buffer 2.5ul，dNTPs 2ul，rTaq 0.15ul，模板1ul，Primer各1ul；

擴增程序為94℃預(yù)變性5min，(94℃變性45sec，50℃退火45sec，72℃延伸45sec)×35個循環(huán)，72℃延伸10min，4℃保存∞；擴增結(jié)果經(jīng)純化、測序，對比序列結(jié)果，結(jié)果顯示存在66個變異位點，其中53個轉(zhuǎn)換，12個顛換。計算種內(nèi)和種間遺傳距離，顯示印度洋銀口天竺鯛和橫帶銀口天竺鯛樣品之間存在約12％的遺傳差異，而兩者種內(nèi)遺傳差異不足1％，有效的區(qū)分了兩種魚類。

所述印度洋銀口天竺鯛COI基因片段序列為：

TATCTAGTTTTTGGTGCCTGAGCCGGAATAGTCGGCACAGCTCTTAGCTTGCTCATCCGGGCTGAACTAAGCCAACCAGGGGCCCTCCTTGGCGATGACCAAATCTACAATGTAATCGTTACGGCACATGCATTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCAATTATGATCGGAGGCTTTGGGAACTGACTAATTCCTCTGATGATTGGTGCTCCTGATATAGCATTCCCCCGAATGAACAACATAAGTTTCTGATTACTCCCTCCCTCGTTCCTTCTTCTACTTGCCTCCTCAGGCGTAGAAGCGGGAGCCGGGACAGGATGGACAGTGTACCCCCCTCTTGCAGGCAATCTTGCCCACGCAGGCGCCTCTGTTGACCTAACAATCTTCTCCCTGCATCTTGCAGGGATCTCCTCAATTCTAGGGGCTATCAACTTTATTACAACAATTATCAACATGAAACCACCTGCCATTACTCAGTACCAGACGCCGTTGTTTGTCTGAGCCGTCCTTATTACGGCTGTTCTTCTTCTTCTATCCCTCCCTGTACTAGCCGCCGGCATTACAATGCTCCTAACTGACCGAAACCTAAATACAACCTTCTTTGACCCAGCGGGAGGAGGGGA；

所述橫帶銀口天竺鯛COI基因片段序列為：

TATCTAGTTTTTGGTGCCTGAGCTGGAATAGTCGGTACGGCCCTTAGCTTGCTTATCCGAGCTGAGCTAAGTCAACCCGGGGCTCTCCTTGGCGATGACCAGATCTACAATGTAATCGTTACAGCACATGCATTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCAATTATGATTGGAGGCTTTGGAAATTGACTAATTCCTCTAATGATTGGTGCCCCTGATATAGCATTCCCTCGAATAAACAACATGAGTTTCTGGTTGCTCCCTCCCTCATTTCTTCTTCTACTTGCCTCCTCAGGTGTTGAAGCCGGGGCCGGAACAGGATGAACAGTTTATCCCCCTCTTGCAGGCAATCTTGCCCACGCAGGAGCATCTGTTGATTTAACAATTTTTTCTTTACATCTTGCAGGTATTTCCTCAATTCTAGGAGCTATTAACTTTATTACAACAATTATTAATATGAAACCACCTGCCATCACTCAGTATCAAACACCCCTGTTTGTCTGAGCCGTCCTTATTACAGCTGTACTTCTTCTTTTATCCCTCCCTGTTCTAGCTGCCGGCATTACAATGCTCCTCACCGATCGAAACCTCAATACAACCTTCTTTGACCCAGCAGGAGGGGGAGA。

兩個物種COI基因片段序列比對結(jié)果如下：

TATCTAGTTTTTGGTGCCTGAGCCGGAATAGTCGGCACAGCTCTTAGC..............................................T.......................T....G....C............TTGCTCATCCGGGCTGAACTAAGCCAACCAGGGGCCCTCCTTGGCGATGA..........T..........A...........G...........T...........C...........T............................CCAAATCTACAATGTAATCGTTACGGCACATGCATTTGTAATAATTTTCTTTA......G.......................................A......................................................TAGTAATACCAATTATGATCGGAGGCTTTGGGAACTGACTAATTCCTCTGAT....................................T........................A.....T...........................A....GATTGGTGCTCCTGATATAGCATTCCCCCGAATGAACAACATAAGTTTCTGA..................C..................................T..........A................G................G TTACTCCCTCCCTCGTTCCTTCTTCTACTTGCCTCCTCAGGCGTAGAAGCGG....G.....................A....T..............................................T....T............C..GAGCCGGGACAGGATGGACAGTGTACCCCCCTCTTGCAGGCAATCTTGCC..G............A.................A...........T....T................................................CACGCAGGCGCCTCTGTTGACCTAACAATCTTCTCCCTGCATCTTGCAGGG.................A.....A................TT...............T....T....TT...A.......................T ATCTCCTCAATTCTAGGGGCTATCAACTTTATTACAACAATTATCAACATGA....T...........................A...........T.......................................T.....T.........AACCACCTGCCATTACTCAGTACCAGACGCCGTTGTTTGTCTGAGCCGTCC...........................C................T.....A....A.....CC....................................TTATTACGGCTGTTCTTCTTCTTCTATCCCTCCCTGTACTAGCCGCCGGCATT.............A..........A..................T.........................T...........T...............ACAATGCTCCTAACTGACCGAAACCTAAATACAACCTTCTTTGACCCAGCG......................C....C.....T.................C...............................................AGGAGGAGGGGA。

...........G......A....。

實施例2：對采集自我國海南島西北海域的印度洋銀口天竺鯛與采集自泰國灣的橫帶銀口天竺鯛進行區(qū)分。

合成引物FishF1和FishR2，提取所述印度洋銀口天竺鯛和橫帶銀口天竺鯛DNA,對其線粒體DNA中的細胞色素c氧化酶I基因(COI)進行PCR擴增，PCR擴增的反應(yīng)體系組成為：超純水17.5ul，10×buffer 2.5ul，dNTPs 2ul，rTaq 0.15ul，模板1ul，Primer各1ul。

擴增程序為94℃預(yù)變性5min，(94℃變性45sec，50℃退火45sec，72℃延伸45sec)×35個循環(huán)，72℃延伸10min，4℃保存∞；擴增結(jié)果經(jīng)純化、測序，對比序列結(jié)果,結(jié)果顯示存在68個變異位點，其中57個轉(zhuǎn)換，11個顛換。計算遺傳距離，發(fā)現(xiàn)印度洋銀口天竺鯛和橫帶銀口天竺鯛樣品之間存在約12％的遺傳差異，而兩者種內(nèi)遺傳差異均不足1％，有效的區(qū)分了兩種魚類。

具體比較結(jié)果如下：

TATCTAGTTTTTGGTGCCTGAGCCGGGATAGTCGGCACAGCTCT......T........................................T.....A.................T....G....C....TAGCTTGCTCATCCGGGCTGAACTAAGCCAACCAGGGGCCCTC..................T............A.........G...........T...........C............T.......CTTGGCGATGACCAAATCTACAATGTAATCGTTACGGCACATGC.............................G.......................................A................ATTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCAATTATGATCGGAGGC..........................................................................T.............TTTGGGAACTGACTAATTCCTCTGATGATTGGTGCTCCTGATATA..........A.....T...........................A......................C..................GCATTCCCCCGAATGAACAACATAAGTTTCTGATTACTCCCTCC................T..........A..................G...............G.....G................CTCGTTCCTTCTTCTACTTGCCTCCTCAGGCGTAGAAGCGGGAG.......A...T.............................................T....T............C.....G..CCGGGACAGGATGGACAGTGTACCCCCCTCTTGCAGGCAATCT.........A.................A...........T....T........................................TGCCCACGCAGGGGCCTCTGTTGACCTAACAATCTTCTCCCTGC.........................A......A...............TT..............T....T.....TT...A...ATCTTGCAGGGATCTCCTCAATTCTAGGGGCTATCAACTTTATTA....................T.....T............................A..........T....................CAACAATTATCAACATGAAACCACCTGCCATTACTCAGTACCAG....................T.....T...................................C................T....AACGCCGTTGTTTGTCTGAGCCGTCCTTATCACGGCTGTTCTTCTT.....A....CC...........................................T.....A...........A...........CTTCTATCCCTCCCTGTACTAGCCGCCGGCATTACAATGCTCCTA......T.........................T..........T.......................................CACTGACCGAAACCTAAATACAACCTTCTTTGACCCAGCGGGAG.....C.....T................C...............................................A.........GAGGGGA。

...G....A......。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江海洋大學(xué)

<120> 一種鑒別邵氏鱚與多鱗鱚的分子標(biāo)記引物及方法

<130> 無

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物序列為 FishF1

<400> 1

tcaaccaacc acaaagacat tggcac 26

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物FishR2

<400> 2

acttcagggt gaccgaagaa tcagaa 26

<210> 3

<211> 626

<212> DNA

<213> Apogonidae

<400> 3

tatctagttt ttggtgcctg agccggaata gtcggcacag ctcttagctt gctcatccgg 60

gctgaactaa gccaaccagg ggccctcctt ggcgatgacc aaatctacaa tgtaatcgtt 120

acggcacatg catttgtaat aattttcttt atagtaatac caattatgat cggaggcttt 180

gggaactgac taattcctct gatgattggt gctcctgata tagcattccc ccgaatgaac 240

aacataagtt tctgattact ccctccctcg ttccttcttc tacttgcctc ctcaggcgta 300

gaagcgggag ccgggacagg atggacagtg tacccccctc ttgcaggcaa tcttgcccac 360

gcaggcgcct ctgttgacct aacaatcttc tccctgcatc ttgcagggat ctcctcaatt 420

ctaggggcta tcaactttat tacaacaatt atcaacatga aaccacctgc cattactcag 480

taccagacgc cgttgtttgt ctgagccgtc cttattacgg ctgttcttct tcttctatcc 540

ctccctgtac tagccgccgg cattacaatg ctcctaactg accgaaacct aaatacaacc 600

ttctttgacc cagcgggagg agggga 626

<210> 4

<211> 626

<212> DNA

<213> Apogonidae

<400> 4

tatctagttt ttggtgcctg agctggaata gtcggtacgg cccttagctt gcttatccga 60

gctgagctaa gtcaacccgg ggctctcctt ggcgatgacc agatctacaa tgtaatcgtt 120

acagcacatg catttgtaat aattttcttt atagtaatac caattatgat tggaggcttt 180

ggaaattgac taattcctct aatgattggt gcccctgata tagcattccc tcgaataaac 240

aacatgagtt tctggttgct ccctccctca tttcttcttc tacttgcctc ctcaggtgtt 300

gaagccgggg ccggaacagg atgaacagtt tatccccctc ttgcaggcaa tcttgcccac 360

gcaggagcat ctgttgattt aacaattttt tctttacatc ttgcaggtat ttcctcaatt 420

ctaggagcta ttaactttat tacaacaatt attaatatga aaccacctgc catcactcag 480

tatcaaacac ccctgtttgt ctgagccgtc cttattacag ctgtacttct tcttttatcc 540

ctccctgttc tagctgccgg cattacaatg ctcctcaccg atcgaaacct caatacaacc 600

ttctttgacc cagcaggagg gggaga 626