本發(fā)明涉及沼蝦生物學(xué)遺傳育種領(lǐng)域，具體地說是一種用于日本沼蝦生長性狀分析的微衛(wèi)星標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

SSR(Simple sequence repeat)即簡單序列重復(fù)，又稱為微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA)，在真核生物基因組中，SSR僅由幾個(gè)核苷酸(1～6個(gè))組成重復(fù)單位，如(GA)n、(AC)n、(GAA)n(其中n為重復(fù)次數(shù))等，重復(fù)次數(shù)10～50，同一類微衛(wèi)星DNA可分布在整個(gè)基因組不同位置上，由于重復(fù)次數(shù)的不同，或重復(fù)程度的不完全，而形成每個(gè)座位的多態(tài)性。每類微衛(wèi)星DNA兩端的序列多是相對(duì)保守的單拷貝序列，可根據(jù)兩端序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，擴(kuò)增每個(gè)位點(diǎn)微衛(wèi)星序列。

目前，SSR也是發(fā)展最快、應(yīng)用最廣的一類標(biāo)記。SSR標(biāo)記具有以下特點(diǎn)：①廣泛分布于整個(gè)基因組，甚至是葉綠體基因組和線粒體基因組；②數(shù)量眾多，表現(xiàn)出高度的多態(tài)性；③具有多等位基因的特性，信息量高；④呈共顯性遺傳，即能區(qū)分純合子和雜合子；⑤等位基因的分離遵循孟德爾規(guī)律；⑥基于PCR技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化記錄和分析；⑦具有連鎖不平衡現(xiàn)象；⑧重復(fù)性較好；⑨適合重現(xiàn)群體的歷史。因此，微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)目前已廣泛地應(yīng)用于生物DNA指紋圖譜、種質(zhì)資源的鑒定、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性、等位基因變異和遺傳關(guān)系及遺傳結(jié)構(gòu)等方面。

日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)自然分布于中國和日本，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較大的一種重要淡水蝦類，河北白洋淀、衡水湖、山東微山湖、江蘇洪澤湖都有日本沼蝦野生資源的分布。因其肉質(zhì)細(xì)嫩、美味可口、富含維生素、氨基酸以及Mn、Zn等多種人體必需微量元素含量高、藥用價(jià)值高，深受人們喜愛并得到廣泛養(yǎng)殖，據(jù)《中國漁業(yè)年鑒》公布，目前全國養(yǎng)殖日本沼蝦年產(chǎn)量約20萬噸，年產(chǎn)值近100億元，日本沼蝦養(yǎng)殖已成為我國農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)民增收的重要途徑之一。近年來，隨著工業(yè)化的快速推進(jìn)，日本沼蝦的棲息環(huán)境受到人為干擾、破壞和無序開發(fā)，使得其群體生長性狀結(jié)構(gòu)遭到了破壞，種質(zhì)資源質(zhì)量下降。到目前為，現(xiàn)有技術(shù)中很少有關(guān)于日本沼蝦的微衛(wèi)星標(biāo)記的相關(guān)研究。因此，開發(fā)針對(duì)分析日本沼蝦生長性狀遺傳的微衛(wèi)星引物，采用生物遺傳標(biāo)記的手段分析日本沼蝦生長性狀，了解日本沼蝦的種質(zhì)資源現(xiàn)狀，盡早研究其生長性狀以及利用微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行育種，這對(duì)其日本沼蝦種子資源的培育具有十分重要的社會(huì)價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是提供一種用于日本沼蝦生長性現(xiàn)狀分析的微衛(wèi)星標(biāo)記及其應(yīng)用，以提供一套日本沼蝦生長性狀結(jié)構(gòu)分析的微衛(wèi)星引物，為日本沼蝦種質(zhì)資源生長性狀現(xiàn)狀的調(diào)查研究以及分子生物學(xué)育種提供條件和基礎(chǔ)。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種用于日本沼蝦生長性狀分析的微衛(wèi)星標(biāo)記，包括微衛(wèi)星標(biāo)記GL01和微衛(wèi)星標(biāo)記GL02；所述微衛(wèi)星標(biāo)記GL01與額劍長性狀相關(guān)聯(lián)；所述微衛(wèi)星標(biāo)記GL02與尾扇長、第二步足長、第二步足長指節(jié)長性狀相關(guān)聯(lián)；

所述微衛(wèi)星標(biāo)記GL01上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

微衛(wèi)星標(biāo)記GL02上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示、下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本發(fā)明提供了所述的微衛(wèi)星標(biāo)記在日本沼蝦的生長性狀分析中的應(yīng)用，其采用的分析方法具體步驟包括：(a)提取待分析群體基因組DNA；(b)以所述DNA為模板，采用所述的微衛(wèi)星標(biāo)記引物進(jìn)行微衛(wèi)星標(biāo)記檢測；(c)進(jìn)行生長性狀相關(guān)分析。

分析方法中：所述的微衛(wèi)星標(biāo)記檢測是指采用2個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記引物對(duì)DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增體系為：

PCR擴(kuò)增體系如下：

擴(kuò)增程序?yàn)椋?/p>

其中55-58℃退火30s具體是指：微衛(wèi)星標(biāo)記GL01的退火溫度為58℃、微衛(wèi)星標(biāo)記GL02的退火溫度為55℃。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量比濃度為10％的聚丙烯酰胺凝膠分離，經(jīng)銀染染色，并記錄擴(kuò)增條帶結(jié)果。

本發(fā)明還公開了所述的微衛(wèi)星標(biāo)記在日本沼蝦分子育種中的應(yīng)用，具體方法：

(a)提取待分析樣本的基因組DNA；

(b)以所述DNA為模板，采用所述的微衛(wèi)星標(biāo)記GL01引物和微衛(wèi)星標(biāo)記GL02引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

PCR擴(kuò)增體系如下：

擴(kuò)增程序?yàn)椋?/p>

其中55-58℃退火30s具體是指：微衛(wèi)星標(biāo)記GL01的退火溫度為58℃、微衛(wèi)星標(biāo)記GL02的退火溫度為55℃。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量比濃度為10％的聚丙烯酰胺凝膠分離，經(jīng)銀染染色，并記錄擴(kuò)增條帶結(jié)果；

(c)在擴(kuò)增待測樣品時(shí)，若采用微衛(wèi)星標(biāo)記GL01引物能夠擴(kuò)增出BB(273bp，273bp)基因型，表明該待測樣品為與基因型BB相關(guān)聯(lián)的額劍較長的日本沼蝦品系，若采用微衛(wèi)星標(biāo)記GL02引物能夠擴(kuò)增出DB(248bp，242bp)和DD(248bp，248bp)基因型，表明該待測樣品為與基因型DB和DD相關(guān)聯(lián)的尾扇長、第二步足長、第二步足長指節(jié)長均較長的日本沼蝦品系。本發(fā)明提供的微衛(wèi)星標(biāo)記的引物具有PCR擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定的特點(diǎn)，其微衛(wèi)星標(biāo)記可以用于日本沼蝦生長性狀分析，可以輔助日本沼蝦分子標(biāo)記育種。

附圖說明

圖1為本發(fā)明中日本沼蝦形態(tài)參數(shù)測量部位示意圖。

圖2為實(shí)施例6中日本沼蝦野生群體中引物GL01擴(kuò)增的電泳圖譜。

圖3為實(shí)施例6中日本沼蝦野生群體中引物GL02擴(kuò)增的電泳圖譜。

具體實(shí)施方式

下面實(shí)施例用于進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。

實(shí)施例1 日本沼蝦群體生長性狀表型值的測量和記錄

選取河北白洋淀(BYD)、河北衡水湖(HSH)、山東微山湖(WSH)、江蘇洪澤湖(HZH)的日本沼蝦鮮活樣品各24只。分別對(duì)日本沼蝦進(jìn)行稱重和測量，測量指標(biāo)有體重、全長、體長、頭胸甲長、頭胸甲寬、頭胸甲高、腹部長、腹部寬、腹部高、尾扇長、尾扇寬、額劍長、第二步足長、第二步足長指節(jié)長14個(gè)可量性狀。日本沼蝦形態(tài)參數(shù)測量部位示意圖如圖1所示。測量精確到0.02mm。其中：

體質(zhì)量(BW)：整體之濕重，稱重前先用濾紙吸去體表水分；

全長(TL)：將第二觸角與身體拉直，其頂端與尾扇末端的距離；

體長(BL)：從眼柄基部到尾節(jié)末端之長；

額劍長(RL)：從眼柄基部到額劍前端的距離；

頭胸甲長(CL)：眼柄基部指頭胸甲后緣的距離；

頭胸甲寬(CW)：頭胸甲最寬處的直線距離；

頭胸甲高(CH)：頭胸甲最高處的直線距離；

腹部長(AL)：頭胸甲后緣至尾節(jié)末端的距離；

腹部寬(AW)：第一腹節(jié)的最大寬度；

腹部高(AH)：第一腹節(jié)的最大高度；

尾扇長(FL)：尾扇的最大長度；

尾扇寬(FW)：尾扇的最大寬度；

第二步足長(P2L)：將第二步足拉直，其基部到頂端的距離；

第二步足指節(jié)長(P2FL)：第二步足可動(dòng)指的直線距離。

實(shí)施例2 日本沼蝦野生群體肌肉總DNA的提取

采用海洋動(dòng)物基因組提取試劑盒提取肌肉總DNA，具體步驟如下：

(1)切取不多于30mg的組織材料，放入裝有200μL GA緩沖液的離心管中，渦旋振蕩15s。

(2)加入20μL Proteinase K(20mg/ml)溶液，渦旋混勻，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。在56℃放置，直至組織完全溶解，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠，再進(jìn)行下一步驟。

(3)加入200μL緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃放置10min，溶液應(yīng)變清亮，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。

(4)加人200μL無水乙醇，充分顛倒混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。

(5)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。

(6)向吸附柱CB3中加入500μL緩沖液GD(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

(7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

(8)重復(fù)操作步驟7。

(9)將吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

(10)將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200μL洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)離心2min，將溶液收集到離心管中。

(11)DNA的質(zhì)量檢測：取2μL基因組總DNA用質(zhì)量比濃度為1.5％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，經(jīng)EB染色、紫外凝膠成像系統(tǒng)成像后觀察DNA是否降解以及是否有蛋白質(zhì)殘留；另外，將提取的DNA樣品用NanoDrop 2000分光光度計(jì)測定其濃度，并以測得DNA濃度為參考，將基因組總DNA樣品統(tǒng)一稀釋為50ng/μL。

實(shí)施例3 微衛(wèi)星標(biāo)記引物的開發(fā)

(1)日本沼蝦購自白洋淀水產(chǎn)市場，在無菌條件下取其肌肉組織，提取肌肉組織總RNA，送生物公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)；利用MISA軟件對(duì)組裝得到的長度在1kb以上的unigenes進(jìn)行SSR的鑒定，識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)為：含二、三、四、五和六核苷酸類型的精確SSR標(biāo)記的最小重復(fù)數(shù)分別為9、6、5、4次，利用SSRHunter1.3進(jìn)行SSR標(biāo)記的篩選，保證序列的前后側(cè)翼有足夠的長度用于設(shè)計(jì)引物。以篩選到的SSR使用Primer Permier 6進(jìn)行引物設(shè)計(jì)；設(shè)計(jì)的主要參數(shù)設(shè)置為：引物長度18-25bp為最適長度，PCR產(chǎn)物片段長度范圍100-350bp，最適退火溫度55-65℃；GC含量一般在40-60％之間，盡量避免二級(jí)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。

(2)對(duì)所合成引物進(jìn)行梯度PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳EB染色初步篩選，并確定每對(duì)引物的最適退火溫度，選取能擴(kuò)增出單一清晰條帶的引物。

實(shí)施例4 EST-SSR分子標(biāo)記多態(tài)性的篩選

(1)隨機(jī)選取實(shí)施例2得到的24個(gè)樣本統(tǒng)一稀釋后的基因組總DNA為模板，采用實(shí)施例3篩選出的引物對(duì)其進(jìn)行PCR分型檢測，其擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件如下所示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量比濃度為10％的聚丙烯酰胺凝膠分離，經(jīng)銀染染色，并記錄擴(kuò)增結(jié)果；通過與pBR322DNA/Msp I marker分子量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比估算擴(kuò)增片段大小范圍。

PCR擴(kuò)增體系如下：

PCR反應(yīng)程序如下：

(2)根據(jù)步驟(1)PCR分型檢測結(jié)果及其位置確定基因型，利用Popgen32進(jìn)行群體遺傳分析，計(jì)算等位基因數(shù)(Number of Allele，A)、觀測雜合度(Observed Heterozygosity，Ho)和期望雜合度(Expected Heterozygosity，He)，用PIC-CALC軟件對(duì)各微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)信息含量進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見表1。

表1日本沼蝦微衛(wèi)星標(biāo)記引物及其擴(kuò)增的相關(guān)信息

實(shí)施例5 EST-SSR多態(tài)性引物在日本沼蝦群體中的基因分型及與生長性狀相關(guān)性分析

(1)采用所述的微衛(wèi)星引物進(jìn)行微衛(wèi)星標(biāo)記檢測：以步驟實(shí)施例2得到的統(tǒng)一稀釋后的全部基因組總DNA為模板，采用實(shí)施例4獲得的引物對(duì)其進(jìn)行PCR分型檢測，其擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件如下所示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量比濃度為10％的聚丙烯酰胺凝膠分離，經(jīng)銀染染色，并記錄擴(kuò)增結(jié)果；通過與pBR322 DNA/Msp I marker分子量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比估算擴(kuò)增片段大小范圍。

PCR擴(kuò)增體系如下：

PCR反應(yīng)程序如下：

所述55-58℃退火30s是指：微衛(wèi)星標(biāo)記GL01的退火溫度為58℃、微衛(wèi)星標(biāo)記GL02的退火溫度為55℃。

(2)根據(jù)步驟(1)PCR分型檢測結(jié)果及其位置確定基因型，根據(jù)條帶位置確定基因型，利用Popgen32進(jìn)行群體遺傳分析，計(jì)算等位基因數(shù)(Number of Allele，A)、觀測雜合度(Observed Heterozygosity，Ho)和期望雜合度(Expected Heterozygosity，He)，用PIC-CALC軟件對(duì)各微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)信息含量進(jìn)行計(jì)算。

(3)采用TESSLE2.1軟件中的GLM(general linear mode)模型進(jìn)行性狀和標(biāo)記之間的關(guān)聯(lián)分析，為避免群體結(jié)構(gòu)的存在影響關(guān)聯(lián)分析的準(zhǔn)確性，將日本沼蝦自然群體各個(gè)體的相應(yīng)Q值作為協(xié)變量，基于GLM模型利用實(shí)施例4獲得的引物對(duì)日本沼蝦擴(kuò)增數(shù)據(jù)和96個(gè)個(gè)體的14個(gè)表型性狀，包括體重、全長、體長、頭胸甲長、頭胸甲寬、頭胸甲高、腹部長、腹部寬、腹部高、尾扇長、尾扇寬、額劍長、第二步足長、第二步足長指節(jié)長進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。標(biāo)記的P值<0.01時(shí)則認(rèn)為與性狀存在關(guān)聯(lián)。其最終篩選出2對(duì)引物標(biāo)記序列如表1所示；關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表2。在顯著性P<0.01條件下，與額劍長顯著相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)為GL01，其表型解釋率為43.83％；與尾扇長、第二步足長、第二當(dāng)步足長指節(jié)長都與GL02位點(diǎn)顯著相關(guān)聯(lián)。變異解釋率分別為24.46％，33.53％和32.57％。

表2與性狀顯著關(guān)聯(lián)的SSR位點(diǎn)

實(shí)施例6 日本沼蝦生長性狀顯著相關(guān)的EST-SSR分子標(biāo)記在分子育種中的應(yīng)用

(1)選取河北白洋淀(BYD)、河北衡水湖(HSH)、山東微山湖(WSH)、江蘇洪澤湖(HZH)的日本沼蝦鮮活樣品各24只。分別對(duì)日本沼蝦進(jìn)行稱重和測量，測量指標(biāo)有尾扇長、額劍長、第二步足長、第二步足長指節(jié)長4個(gè)可量性狀。數(shù)據(jù)如表所示。

表3日本沼蝦群體生長性狀表型值

(2)基因組DNA的提?。壕唧w步驟同實(shí)施例2；

(3)利用分子標(biāo)記GL01和GL02對(duì)所挑選日本沼蝦群體進(jìn)行基因分型(方法同實(shí)施例5)，結(jié)果如圖2和圖3所示，圖2為引物GL01對(duì)96個(gè)日本沼蝦樣本DNA擴(kuò)增后的電泳圖譜；圖3為引物GL02對(duì)96個(gè)日本沼蝦樣本DNA擴(kuò)增后的電泳圖譜；

(4)逐個(gè)分析標(biāo)記時(shí)，剔除該位點(diǎn)基因型信息不全的樣本，樣本少于3的基因型缺少統(tǒng)計(jì)意義，一并去除。應(yīng)用SPSS22軟件，采用一般線性模型(General Linear Model,GLM)，以分子標(biāo)記GL01和GL02在日本沼蝦中的基因分型為自變量，生長典型性狀尾扇長；額劍長、第二步足長和第二步足長指節(jié)長為因變量，進(jìn)行標(biāo)記不同基因型間的多重比較。結(jié)果如表4和表5所示：標(biāo)記GL01在日本沼蝦群體中的基因分型有BB、BC、BE、CC、CE、CF和EE，其中基因型BB所占比例最大，為32.97％，且其形態(tài)性狀額劍長均值僅比稀有基因型EE小，大于其他基因型均值，為12.155，是生長性狀額劍長的相關(guān)聯(lián)基因型。GL01標(biāo)記核心序列(TAA)n為n＝13，片段大小為261bp；基因型BB指n＝17，片段大小為273bp。標(biāo)記GL02在日本沼蝦群體中的基因分型有CA、CB、CC、DA、DB、DC和DD，其中基因型CA，屬于稀有基因型，出現(xiàn)概率僅為4.0％，在實(shí)際育種工作中該基因型可不予考慮；基因型DD和DB的尾扇寬、第二步足長和第二步足長指節(jié)長3個(gè)生長性狀均值均大于其他基因型，基因型DD和DB是生長性狀尾扇寬、第二步足長和第二步足長指節(jié)長的相關(guān)聯(lián)基因型。GL02標(biāo)記核心序列(GAT)n為n＝11，片段大小為230bp，基因型DB指n＝15和17，片段大小為242bp和248bp；基因型DD指n＝17，片段大小為248bp。

表4微衛(wèi)星位點(diǎn)GL01不同基因型個(gè)體比較

表5微衛(wèi)星位點(diǎn)GL02不同基因型個(gè)體比較

(5)進(jìn)行分子標(biāo)記選擇育種，選擇微衛(wèi)星標(biāo)記GL01引物能夠擴(kuò)增出BB(273，273)基因型的個(gè)體，可以作為額劍較長的日本沼蝦品系親蝦進(jìn)行繁育生產(chǎn)；選擇微衛(wèi)星標(biāo)記GL02引物能夠擴(kuò)增出DB(248，242)和DD(248，248)基因型的個(gè)體，可以作為尾扇長、第二步足長、第二步足長指節(jié)長均較長的日本沼蝦品系親蝦進(jìn)行繁育生產(chǎn)。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北大學(xué)

<120> 一種用于日本沼蝦生長性狀分析的微衛(wèi)星標(biāo)記及其應(yīng)用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> GL01上游引物的核苷酸

<400> 1

accatcaatc actggatcac tc 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> GL01下游引物的核苷酸

<400> 2

tagaacttcc taactcgcct tg 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> GL02上游引物的核苷酸

<400> 3

cccaaatccc gtggtagtga 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> GL02下游引物的核苷酸

<400> 4

ggtagtaact gctgttgctt ct 22