本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，具體涉及利用與胰腺癌相關(guān)的lncRNALOC80054作為檢測胰腺癌的分子標記物及其用途。
背景技術(shù)：
：胰腺癌是一種消化道常見腫瘤，是預后最差的惡性腫瘤之一。根據(jù)最新流行病學調(diào)查，胰腺癌位居歐美等發(fā)達國家惡性腫瘤死亡率第四位，全球每年約250萬人死于胰腺癌。近20年來我國胰腺癌的發(fā)病率持續(xù)增高，目前胰腺癌位居惡性腫瘤死亡率第五位。在胰腺癌的治療中，早期診斷困難，其起病隱匿，缺乏典型臨床癥狀，且預后極差，胰腺癌侵襲性強，惡性度高，外科手術(shù)、化療及放療等手段的療效均不盡人意，其術(shù)后1年生存率不到20％，5年生存率僅為4％，早期確診率低和術(shù)后轉(zhuǎn)移是胰腺癌死亡率高的主要原因。因此，胰腺癌的早期診斷和早期治療是提高和改善胰腺癌預后的關(guān)鍵，尤其是發(fā)現(xiàn)一種特有的、可用于早期診斷和預后的標記物和靶向分子，對于戰(zhàn)勝胰腺癌具有重要意義，成為目前國內(nèi)外腫瘤專家的研究熱點。近年來一些研究表明非編碼RNA(ncRNAs)是一類具有重要生物學功能的RNA，參與基因組印記、染色體沉默、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程，在細胞分化和發(fā)育、基因轉(zhuǎn)錄和翻譯、遺傳和表觀遺傳等生命活動中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用。越來越多的權(quán)威研究證實lncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著抑制或促進腫瘤的作用，在調(diào)控腫瘤細胞增殖、凋亡、細胞周期、侵襲轉(zhuǎn)移能力等方面，均具有十分重要作用。目前己有較多l(xiāng)ncRNAs被證實在包括乳腺癌、前列腺、黑色素瘤、肝癌、結(jié)腸癌、膀胱癌等在內(nèi)的人類多種腫瘤中存在差異表達并執(zhí)行重要的調(diào)控功能。目前尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于LOC80054在胰腺癌中作用的相關(guān)研究報道。由于胰腺癌發(fā)病隱匿、進展快且預后極差，本領(lǐng)域仍需一種準確、靈敏、特異性強的標記物用于輔助胰腺癌的診斷或預后，因此新的胰腺癌標記物的開發(fā)成為迫切的需求。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了實現(xiàn)胰腺癌的早期發(fā)現(xiàn)，早期干預，本發(fā)明的目的在于提供一種新的與胰腺癌相關(guān)的分子標記物。本發(fā)明的還一目的是提供LOC80054在胰腺癌診斷或預后中的用途。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供一種檢測胰腺癌的分子標記物，所述分子標記物為LOC80054，其核苷酸序列為SEQIDNO:1所示。本發(fā)明經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)所述LOC80054在胰腺癌組織或血清中高表達，顯示LOC80054與胰腺癌的腫瘤發(fā)生、發(fā)展存在著密切的相關(guān)性。優(yōu)選的，所述LOC80054在胰腺癌組織或血清中的表達水平與對應癌旁組織或正常胰腺組織中的比率為1.5倍以上的為高表達。進一步地，本發(fā)明提供了一種胰腺癌標記物LOC80054的檢測試劑盒，所述試劑盒含有檢測胰腺癌相關(guān)的分子標記物LOC80054的表達量的試劑。優(yōu)選的，所述試劑盒包括一對特異擴增LOC80054的引物。優(yōu)選的，所述引物如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示。進一步地，本發(fā)明提供了所述分子標記物或所述試劑盒在胰腺癌診斷或預后中的用途。優(yōu)選的，所述診斷或預后為診斷、療效評估或轉(zhuǎn)移復發(fā)。本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明公開了一種與胰腺癌相關(guān)的lncRNALOC80054，并進一步證實LOC80054在胰腺癌組織中或血清中高表達。利用LOC80054作為分子標記物檢測胰腺癌不僅能夠快速有效的做到早期檢測，而且為基因治療、藥物治療等臨床應用提供了治療靶點和重要依據(jù)附圖說明圖1為LOC80054在胰腺癌組織和癌旁組織中的表達比較。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用的試劑可以商業(yè)購買得到。本發(fā)明的發(fā)明人，對于從確診的胰腺癌患者采集的癌組織及對應的癌旁組織待測樣品，通過使用RNA提取和定量PCR對胰腺癌組織中的特異性基因的表達水平進行檢測，與對應的癌旁組織相比，采用統(tǒng)計學分析，顯示LOC80054在胰腺癌組織與對應的癌旁組織中存在顯著的表達差異，LOC80054在胰腺癌組織中的總體表達水平高于癌旁組織，提示LOC80054可能具有很好的輔助診斷價值，可成為胰腺癌標志物。本發(fā)明的LOC80054基因是在本發(fā)明之前的已知基因，其基本信息如下：Genbank登錄號：GeneID:80054，來源于人類基因組，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本發(fā)明采用RT-PCR方法檢測上述lncRNA在胰腺癌組織或血清中高表達。熒光定量PCR法是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應過程，結(jié)合相應的軟件可以對產(chǎn)物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。熒光定量PCR的出現(xiàn)，極大地簡化了定量檢測的過程，而且真正實現(xiàn)了絕對定量。多種檢測系統(tǒng)的出現(xiàn)，使實驗的選擇性更強。自動化操作提高了工作效率，反應快速、重復性好、靈敏度高、特異性強、結(jié)果清晰。本發(fā)明的LOC80054基因的核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)已公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA作為模板，擴增而得到有關(guān)序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次擴增，然后再將多次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。實施例1基于TCGA數(shù)據(jù)庫信息進行胰腺癌的生存分析篩選相關(guān)基因1、臨床信息篩選檢索TCGA數(shù)據(jù)庫中的胰腺癌患者臨床信息，截至2015年12月10日，TCGA數(shù)據(jù)庫中總共記載了185例胰腺癌臨床病例。對這些數(shù)據(jù)進行篩選，共有160例患者納入研究。篩選時排除具有其他惡性腫瘤病史、曾接受過放療或化療的患者，同時納入研究的患者需含臨床信息和mRNA數(shù)據(jù)。2、生存期研究樣本統(tǒng)計160例胰腺癌患者生存時間的統(tǒng)計結(jié)果如下表所示:表1160例胰腺癌患者生存時間統(tǒng)計生存期時間t(年)期初進入研究人數(shù)期內(nèi)死亡人數(shù)期內(nèi)失訪人數(shù)t<116027741≤t<25922152≤t<3221023≤t<410224≤t<560.15≤t5413、mRNA表達數(shù)據(jù)生存分析研究方案(1)對胰腺癌高通量mRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)檢索、數(shù)據(jù)下載及樣本挑選和歸類。由下載的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)通過生物信息學分析篩選得出與胰腺癌生存時間相關(guān)的mRNA。(2)用Cytoscape軟件構(gòu)建由mRNAs組成的生物信息網(wǎng)絡，通過DAVID對生物信息網(wǎng)絡中與胰腺癌生存時間相關(guān)的mRNA進行GO分析和Pathway分析。4、胰腺癌mRNA表達數(shù)據(jù)的生存分析結(jié)果將胰腺癌組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下載后，去除readcount＝0小于20％的mRNA后用做下一步分析，包括17100個mRNA。提取mRNA基因表達量和胰腺癌TCGA數(shù)據(jù)庫生存時間數(shù)據(jù)，采用survival包的coxph函數(shù)完成，經(jīng)單因素Cox回歸分析，篩選得到單因素Cox回歸中p值<0.05的mRNA有580個，包括328個風險性mRNA和252個保護性mRNA。為了更好的研究與生存時間相關(guān)的mRNA的功能，我們通過GORILLA和GeneCodis軟件對胰腺癌生存時間相關(guān)的mRNA進行GO功能富集和KEGG通路富集，篩選標準皆為FDR<0.05。其中LOC80054的p值為0.004167，HR>1，為胰腺癌風險性mRNA，現(xiàn)有研究中并沒有關(guān)于上述基因和胰腺癌相關(guān)的報道。LOC80054，又名CEBPA-AS1，全稱CEBPAantisenseRNA1，屬于lncRNA(longnon-codingRNA，長鏈非編碼RNA)，位于第19號染色體上，全長2281bp，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。實施例2RT-PCR檢測LOC80054在胰腺癌和癌旁組織中的表達1、材料1.1組織病理標本收集經(jīng)外科手術(shù)切除、并經(jīng)病理學檢查確診的160例胰腺癌患者組織及對應癌旁組織標本，癌旁組織定義為距腫瘤邊緣3cm以外的胰腺組織。取樣來源于北京協(xié)和醫(yī)院2012年10月到2015年12月期間確診為胰腺癌并接受外科術(shù)切除的病人。手術(shù)切除胰腺癌組織后在病理科醫(yī)生的指導下立即取胰腺癌及癌旁組織放入液氮，編號后置-80℃低溫冰箱保存。1.2納入標準如下：(1)接受外科手術(shù)切除的病例；(2)術(shù)后病理確診為胰腺癌并有相應的癌旁組織，癌旁組織定義為距腫瘤邊緣3cm以外的胰腺組織。(3)病人均未接受過術(shù)前新輔助治療。2、試驗方法2.1對組織樣本進行總RNA提取依據(jù)編號分別對胰腺癌組織及對應的癌旁組織進行總RNA提取，100例病人編號100個樣本和100個對照，每例病人的胰腺癌組織作為樣本，對應的癌旁組織作為對照。采用Reagent(invitrogen，貨號15596-018)進行樣本RNA提取，實驗操作按產(chǎn)品說明書進行，具體操作如下：收集樣本后凍存于液氮，取出后把組織樣本放入已預冷的研缽中進行研磨，待組織樣本成粉末狀后：(1)入1mLTrizol，室溫保存5分鐘；(2)加氯仿0.2mL，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫下放置5分鐘-10分鐘；(3)12000rpm高速離心15分鐘后吸取上層水相(吸70％)到另一新離心管管中，注意不要吸到兩層水相之間的蛋白物質(zhì)。移入新管，加入等體積的-20℃預冷異丙醇，充分顛倒混勻，置于冰上10分鐘；(4)12000rpm高速離15分鐘后小心棄掉上清液，按1mL/mLTrizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振蕩混合，4℃下12000rpm高速離心5分鐘；(5)棄去乙醇液體，室溫下放置5分鐘以充分晾干沉淀，加入DEPC處理過的水溶解沉淀；(6)用Nanodrop2000紫外分光光度計測量RNA純度及濃度，凍存于-80℃。RNA質(zhì)量判定標準：RNA樣本的OD260/OD280值為1.7-2.2之間；總RNA電泳圖譜有清晰的28S、18S條帶；70℃水浴保溫1小時后的電泳圖譜與水浴保溫前的圖譜無明顯差異。2.2RNA樣品的質(zhì)量分析RNA提取后瓊脂糖凝膠電泳，從電泳結(jié)果可以初步判定提取的RNA樣品質(zhì)量合格與否，是否可以用于進一步的轉(zhuǎn)錄組分析。進而通過NanoDrop1000分光光度計檢測RNA樣品的提取情況，RNA-seq測序的樣品要求：OD260/OD280為1.8-2.2。2.3逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA采用IIIReverseTranscriptase(invitrogen，貨號18080-044)進行cDNA反轉(zhuǎn)錄，實驗操作按產(chǎn)品說明書進行，具體操作如下：使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對lμg總RNA進行逆反錄合成cDNA。采用25μL反應體系，每個樣品取1μg總RNA作為模板RNA。獲得的cDNA保存放-20℃冰箱備用。2.4Real-TimePCR2.4.1儀器及分析方法用ABI7500型熒光定量PCR儀，采用2-△△Ct法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析。2.4.2引物設(shè)計采用在線引物設(shè)計軟件，基因序列參照NCBI:NR_026887.1(LOC80054)，內(nèi)參選GAPDH，引物設(shè)計后由invitrogen公司合成。具體引物序列如表2所示：表2引物序列2.4.3具體操作過程(一)反應體系：用PowerGreenPCRMasterMix(invitrogen，貨號4367659)進行擴增，實驗操作按產(chǎn)品說明書進行。擴增程序為：95℃5min，(95℃15sec，60℃45sec，72℃35sec)×40個循環(huán)。表3RealTime反應體系組分加入量2×mix10μL上游引物(10μM)0.5μL下游引物(10μM)0.5μL模板2μL加入滅菌蒸餾水至25μL(二)引物篩選將各樣本cDNA混合后，以此為模板進行5倍梯度稀釋，稀釋后樣品各取2μL作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進行擴增，同時在60-95℃進行融解曲線分析，根據(jù)擴增效率高和溶解曲線單峰原則進行引物篩選。(三)樣品RealTime-PCR檢測將各樣品cDNA10倍稀釋后取2μL作模板，分別對目的基因引物和內(nèi)參基因引物進行擴增。同時在60-95℃進行溶解曲線分析。3、數(shù)據(jù)處理及判斷標準實時定量PCR擴增曲線拐點清楚，擴增曲線整體平行性好，表明各反應管的擴增效率相近，極限平而無上揚現(xiàn)在，曲線指數(shù)期斜率較大，說明擴增效率較高；樣本擴增產(chǎn)物溶解曲線都是單峰，說明擴增產(chǎn)物只有一條，為特異性擴增；根據(jù)qRT-PCR的相對定量公式：2-ΔΔCt×100％，比較LOC80054在胰腺癌組織和癌旁組織中的表達水平。判斷標準定為：LOC80054在胰腺癌組織中的表達水平占對應癌旁組織的比率為1.5倍以上的為高表達。4、統(tǒng)計學分析采用統(tǒng)計學軟件SPSS17.0，統(tǒng)計學顯著性差異定義為P＜0.05。應用Mann–WhitneyU檢驗比較LOC80054在胰腺癌組織與癌旁正常胰腺組織中表達的差異。根據(jù)判斷標準，LOC80054在胰腺癌組織中的總體表達水平高于癌旁組織(如圖1所示)，p＜0.001，提示LOC80054可能具有很好的輔助診斷價值。實施例3試劑盒的制備基于實施例2得到的引物組，組裝本發(fā)明所述LOC80054的檢測試劑盒，所述試劑盒包括特異擴增LOC80054的引物對如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示，和特異擴增管家基因(GAPDH)的引物對如SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示；還包括SYBRGreen聚合酶鏈式反應體系，如PCR緩沖液、SYBRGreen熒光染料、dNTPs。所述PCR緩沖液的成分為25mMKCl，2.5mMMgCl2，200mM(NH4)2SO4；還包括胰腺正常組織cDNA：作為陰性對照與檢測樣本cDNA共同定量PCR檢測，每個反應體系使用與檢測樣本cDNA相同量。通過對引物濃度和退火溫度的優(yōu)化，最終確定反應體系如表4所示：表4PCR反應體系組分加入量SYBRGreen聚合酶鏈式反應體系12.5μL上游引物(10μM)0.5μL下游引物(10μM)0.5μL模板cDNA2.0μL加入滅菌蒸餾水至25μL最佳反應條件為：95℃預變性5min，(95℃變性15sec，60℃退火45sec，72℃延伸35sec)×40個循環(huán)，72℃延伸15min。實施例4LOC80054檢測試劑盒評估胰腺癌治療效果1、病例樣本選取10例待胰腺癌患者，取樣來源于北京協(xié)和醫(yī)院2012年10月到2015年12月期間治療的病人。獲取所有研究對象治療前的胰腺癌組織樣本，檢測組織樣本中LOC80054的表達量，療程結(jié)束后再采集患者胰腺癌組織，檢測組織樣本中LOC80054的表達量。本研究的所有臨床樣本，均對患者進行知情告知并經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會通過。2、方法檢測LOC80054的表達量的方法同實施例3。3、結(jié)果檢測結(jié)果的處理方法也同實施例3，通過溶解曲線分析和電泳確定目的條帶，ΔΔCt法進行相對定量，并根據(jù)治療前后LOC80054表達量的變化評估治療效果。判斷標準定為：治療后LOC80054表達量與治療前相比，無變化或上升的，判斷為治療無效；治療后LOC80054表達量與治療前相比下降小于20％，判斷為治療無顯著療效；治療后LOC80054表達量與治療前相比下降大于或等于20％，判斷為病情改善；治療后LOC80054表達量與治療前相比下降大于或等于60％，判斷為治療效果顯著。10例患者通過LOC80054檢測試劑盒的評估結(jié)果以及醫(yī)生根據(jù)臨床癥狀評估的這10例患者胰腺癌的治療效果如表5所示。表5LOC80054檢測試劑盒評估胰腺癌療效結(jié)果患者編號治療前后LOC80054表達量的變化臨床評價1降低45％改善2升高10％無效3降低63％改善4降低17％無效5降低85％有效6降低65％無效7升高15％無效8降低35％無效9降低10％無效10降低67％改善由表5可知，試劑盒評估結(jié)果是10例胰腺癌患者中，1例有治療效果，5例治療后病情得到改善，其余4例無療效，與臨床判斷結(jié)果相比符合率達93％。實施例5LOC80054檢測試劑盒監(jiān)控胰腺癌轉(zhuǎn)移復發(fā)1、病例樣本選取5例療程結(jié)束的胰腺癌患者進行跟蹤隨訪，取樣來源于北京協(xié)和醫(yī)院2012年10月到2015年12月期間治療的病人。治療后六周首次采集患者血清，檢測血清中LOC80054的表達量，以后每三個月檢測一次，跟蹤九個月，共檢測四次。本研究的所有臨床樣本，均對患者進行知情告知并經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會通過。2、方法檢測LOC80054的表達量的方法同實施例3。3、結(jié)果檢測結(jié)果的處理方法也同實施例3，通過溶解曲線分析和電泳確定目的條帶，ΔΔCt法進行相對定量，并根據(jù)LOC80054在胰腺癌血清中相對表達量來判斷胰腺癌患者是否發(fā)生轉(zhuǎn)移復發(fā)(相對表達量為胰腺癌血清中LOC80054的表達量與試劑盒中正常胰腺組織中LOC80054的表達量的比值)。判斷標準為：LOC80054胰腺癌血清中的相對表達量大于或等于1.5判斷為轉(zhuǎn)移復發(fā)；LOC80054胰腺癌血清中的相對表達量小于1.5，判斷為未發(fā)生轉(zhuǎn)移復發(fā)。5例患者通過LOC80054檢測試劑盒的判斷結(jié)果以及9個月后醫(yī)生根據(jù)臨床癥狀判斷這5例患者胰腺癌是否轉(zhuǎn)移復發(fā)的結(jié)果如表6所示。表6LOC80054檢測試劑盒監(jiān)控胰腺癌轉(zhuǎn)移復發(fā)結(jié)果由表6的結(jié)果所示，5例胰腺癌患者中有2例治療后出現(xiàn)轉(zhuǎn)移復發(fā)，其余4例無進展生存。LOC80054檢測試劑盒檢測結(jié)果與臨床診斷一致，并且使用LOC80054檢測試劑盒監(jiān)控胰腺癌，可早于臨床癥狀和體征發(fā)現(xiàn)，為醫(yī)生提前進行干預提供參考。綜上所述，LOC80054可以作為診斷、評估或監(jiān)控胰腺癌的標記物，靈敏度高、特異性強，能夠用于胰腺癌的診斷或預后。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。序列表<110>葉偉亮<120>LOC80054在胰腺癌診斷或預后中的用途<130>P16yxa69<160>5<170>PatentInversion3.5<210>1<211>2281<212>DNA<213>基因序列<400>1cacggccgggagcccaggagtatcccgaggctgcacggggtaggggtggggggcggaggg60cgagtcttggtcttgagctgctggggcgcggattctctttcaaagccagaaccaggcctg120tcccggacccgcgtcccggggaggctgcagcgcagagcagcggggctggggccggtgggg180ggccgtttgggacgcgcggagaggtcctgagcgcggtggctctgcgtctcctagctctga240tctccaggctacccctgtgattccgcgcagaggtacctctcggaggacgccggggtccca300tgggcggcgccgcgcagggcgctaggaccccgcggggagcggaggcggcctcggcccggg360agcctggaggacctggccggtcgatccgcccgggctggaaaactttctttataattactt420ctccaggtcggagcgcgcggcttgctaggcgcgcggggccggcgctgttacccggcgtgg480agtcgccgattttttttcctgcgggaccgcggggccccccagactagcggagctggacgc540cggggcgagcacggggaggggcgcaccgagggaggagacaaacttaactctggggccggg600attccgaggcgggggccgcagccctcgaggcccgaagccaccgcttcctcccccgcctcc660ccattcaggtgggcgccaacggcgggagcgagggtgtccaggccgccgggctgccaggtc720cgagcacgcacagggagaactctgcccagtggttcgccgggcgctgtagtccccgggatc780ctagggaccgaggcggccaggccctggggccccttgagtgcggcagctaatgctctcacc840gcggcgggggaaggagcttgccaccgagacccccagccacgtgcgtccctcgcattcttt900accggggccggggtggcggctacggaccgtcagctgggcccagatggagtcttgggagcc960ctcaagtgtctcctgtccttgcccgcgccgcccctcgccactggcgctgaggcctgacgc1020cgcctgcgtcccggctagaggcgcgcttgcctacaggtgagggaagacccccttcaccga1080cagtggccttaggcctggcaaggcgccacgacccgcccaggagccccggagggggcacag1140ctaaaaacaccgctggagagccccgagcttccacgacgatcgcagtaaagaagcagtttc1200tctgggcaacgcacactgcgctttaatcaagttcctattcaacatagtcccagtgattaa1260tagcccaactgcttcgttttcggtccagagctcataaacaagatatttttagcttgacgc1320ttttggacgggagggagtaaaaaccagatacgttaaataaatatcccgatgtgagccgga1380gagctgcttgctgagccaaatgcaggacccattcatatagcattcacctgtggagggaga1440cctggacggaaatcaaaaagcaccaagagcgatttgcgtttttttctgcggtgctaaaac1500taatggcttttcctacctaggaacaaagaaacgccactgtacatgcacggttcccggcct1560gtggagttgtgggaggaaggcgatgtctggccttttttgcacagctgctgttgcctgccc1620agagatcgggaactctgccccgtaggactggaagaaacctcagtaatgggaataagactt1680tgtccaatagggggctgatgaatgtgtgggggcgacaatggcaaggagtgggactcccgg1740cccggggttcgccaaccccaggggccacaggtcctcctacaattgaaccagaattcaccc1800acccgggcctgccctgtgcagggtgccgagagcccagggatgcatgagagggtggctcct1860gcctctgggaactgggacagtgggagagacggataagttgtcacacagaggctgctggga1920ggaaggaggagacagaaggagtaggggatgggacttcattcattcatcaaatgcacacga1980ggcacaaatgggaatcaagggtggatgtgctgtgatgaagagaagtcctgccctgaacaa2040ggtggcgctgtggaggaggcagagatcagatttgtctgcggaggtgttatggactgaact2100gtgtccctgccccaaattcctatgttgaaggcctaacccccatgtgactgtatttggaga2160taaggcttttaggaagtcattaaagtgagatgatgtcataaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa2220aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa2280a2281<210>2<211>363<212>DNA<213>人工序列<400>2actgcttcgttttcggtcca20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3gaatgggtcctgcatttggc20<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>4ggagcgagatccctccaaaat21<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>5ggctgttgtcatacttctcatgg23當前第1頁1 2 3