專利名稱：一種懸鉤子屬植物中期染色體熒光原位雜交方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細胞遺傳學和分子生物學領(lǐng)域，涉及一種懸鉤子屬植物中期染色體熒光原位雜交方法。
背景技術(shù)：
熒光原位雜交(FISH)技術(shù)是70年代初開始發(fā)展起來的一種重要的非放射性原位雜交技術(shù)。它的基本原理是將DNA用特殊修飾的核苷酸分子標記(如biotin-dUTP或 digoxigenin-dUTP)，根據(jù)核酸分子堿基互補配對原則與染色體上相應(yīng)的序列雜交。進行原位雜交時，先用高溫或堿處理DNA分子，使之發(fā)生變性；當溫度下降或pH值恢復(fù)到中性，變性的DNA會按照堿基互補配對的原則，重新形成氫鍵恢復(fù)到原來的雙鏈結(jié)構(gòu)。如果兩條單鏈的來源不同，只有它們之間的堿基序列是同源互補或部分同源互補時，才能全部或部分復(fù)性，產(chǎn)生分子雜交。由于探針帶有熒光物質(zhì)，因此雜交的位點可直接在熒光顯微鏡下觀察到。利用該技術(shù)可以檢測DNA序列在染色體或DNA纖維上的定位、定性、相對定量分析。隨著技術(shù)的發(fā)展與不斷完善，熒光原位雜交在植物上應(yīng)用于研究的優(yōu)越性越來越明顯(1)與用放射性物質(zhì)來標記探針的分子原位雜交相比，它不需要反射性同位素，安全可靠，不需特殊方法處理，檢測時間短，背景清晰，檢測靈敏度高，底物可長期貯存而不失活；(2)與其它非放射性原位雜交技術(shù)相比，它可用不同熒光素標記的探針與同一目的DNA 進行雜交，即進行多重標記，一次定位多個DNA序列；C3)雜交信號可逐級放大，進行定量或非定量分析，并且可聽過計算機軟件圖像分析系統(tǒng)檢測并處理雜交微弱的信號，使其可視化更強。因此，以45S rDNA、5S rDNA或植物全基因組為探針的熒光原位雜交在研究動植物系統(tǒng)發(fā)育與進化、識別個別染色體、提高同源染色體配對準確性、進一步闡明染色體結(jié)構(gòu)變異等重要的遺傳學問題以及鑒定雜種和檢測后代外源染色體或染色體片段存在與否等研究領(lǐng)域具有重要應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)缺陷，提供一種懸鉤子屬植物中期染色體熒光原位雜交方法。本發(fā)明的雜交方法是采用中期染色體作為靶DNA，進行原位雜交。其技術(shù)方案為一種懸鉤子屬植物中期染色體熒光原位雜交方法，包括以下步驟1)制片取懸鉤子根尖，預(yù)處理，固定，然后用Imol · L-1HCl在60士0. 5°C下解離 40s，壓片，液氮凍片，干燥；2)制備探針提取選自懸鉤子植物基因組DNA或通過PCR，得到目的片段45S rDNA 或5S rDNA，用熒光素進行標記，制得探針；3)雜交前預(yù)處理依次用2%纖維素酶和2%果膠酶混合液、IOOyg^mr1W DNase-free RNase A、Img · mL—1的蛋白酶K和45%醋酸處理，再用4%多聚甲醛固定，然后依次用75%、95%、100%乙醇脫水，晾干；4)制備雜交液雜交液總體積為30 μ L :100%去離子甲酰胺15硫酸葡聚糖6 μ L ;20X標準檸檬酸鹽3 μ L ； 10%十二烷基磺酸鈉1 μ L ；熒光素標記的探針3 μ L ； 封阻DNAl μ L ；不足30 μ L時用滅菌去離子水補足；將雜交液混勻，于100°C變性5min，轉(zhuǎn)入冰上處理至少IOmin ；5)制片變性將制片于70%甲酰胺中70°C變性3min，轉(zhuǎn)入經(jīng)_20°C冰凍的75%、 95%、100%乙醇脫水，晾干；6)雜交將雜交液滴于制片上，加蓋玻片，封片，于37°C細胞恒溫培養(yǎng)箱中雜交過夜；7)檢測用標準檸檬酸鈉鹽洗脫，然后加與標記用的熒光素匹配的抗體襯染，觀察熒光信號，采集并加工雜交圖像。其中上述步驟1)中所述的預(yù)處理是用0. 002mol ·Ι^8-羥基喹啉在4°C下處理4h 或重蒸餾水在4°C下處理Mh，固定是采用卡諾氏固定液I (無水乙醇乙酸=3 l,v/v) 在4°C下固定Mh，壓片是用45%乙酸處理。步驟2、中所述熒光素選用地高辛，所述探針的濃度為20 IOOng · μ L—1。步驟幻中所述的2%纖維素酶和2%果膠酶混合液處理是在37°C下溫育1. 5h， DNase-free RNaseA處理是在37°C下溫育lh，蛋白酶K處理是在37°C下溫育30min，45%醋酸處理是在室溫下處理5min，多聚甲醛處理是在室溫下固定lOmin，乙醇脫水時間為每級 5min。步驟4)中所述的雜交液變性是在PCR儀或沸水中進行。步驟幻中所述的70%甲酰胺是用2X標準檸檬酸鹽稀釋，所述的-20°C冰凍乙醇脫水時間為每級5min。步驟6)中所述的雜交過夜是密封避光，雜交時間為18h。步驟6)中雜交通常在37°C下進行，為了提高特異性，可以適當提高雜交溫度到 40 "C。步驟7)中所述的洗脫是用20%甲酰胺0. IXSSC 42°C處理制片lOmin，再依次用 2XSSC緩沖液和0.2% Tween(用2XSSC稀釋)洗5min，標記用的熒光素匹配的抗體濃度為 5μ g · mL-1，在 37°C下處理 lh。進一步優(yōu)選，步驟7)中所述的洗脫及熒光信號觀察均須在避光條件下操作。本發(fā)明一種懸鉤子屬植物中期染色體熒光原位雜交方法，采用中期染色體作為靶 DNA，進行熒光原位雜交和基因組原位雜交。本發(fā)明所述方法操作過程中，取含有中期染色體的細胞制片可以用體細胞來制片，制片時要選擇細胞分裂旺盛的組織來制片，保證有大量的中期細胞。對于懸鉤子屬來說，可以采取懸鉤子屬的根尖制片。首先通過莖扦插繁殖獲取不定根，取3-5個節(jié)位的嫩梢或硬枝，扦插與塑料大棚以蛭石為基質(zhì)的插床中，進行常規(guī)管理，待不定根至l_2cm時，取健壯插穗的正在生長的根尖。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明采用中期染色體熒光原位雜交，采用本發(fā)明所述的雜交方法流程能有效消除背景干擾，檢測靈敏度和準確度高。
1、本發(fā)明所述方法采用根尖壓片法制備染色體，相較于酶解去壁低滲法，該方法簡便、快捷。獲得的染色體能夠滿足原位雜交的要求。2、本發(fā)明方法在裝片前處理中，采用2%纖維素酶和果膠酶混合液酶解細胞壁，使染色體盡可能裸露，有效去除細胞漿中的RNA和蛋白質(zhì)，減少探針與核酸和蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合，減少標記探針雜交背景干擾，從而增強雜交信號。3、采用本發(fā)明的方法縮短雜交時間至18小時，實驗流程相對簡化，整個實驗?zāi)茉?2天內(nèi)完成。


圖1是探針為45S rDNA與該屬植物染色體熒光原位雜交的鏡檢圖片；圖2是探針為5S rDNA與該屬植物染色體熒光原位雜交的鏡檢圖片；圖3是探針為該屬植物基因組與該屬植物染色體熒光原位雜交的鏡檢圖片。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖與具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細地說明。一種懸鉤子屬植物中期染色體熒光原位雜交方法，包括以下步驟1)制片(1)中期染色體制片取自含有有絲分裂中期的體細胞的根尖。通過莖扦插繁殖獲取不定根，取3-5個節(jié)位的嫩梢或硬枝，扦插于塑料大棚以蛭石為基質(zhì)的插床中，進行常規(guī)管理，待不定根長至l_2cm時，取健壯插穗的正在生長的根尖；用0. 002mol化、-羥基喹啉 4°C下預(yù)處理4h;將根尖置于卡諾氏固定液I (無水乙醇乙酸=3 l，v/v)在4°C下固定 24h ；將其置于70%的乙醇中，冰箱中4°C長期保存?zhèn)溆谩?2)從70%乙醇中取出固定好的根尖，流水沖洗約3min，吸水紙吸干，放入小試管中，加約5ml的Imol化―1的HCl于60士0. 5°C水浴解離約40s，然后快速將HCl溶液用膠頭吸管吸出，以終止解離，用重蒸餾水輕輕洗滌3次，保存在重蒸餾水中備用。(3)取根尖置于載玻片上，用刀片切除根冠，再切分生區(qū)置于載片上，用鑷子或解剖針將材料分割成若干小塊，并用解剖針輕輕涂勻；然后加1滴45%醋酸于材料上。用解剖針輕輕涂抹根尖，使小塊盡可能分散在染液中。然后蓋上蓋玻片。將載片平置于酒精燈上來回輕輕晃動，即用酒精燈微微烘烤處理的材料，烘烤lmin。將小片濾紙條折疊，用指頭壓住覆有濾紙條蓋玻片的兩個角，以免蓋片移動。用解剖針頭對準材料輕輕敲擊蓋玻片，使材料分散為一薄層為止。然后在顯微鏡上觀察，看材料是否分散以及是否有分裂相，最后用大拇指緊壓該有蓋玻片的裝片處。(4)鏡檢觀察，用奧林巴斯BX-51型顯微鏡觀察，選擇分散良好且分裂相多的中期染色體制片于_70°C液氮凍片5min，迅速揭片，空氣干燥后置于-20°C備用。2)制備探針(1)以45S rDNA重復(fù)序列或5S rDNA重復(fù)序列為探針A.探針為45S rDNA重復(fù)序列，使用的引物為5，TCCTCCGCTTATTGATATGC3，(上游引物)，5，GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3，(下游引物)，
PCR產(chǎn)物長度為700bp。B.探針為5S rDNA重復(fù)序列，使用的引物為5，CGGTGCATTAATGCTGGTAT3，(上游引物)5，CCCATCCGTGTACTACTCTC3，(下游引物)PCR產(chǎn)物長度為700bp。采用PCR法標記。C. PCR法標記探針地高辛標記物為digoxigenin-lldUTP，采用PCR DIG Probe Synthesis Kit(Roche)試劑盒標記，標記擴增最適體系為:10ng樹莓DNA模板，0. 2 μ M each Primer,0. ImM dNTP,0. ImM DIG-dNTP,0. 75U Enzyme Μ χ,δμ L PCR Buffer with Mg2+，加ddH20至總體積50 μ L。PCR程序為95°C預(yù)變性2min，95°C變性30s，60°C退火30s， 72°C延伸40s，30次循環(huán)，最后72°C延伸7min，4°C保存。經(jīng)電泳檢測得到的探針長度約 400bp，濃度約為 50ng · μ Γ1。(2)以懸鉤子屬植物全基因組為探針提取基因組DNA:Α.取懸鉤子植物材料幼嫩葉片0. 5-1. Og,加少許PVP (聚乙烯吡咯烷酮)與Vc 的研缽中加液氮迅速研磨成粉末轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，加入600 μ L冰凍的提取介質(zhì)一 (Imol · L-1Tris-HCl 20mL,0. 5mol ‘ L-1 EDTA IOmL, 5mol ‘ L-1 NaCl lmL，定容至 IOOmL)，在 0°C下放置IOmin ；B.在 40CT 12，OOOr · mirT1 離心 IOmin,收集沉淀；C.加入65°C預(yù)熱的提取介質(zhì)二 (lmol .171 Tris-HCl IOmL,0. 5mol .171 EDTA 4mL, 5mol · Γ1 NaCl 28mL, CTAB 2g 定容至 100mL，用前加入 2% β-巰基乙醇)，65°C 水浴 lh， 其間不時輕輕搖動；D.加入等體積的氯仿異戊醇(24 1，ν/ν)，萃取10min，4°C下12，OOOr · mirT1 離心IOmin0E.將上清轉(zhuǎn)入到另一潔凈的離心管中，重復(fù)步驟D ；F.將上清液轉(zhuǎn)入到另一潔凈的離心管中，加入等體積經(jīng)_20°C預(yù)冷的異丙醇混勻，若無絮狀沉淀析出，可放入_20°C冰箱30min后取出，4°C下5，OOOr · mirT1離心lOmin， 收集沉淀；G.棄上清，加入75%乙醇清洗2-3次，再用無水乙醇清洗一次，置于通風處晾干；H.待DNA完全干燥后加入適量(MH2O于4°C溶解；I.部分樣品在核酸蛋白分析儀上測定DNA的濃度和純度，1 %瓊脂糖電泳檢測DNA 的完整性，其余置于_20°C保存?zhèn)溆谩Ｈ笨谄揭品擞浱结槍? μ g的模板DNA用滅菌雙蒸水稀釋到16 μ L ；加入4 μ L 的地高辛Dig-Nick Translation Mix，混勻后短暫瞬時離心；于15°C溫浴90min ；取3yL標記產(chǎn)物在95°C變性3min，立即冰浴3min，在1. 5%的瓊脂糖凝膠，100V電壓下，電泳60min， 檢測探針片段的長度1若長度在200-500bp，則加1 μ L的反應(yīng)終止液(0. 5mol · L1EDTA, PH 8. 0)，然后在65°C溫浴IOmin終止反應(yīng)；II若長度> 500bp，則繼續(xù)孵育，直至片段長度集中在 200-500bp。3)雜交前預(yù)處理將制片從_20°C中取出晾干，滴加2%纖維素酶(Cellulase R-10)和2%果膠酶(Pectinase Y-23)混合液數(shù)滴，蓋上蓋片，37 °C處理1. 5h，再用2 X SSC (0. 3mol · L^1NaCl與0. 03mol · L-1檸檬酸三鈉)緩沖液漂去蓋片，用2 X SSC緩沖液洗制片 2 X 5min (洗漆 2 次，每次 5min)，滴力口 100 μ g · mL_1DNase-free RNaseA (Sangon,上海)數(shù)滴，蓋上蓋片，37°C處理lh(DNaSe-free RNase A用2X SSC緩沖液配制，用前沸水中煮5min，以滅活DNase活性)，2 X SSC緩沖液漂去蓋片，2 X SSC緩沖液洗制片2 X 5min ；滴加 Img .mL-1 蛋白酶!((Proteinase K，Sangon，上海)數(shù)滴，蓋上蓋片，37°C溫育 30min，2XSSC 緩沖液漂去蓋片，2X SSC緩沖液洗制片2X5min ；45%醋酸室溫處理5min，用2X SSC緩沖液洗制片2X5min ；轉(zhuǎn)入4%多聚甲醛中常溫下固定IOmin ；迅速轉(zhuǎn)入75%、95%、100%乙醇梯度逐級脫水5min，晾干載片。4)制備雜交液雜交液總體積為30 μ L0雜交混合液須在使用前新配制，其組成如下50%去離子甲酰胺(用于防止高溫對染色體形態(tài)和結(jié)構(gòu)的損害及脫落)；10%硫酸葡聚糖(與水結(jié)合減少雜交液容積，提高探針的有效濃度)；2XSSC(0. 3mol · L^1NaCl與0. 03mol · L—1檸檬酸三鈉的鹽溶液，用于浸潤染色體DNA) ；0. 3%的10% SDS ；50 IOOng探針；10 100倍封阻DNA(鮭魚精DNA)。具體來說，雜交液的組成如下去離子甲酰胺15yL;50%硫酸葡聚糖6yL; 20XSSC 3μ L ；10% SDS 1 μ L ；地高辛標記的45S rDNA探針3 μ L ；鮭魚精DNA 1 μ L ；滅菌的去離子水Iy L。將雜交液在渦流混合器上混勻，此步驟很重要，，接著置于PCR儀上在 100°C變性5min，迅速轉(zhuǎn)入冰上處理至少lOmin。5)制片變性制片于70%甲酰胺2XSSC中70°C變性3min，迅速轉(zhuǎn)入經(jīng)_20°C冰凍的了日^力日^^^^^乙醇中梯度逐級脫水日！??！^！，晾干載片。為了避免變性后的DNA單鏈在長時間室溫下復(fù)性，晾干時間不宜過長，應(yīng)少于20min。6)雜交加上述變性的雜交混合液30yL于載片上，蓋上蓋玻片，密封避光。轉(zhuǎn)入 37°C細胞恒溫培養(yǎng)箱，雜交過夜，為了保證雜交的充分和檢測到的信號的強度，雜交時間為 18h。7)檢測雜交載片先用2XSSC漂洗去蓋片，再用20%甲酰胺0. IXSSC 42 V 處理制片IOmin,依次用2X SSC緩沖液和0. 2 % Tween,用2XSSC稀釋，洗5min ；然后加 5 μ g ·mL^Avidin-FITC (Roche)，50 μ L/ 片，37°C處理 lh，用 2 X SSC 緩沖液洗 2 X 5min,晾干載片。制片用1 μ g ·IiiL-1DAPI復(fù)染，封片。最后用安裝有CXD攝像頭的Olympus BX-51plus 熒光顯微鏡觀察熒光信號，用DP controller成像系統(tǒng)軟件進行原位雜交圖像的攝取和采集，Imagepro-Plus和Ph0t0Sh0p7. 0軟件處理圖片。具體請見圖1_圖2，其中圖1是探針為45S rDNA與該屬植物染色體熒光原位雜交的鏡檢圖片，信號在彩色照片中顯示為綠色； 圖2是探針為5S rDNA與該屬植物染色體熒光原位雜交的鏡檢圖片，信號在彩色照片中顯示為綠色；圖3是探針為該屬植物基因組與該屬植物染色體熒光原位雜交的鏡檢圖片，信號在彩色照片中顯示為綠色。以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式
，本發(fā)明的保護范圍不限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可顯而易見地得到的技術(shù)方案的簡單變化或等效替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種懸鉤子屬植物中期染色體熒光原位雜交方法，其特征在于，包括以下步驟1)制片取懸鉤子根尖，預(yù)處理，固定，然后用lmol-T1 HCl在60士0.5°C下解離40s， 壓片，液氮凍片，干燥；2)制備探針提取選自懸鉤子植物基因組DNA或通過PCR，得到目的片段45SrDNA或 5S rDNA，用熒光素進行標記，制得探針；3)雜交前預(yù)處理依次用2%纖維素酶和2 %果膠酶混合液、10 0 μ g · mL_1的 DNase-free RNaseA,Img · mL—1的蛋白酶K和45%醋酸處理，再用4%多聚甲醛固定，然后依次用75%、95%、100%乙醇脫水，晾干；4)制備雜交液雜交液總體積為30μ L :100%去離子甲酰胺15 μ L ；50%硫酸葡聚糖 6 μ L ;20Χ標準檸檬酸鹽3 μ L ；10%十二烷基磺酸鈉1 μ L ；熒光素標記的探針3 μ L ；封阻 DNAl μ L ；不足30 μ L時用滅菌的去離子水補足；將雜交液混勻，于100°C變性5min，轉(zhuǎn)入冰上處理至少IOmin ；5)制片變性將制片于70%甲酰胺中70 V變性3min，轉(zhuǎn)入經(jīng)-20 V冰凍的75 %、95 %、 100%乙醇脫水，晾干；6)雜交將雜交液滴于制片上，加蓋玻片，封片，于37°C細胞恒溫培養(yǎng)箱中雜交過夜；7)檢測用標準檸檬酸鈉鹽洗脫，然后加與標記用的熒光素匹配的抗體襯染，觀察熒光信號，采集并加工雜交圖像。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)中所述的預(yù)處理是用 0. 002mol · 1^8-羥基喹啉在4°C下處理4h或重蒸餾水在4°C下處理Mh，固定是采用卡諾氏固定液I 無水乙醇乙酸=3 l，v/v，在4°C下固定Mh，壓片是用45%乙酸處理。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟幻中所述的2%纖維素酶和2%果膠酶混合液處理是在37°C下溫育1. 5h，DNase-free RNase A處理是在37°C下溫育Ih，蛋白酶K處理是在37°C下溫育30min，45%醋酸室溫處理5min，多聚甲醛處理是在室溫下固定 IOmin,乙醇脫水時間為每級5min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)中所述的雜交液各個成分的比例 100%去離子甲酰胺15 μ L ；50%硫酸葡聚糖6 μ L ;20Χ標準檸檬酸鹽3 μ L ； 10%十二烷基磺酸鈉1 μ L ；熒光素標記的探針3 μ L ；封阻DNA 1 μ L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟幻中所述的70%甲酰胺是用2Χ標準檸檬酸鹽稀釋，所述的-20°C冰凍乙醇脫水時間為每級5min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟6)中所述的雜交過夜是密封避光，雜交時間為18h。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟7)中所述的洗脫是用20%甲酰胺 0. 1 X SSC 420C處理制片IOmin,再依次用2X SSC緩沖液和0. 2% Tween,用2X SSC稀釋，洗 5min，標記用的熒光素匹配的抗體濃度為5μ g · mL—1，在37°C下處理lh。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種懸鉤子屬原位雜交方法，包括制片、制備探針、雜交前預(yù)處理、制備雜交液、制片變性、雜交和檢測七個步驟。其中，制片采用根尖壓片法，制片前處理時用2％纖維素酶和2％果膠酶在37℃下酶解細胞壁1.5h，探針采用單色標記，雜交前雜交液需在100℃變性5min，雜交時在37℃溫育18h。本發(fā)明所述的雜交方法能有效消除背景干擾，提高檢測靈敏度和準確性。本發(fā)明適用以45S rDNA、5S rDNA和懸鉤子屬植物基因組為探針的懸鉤子屬植物的染色體原位雜交。
文檔編號C12Q1/68GK102559909SQ20121003258
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月15日
發(fā)明者何文, 劉澤靜, 南紅, 湯浩茹, 王小蓉, 王燕, 陳濤, 陳清, 黃曉姣 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學