本發(fā)明屬于染色體制片技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種植物染色體的滴片制備方法。

背景技術(shù)：

染色體制片是進行染色體形態(tài)觀察、原位雜交和染色體分離等的基礎(chǔ)。染色體制片常用的方法主要有壓片法和涂片法。但壓片法和涂片法主要存在以下缺點：（1）實驗藥品毒性較大。壓片法和涂片法一般以α-溴奈、8-羥基喹啉和秋水仙素等作為預處理的溶液，藥品致癌性強；（2）處理時間偏長，一般預處理需要3-5個小時、固定處理1-2 天，從取材到制片一般需要1.5-2.5天，處理時間長。且固定液現(xiàn)配現(xiàn)用，較為麻煩；（3）壓片法和涂片法染色體的分散度有限，不便于對染色體進行相關(guān)操作（如原位雜交、單個染色體分離及染色體顯微切割）；（4）壓片法和涂片法容易破壞染色體，分離得到的染色體不完整。壓片時會使用一定的力度使原生質(zhì)體分開，這使細胞緊緊的貼合于蓋玻片或載玻片，若要分離單個的細胞或者染色體就要進行揭片，揭片時不能使染色體完全附著于蓋玻片或者載玻片，得到的是不完整的染色體。而涂片法在用解剖針將根尖細胞涂于玻片上時很容易破壞染色體，在烤片時高溫也會破壞DNA。而隨著分子生物學及細胞生物學的發(fā)展，在研究中，許多實驗需要對染色體進行相關(guān)操作，如熒光原位雜交、單個染色體分離及染色體顯微切割等，現(xiàn)有的染色體制片方法不適用于這些研究，存在一定的缺陷。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：針對現(xiàn)有的染色體制片方法實驗藥品毒性大、處理時間偏長、分散度有限且容易破壞染色體，不適用于現(xiàn)在分子和細胞生物學對染色體制片要求的技術(shù)問題，而提供一種毒性低、制片時間短、染色體分散度和完整性較好、適用于原位雜交、染色體分離和顯微切割的植物染色體的滴片制備方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種植物染色體的滴片制備方法，先將植物器官置于一氧化二氮氣體中進行預處理，隨后采用固定液對預處理后的植物器官進行固定處理，再采用酶對植物器官的細胞壁進行酶解，將酶解后的植物器官破碎并配制成細胞懸液，將細胞懸液滴加到載玻片或蓋玻片上，制成植物染色體標本。本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中植物染色體制片預處理時使用的試劑毒性大，且對染色體分散效果不好的技術(shù)問題，特通過研究創(chuàng)造性地提出采用一氧化二氮對植物進行預處理，一氧化二氮可以破壞植物紡錘絲，進而可以增加中期染色體數(shù)目，便于后期進行染色體觀察，且采用這樣的預處理方法處理后的植物細胞經(jīng)酶解后，染色體更容易分散開，進而本發(fā)明采用滴片的方式制片，不需要施加過多的外力，僅靠滴加時的自然重力就可以使細胞破裂，獲得呈圓形或橢圓形分散、分布均勻、染色體交叉少、分散度好的染色體標本，更容易進行單個染色體或細胞分離等生物學研究工作，克服了現(xiàn)有染色體制片方法中壓片法容易使細胞緊貼于載玻片上進而無法進行得不到完整的染色體，涂片法使用的解剖針容易破壞染色體，且在烤片時高溫也會破壞DNA結(jié)構(gòu)，不利于染色體觀察的技術(shù)問題。

進一步，所述滴片方法具體包括如下步驟：

1）將植物器官用水清洗后，置于壓力為0.5~1個大氣壓的一氧化二氮氣體中進行預處理2~3h；

2）將步驟1）預處理后的植物器官用固定液固定處理2~3h；所述固定液為乙醇；

3）將步驟2）固定處理后的植物器官用水清洗后，置于復合酶液中在37~42℃下酶解2~3h；其中，所述復合酶液為將質(zhì)量濃度為4-6 %的纖維素酶溶液和質(zhì)量濃度為4-6%的果膠酶溶液按照1：1的體積比混合制得；

4）使用乙醇對步驟3）酶解后的植物器官清洗至少2次；

5）對步驟4）清洗后的植物進行至少2次離心清洗，每一次離心清洗步驟為向植物器官中加入乙醇并以5000~6000 r/min的離心速度離心1~5 min后棄去上清液；

6）向步驟5）離心清洗后的植物器官中加入醋酸溶液并進行破碎處理，向破碎處理后的植物器官中補加醋酸溶液至植物器官與醋酸溶液的質(zhì)量體積比為1 g:50~100 mL，制得細胞懸液；

7）將步驟6）制得的細胞懸液滴加到載玻片或蓋玻片，制得所述植物染色體標本。

具體地，本發(fā)明將植物器官置于一氧化二氮氣體中進行預處理，一氧化二氮氣體破壞了紡錘絲，增加中期染色體數(shù)目，且使處理后的細胞經(jīng)酶解后，染色體更容易分散開，對預處理后的染色體進行固定處理，使植物器官的細胞保持原有的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，且使細胞內(nèi)各種物質(zhì)成分產(chǎn)生不同的折光率，便于后續(xù)觀察和鑒定，固定處理后采用纖維素酶和果膠酶復合酶液，對植物器官的細胞壁進行酶解，對酶解后的植物器官采用醋酸等軟化溶劑對植物器官進行軟化處理后進行破碎，配制成細胞懸液，將配制的細胞懸液采用滴加的方式制片，滴片時利用自然的重力使細胞破裂，獲得整體呈圓形或橢圓形、分散度好的染色體標本，減少了對染色體的傷害，得到了比較完整的染色體，便于進行細胞學鑒定、永久裝片的制作、原位雜交、顯微切割和顯微分離等研究。

作為優(yōu)化，步驟2）中所述固定液為質(zhì)量濃度90%的醋酸水溶液。本發(fā)明采用質(zhì)量濃度為90%的醋酸水溶液作為固定液，不僅對植物染色體具有良好的保持原有形態(tài)和結(jié)構(gòu)的作用，且采用該固定液進行固定處理時間短，配制該固定液也更加方便，操作更加簡單快捷。

作為優(yōu)化，步驟3）中所述纖維素酶溶液的溶劑為pH4.6的檸檬酸鈉緩沖液，所述果膠酶溶液的溶劑為pH4.6的檸檬酸鈉緩沖液。本發(fā)明采用檸檬酸鈉緩沖液作為溶劑，可以保證酶解處理過程中酶解液的pH不易隨著反應的進行而改變，維持了纖維素酶和果膠酶在酶解過程中始終處于最適反應pH范圍內(nèi)，使得酶解的效率更好，且本發(fā)明緩沖液的pH為酶的最適反應pH，保證酶解更加成分，細胞壁的酶解效果更好。

作為又一優(yōu)化，步驟7）中從載玻片或蓋玻片上方20~30 cm高度處將所述細胞懸液滴加到載玻片或蓋玻片上。從距離載玻片這樣的高度處將細胞懸液滴加，既避免了高度太矮而使得懸液在空中停留時間過短，重力不足以使細胞破裂或破碎不完全的問題，也避免了高度過高操作不方便且容易將滴加的懸液噴濺到載玻片以外區(qū)域，而使得載玻片上沾染細胞懸液過少的問題。

作為優(yōu)化，步驟4）和步驟5）中采用體積濃度為70%的乙醇水溶液對植物器官進行清洗和離心清洗。采用這樣濃度的乙醇溶液進行清洗，既保證了清洗的效果好，又避免了使用濃度過大的乙醇溶液對染色體結(jié)構(gòu)和形態(tài)造成不良影響的問題。

作為又一優(yōu)化，所述植物器官為植物根尖。有絲分裂多發(fā)生在植物的根尖細胞，在細胞遺傳學研究中，研究根尖細胞的染色體最具有意義，植物根尖染色體多且密集，而采用現(xiàn)有的制片方法很難獲得完整的根尖細胞染色體、觀察存在問題，本發(fā)明方法首先能夠保持根尖細胞內(nèi)染色體原有的狀態(tài)和形貌，且分離出的植物根尖染色體分散度好、無交叉、形態(tài)完整，可以更加準確地觀察植物根尖有絲分裂的性質(zhì)。

作為另一優(yōu)化，所述植物器官為玉米根尖。本發(fā)明對玉米根尖染色體的分散效果尤佳，更適用于對玉米根尖染色體的狀況進行觀察。

相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下有益效果：

1、本方法采用一氧化二氮對植物器官進行預處理，可以破壞植物紡錘絲，進而可以增加中期染色體數(shù)目，便于后期進行染色體觀察，且采用這樣的預處理方法處理后的植物細胞經(jīng)酶解后，染色體更容易分散開，進而本發(fā)明采用滴片的方式制片，不需要施加過多的外力，僅靠滴加時的自然重力就可以使下破裂，獲得呈圓形或橢圓形分散、分布均勻、染色體交叉少、分散度好的染色體標本，更容易進行單個染色體或細胞分離等生物學研究工作。

2、本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)使用秋水仙素等有毒試劑來作為預處理試劑而言，毒性較小，能減少實驗對研究人員的傷害；且本發(fā)明相對于現(xiàn)有制片方法而言，預處理時間只需要2個小時、固定時間也只需要2個小時，從剪取根尖到顯微鏡觀察，可在一天內(nèi)完成，相對壓片法和涂片法節(jié)約1-1.5天，節(jié)省了處理時間，處理過程更加簡單快捷。

3、本發(fā)明采用滴片法制備染色體標本，利用自然的重力使細胞破裂，減少了對染色體的傷害，獲得的分裂相較常規(guī)制片法染色體呈圓形或橢圓形分散，分布均勻，染色體交叉少，分散度較好，能夠獲得比較完整的染色體，可制備質(zhì)量穩(wěn)定、染色清晰、分散度較好的染色體裝片，制備的染色體裝片可用于細胞學鑒定、永久裝片的制作、原位雜交、顯微切割和顯微分離等；且本發(fā)明可以通過調(diào)整使用材料的濃度和滴片的高度，控制染色體分散的程度，根據(jù)所需要進行研究的相關(guān)要求來制備不同分散程度的染色體標本，適用面更廣。

4、本發(fā)明使用的試劑為通用試劑，易于獲得，操作過程中也不用使用專用實驗設備，操作局限小，且使用的試劑毒性較低，對操作人員的健康威脅小，具有良好的應用前景。

附圖說明

圖1為DP17玉米染色體滴片鏡檢圖；

圖2為DP46玉米染色體滴片鏡檢圖；

圖3 為DP47玉米染色體滴片鏡檢圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例和說明書附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。本實施案例在以本發(fā)明技術(shù)為前提下進行實施，現(xiàn)給出詳細的實施方式和具體的操作過程來說明本發(fā)明具有創(chuàng)造性，但本發(fā)明的保護范圍不限于以下的實施例。

下述實施例中使用的儀器有GXA智能光照培養(yǎng)箱，微量移液器（量程100μL），電爐，載玻片，尼康倒置顯微鏡（型號TE2000）。

實施例1 對DP17玉米品種進行染色體滴片制備：

（1）將DP17玉米種子放于裝滿細沙的磁盤中，置于人工氣候箱中，28℃培養(yǎng)。待根長至1.5 cm時，剪取根尖，放入5 mL離心管；

（2）剪1.5cm根放入ddH₂O雙蒸水中洗凈，將根蘸濕后裝入0.5 mL EP管中（保持蓋打開），讓濕潤的根貼于管壁，但水不能成股流下；

（3）將EP管放入笑氣（N₂O）處理裝置的處理室中處理2h；笑氣處理裝置將笑氣罐中的笑氣解壓后通入處理室中，使處理室內(nèi)N₂O 的壓力為0.5個大氣壓，將根尖放于處理室中0.5個大氣壓處理2 h，目的是進行預處理，利用笑氣破壞紡錘絲，增加中期染色體數(shù)目，另外經(jīng)笑氣處理后的根尖細胞經(jīng)酶解后，染色體更容易分散開來。

（4）向EP管中加入質(zhì)量濃度90%的醋酸水溶液，固定2 h；

（5）將根從醋酸中取出，用ddH₂O洗2-3次；

（6）將根置于載玻片上吸干水，切下根尖乳白色分生區(qū)，置于酶液PCR管中，37℃酶解2 h；酶液由纖維素酶溶液和果膠酶溶液按照1:1的體積比混合配制而得，所述纖維素酶溶液為質(zhì)量濃度5%的纖維素酶R10的檸檬酸鈉緩沖液（pH4.6），所述果膠酶溶液為質(zhì)量濃度5%的果膠酶y-23的檸檬酸鈉緩沖液（pH4.6）；

（7）酶解完成后，用體積濃度為70%的酒精小心吹洗根尖分生區(qū)外表皮2-3次；

（8）向吹洗完成的根尖中加入10μL的體積濃度70%酒精并離心1min（6000轉(zhuǎn)/min）后將上清液倒去，如此反復離心清洗兩次。

（9）向離心清洗后的根尖中加純度99.5%的醋酸，用解剖針將根尖搗碎，向破碎處理后的根尖中補加醋酸（1個根尖補加至20μL，2個根尖補加至35μL），混勻，得到細胞懸液；

（10）用移液器吸取10μL細胞懸液，從載玻片上方10cm處將所述細胞懸液滴于載玻片上，制得染色體滴片，陰涼干燥；

（11）向制得的滴片中加入半滴卡包品紅染液染色5~10min，將染色后的載玻片置于顯微鏡進行鏡檢，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可以看出采用本實施例方法制作的玉米根尖染色體滴片，染色體呈橢圓形分散、分布均勻、染色體交叉少、分散度好，獲得了比較完整的染色體，更容易進行單個染色體或細胞分離等生物學研究工作。

實施例2 對DP46玉米品種進行染色體滴片制備：

（1）將DP46玉米種子放于裝滿細沙的磁盤中，置于人工氣候箱中，28℃培養(yǎng)。待根長至1.5 cm時，剪取根尖，放入5 mL離心管；

（2）剪1.5cm根放入ddH₂O雙蒸水中洗凈，將根蘸濕后裝入0.5 mL EP管中（保持蓋打開），讓濕潤的根貼于管壁，但水不能成股流下；

（3）將EP管放入笑氣（N₂O）處理裝置的處理室中處理3 h；笑氣處理裝置將笑氣罐中的笑氣解壓后通入處理室中，使處理室內(nèi)N₂O 的壓力為1個大氣壓；

（4）向EP管中加入質(zhì)量濃度90%的醋酸水溶液，固定2.5 h；

（5）將根從醋酸中取出，用ddH₂O洗2-3次；

（6）將根置于載玻片上吸干水，切下根尖乳白色分生區(qū)，置于酶液PCR管中，40℃酶解2.5h；酶液由纖維素酶溶液和果膠酶溶液按照1:1的體積比混合配制而得，所述纖維素酶溶液為質(zhì)量濃度4%的纖維素酶R10的檸檬酸鈉緩沖液（pH4.6），所述果膠酶溶液為質(zhì)量濃度4%的果膠酶y-23的檸檬酸鈉緩沖液（pH4.6）；

（7）酶解完成后，用8μL無水乙醇小心吹洗根尖分生區(qū)外表皮2-3次；

（8）向吹洗完成的根尖中加入10μL的體積濃度70%酒精并離心1min（6000轉(zhuǎn)/min）后將上清液倒去，如此反復離心清洗兩次；

（9）用解剖針將根尖搗碎，向破碎處理后的根尖中補加純度99.5%的冰乙酸（1個根尖補加至20μL，2個根尖補加至35μL），混勻，得到細胞懸液；

（10）用移液器吸取10μL細胞懸液，從載玻片上方25cm處將所述細胞懸液滴于載玻片上，制得染色體滴片，陰涼干燥；

（11）向制得的滴片中加入半滴卡包品紅染液染色8min，將染色后的載玻片置于顯微鏡進行鏡檢，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以看出采用本實施例方法制作的玉米根尖染色體滴片，染色體呈橢圓形分散、分布均勻、染色體交叉少、分散度好，獲得了比較完整的染色體，更容易進行單個染色體或細胞分離等生物學研究工作。

實施例3 對DP47玉米品種進行染色體滴片制備：

（1）將DP47玉米種子放于裝滿細沙的磁盤中，置于人工氣候箱中，28℃培養(yǎng)。待根長至1.5 cm時，剪取根尖，放入5 ml離心管；

（2）剪1.5cm根放入ddH₂O雙蒸水中洗凈，將根蘸濕后裝入0.5 mL EP管中（保持蓋打開），讓濕潤的根貼于管壁，但水不能成股流下；

（3）將EP管放入笑氣（N₂O）處理裝置的處理室中處理3 h；笑氣處理裝置將笑氣罐中的笑氣解壓后通入處理室中，使處理室內(nèi)N₂O 的壓力為0.75個大氣壓；

（4）向EP管中加入質(zhì)量濃度90%的醋酸水溶液，固定3 h；

（5）將根從醋酸中取出，用ddH₂O洗2-3次；

（6）將根置于載玻片上吸干水，切下根尖乳白色分生區(qū)，置于酶液PCR管中，42℃酶解3h；酶液由纖維素酶溶液和果膠酶溶液按照1：1的體積比混合配制而得，所述纖維素酶溶液為質(zhì)量濃度6%的纖維素酶R10的檸檬酸鈉緩沖液（pH4.6），所述果膠酶溶液為質(zhì)量濃度6%的果膠酶y-23的檸檬酸鈉緩沖液（pH4.6）；

（7）酶解完成后，用體積濃度為5μL的酒精小心吹洗根尖分生區(qū)外表皮2-3次；

（8）向吹洗完成的根尖中加入5μL的酒精并離心5min（6000轉(zhuǎn)/min）后將上清液倒去，如此反復離心清洗兩次。

（9）向離心清洗后的加入純度99.5%冰乙酸，用解剖針將根尖搗碎，向破碎處理后的根尖中補加冰乙酸（1個根尖補加至20μL，2個根尖補加至35μL），混勻，得到細胞懸液；

（10）用移液器吸取10μL細胞懸液，從載玻片上方30cm處將所述細胞懸液滴于載玻片上，制得染色體滴片，陰涼干燥；

（11）向制得的滴片中加入半滴卡包品紅染液染色5min，將染色后的載玻片置于顯微鏡進行鏡檢，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可以看出采用本實施例方法制作的玉米根尖染色體滴片，染色體呈橢圓形分散、分布均勻、染色體交叉少、分散度好，獲得了比較完整的染色體，更容易進行單個染色體或細胞分離等生物學研究工作。

需要說明的是，植物細胞均具有堅實的細胞壁且細胞具有相似性，采用本發(fā)明方法對各種植物細胞染色體均可以進行滴片制備，都可以獲得呈圓形或橢圓形分散，分布均勻，染色體交叉少，分散度較好且完整的染色體，在此不一一列舉。

最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當中。