專利名稱：小麥禾谷孢囊線蟲特異性scar標(biāo)記及其快速pcr檢測(cè)方法
小麥禾谷孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記及其快速PCR檢測(cè)方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及小麥禾谷孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記全序列、特異性 SCAR標(biāo)記引物序列及小麥禾谷孢囊線蟲SACR特異性標(biāo)記快速PCR檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
小麥禾谷孢囊線蟲(Heterodera avenae ；俗名 Cereal Cyst Nematode,CCN)是溫帶禾谷作物上的世界性重要病原線蟲，自1874年在德國(guó)被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，隨后在英國(guó)、俄羅斯、 挪威、澳大利亞、加拿大、美國(guó)、中國(guó)等40多個(gè)國(guó)家均發(fā)生不同程度的危害，嚴(yán)重影響禾谷作物尤其是麥類作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。我國(guó)自1989年彭德良等首次在湖北省天門縣發(fā)現(xiàn)小麥禾谷孢囊線蟲為害小麥后，目前已發(fā)現(xiàn)在湖北、河南、河北、北京、山東、山西、內(nèi)蒙古、青海、江蘇、安徽、甘肅、陜西、寧夏等13省市都有禾谷孢囊線蟲的分布。因此，該線蟲已成為嚴(yán)重威脅我國(guó)小麥生產(chǎn)的主要病害。
在為害小麥的孢囊線蟲中，主要有禾谷孢囊線蟲(H. avenae)，菲利普孢囊線蟲 (H. filipjevi)，大麥孢囊線蟲(H. Iatipons)三個(gè)種，它們具有很相似的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，形態(tài)學(xué)特征差異較小。目前孢囊線蟲的鑒定大部分依賴于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法，耗時(shí)較多且需要很熟練的專業(yè)技術(shù)，通常需要專門從事分類的人員來(lái)完成，從而給危害小麥的孢囊線蟲鑒定增加了難度。
以PCR為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)手段為解決線蟲快速鑒定中存在的問(wèn)題提供了工具。隨著PCR檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，線蟲的分子診斷取得重要進(jìn)展。Mulholland等(1996)分別構(gòu)建了基于rDNA-ITS的馬鈴薯金線蟲(Globodera rostochiensis)和馬鈴薯白線蟲 (G. pallida)的特異性引物，描述了這兩種線蟲的特異性多重PCR檢測(cè)技術(shù)，能快速鑒定馬鈴薯白線蟲和馬鈴薯金線蟲及其復(fù)合種群。與標(biāo)準(zhǔn)的PCR途徑不同，這一技術(shù)在每個(gè)PCR反應(yīng)中應(yīng)用了 3個(gè)引物，通用引物5. 8S rRNA、馬鈴薯金線蟲的特異性引物ITSl-Gr和馬鈴薯白線蟲的特異性引物ITSl-Gp。通過(guò)一次PCR測(cè)驗(yàn)就可以在混合樣品中特異性地檢測(cè)出一個(gè)或多個(gè)線蟲種。Bulman和Marshall (1997)在研究了秘魯和澳大利亞的馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲的rDNA-ITS的序列結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，構(gòu)建了馬鈴薯金線蟲的特異性引物PITSrf 和白線蟲的特異性引物PITSp4，應(yīng)用多重PCR技術(shù)可以快速診斷馬鈴薯孢囊線蟲。通用引物ITS5與PITSr3可以擴(kuò)增343bp馬鈴薯金線蟲的特異性片段，通用引物ITS5與PITSp4 可以擴(kuò)增出265bp馬鈴薯白線蟲的特異性片段。在一個(gè)PCR反應(yīng)中，即使復(fù)合種群中金線蟲DNA的含量?jī)H為白線蟲的百分之一，也能從復(fù)合種群檢測(cè)出金線蟲。
Amiri和Subbotin等Q002)構(gòu)建了基于rDNA-ITS的甜菜孢囊線蟲 (H. schachtii)特異性引物SHF6.特異性引物SHF6與通用引物AB28引物結(jié)合，同時(shí)與通用引物D2A和D!3B放在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行一步雙重PCR，從58個(gè)孢囊線蟲群體中成功地鑒定出甜菜孢囊線蟲，甜菜孢囊線蟲群體中可以擴(kuò)增200bp特異性片段，而非甜菜孢囊線蟲中不能擴(kuò)增出200bp的片段。
彭德良和SiAbotin等Q001)構(gòu)建了基于rDNA-ITS區(qū)域上的大豆孢囊線蟲特異性引物GlyFl，應(yīng)用兩組引物D3A和D!3B及大豆孢囊線蟲種特異性引物GlyFl和引物rDNA2 成功地對(duì)大豆孢囊線蟲進(jìn)行了分子診斷研究。內(nèi)標(biāo)引物D3A和D!3B是保證DNA的有效性， 第二對(duì)引物GlyFI和rDNA2是特異性檢測(cè)大豆孢囊線蟲。用這兩對(duì)引物進(jìn)行的雙重PCR擴(kuò)增，從所有52個(gè)大豆孢囊線蟲群體都能擴(kuò)增ISlbp的大豆孢囊線蟲的特異性DNA片段，而在所有測(cè)試的其他8種孢囊線蟲22個(gè)群體不能擴(kuò)增出ISlbp的特異性片段。大豆孢囊線蟲種特異性引物GlyFl靈敏性非常高，能從單條幼蟲的微量DNA中擴(kuò)增出大豆谷孢囊線蟲種特異性片段。
此外，國(guó)外有一些基于基因組DNA的SCAR標(biāo)記用于植物線蟲特異性檢測(cè)的報(bào)道。 在馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲的快速分子診斷中，F(xiàn)ullanodo等(1999)用RAPD隨機(jī)引物0PG5分別擴(kuò)增出馬鈴薯金線蟲特異性片段826bp，馬鈴薯白線蟲特異性片段llOObp。對(duì)擴(kuò)增出的片段進(jìn)行全序列分析，將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化成SCAR標(biāo)記，設(shè)計(jì)馬鈴薯金線蟲的SCAR 標(biāo)記特異性引物FullGrf和FullGn ，擴(kuò)增出了 315bp的特異性片段；設(shè)計(jì)馬鈴薯白線蟲的 SCAR特異性標(biāo)記引物FullGpf和FullGpr，擴(kuò)增出79^ρ的特異性片段，從而可以快速檢測(cè)馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲。
Ou, S. Q. Peng D. L.(歐師琪彭德良等2008)采用RAPD技術(shù)，獲得了基于大豆孢囊線蟲基因組DNA的特異性SCAR標(biāo)記，構(gòu)建了大豆孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記的特異性引物SCNFI和SCNRI，可擴(kuò)增出473bp大豆孢囊線蟲的特異性SCAR標(biāo)記片段，選用核糖體引物D2A和D!3B作為內(nèi)標(biāo)與上述特異性引物SCNFl和SCNRl相結(jié)合，發(fā)明了一步雙重PCR方法檢測(cè)大豆孢囊線蟲，PCR產(chǎn)物可獲得47!3bp的特異性片段和SOObp的內(nèi)標(biāo)片段，在PCR擴(kuò)增條件下，大豆孢囊線蟲群體都獲得了 473bp的特異性SCAR標(biāo)記片段和SOObp片段。
國(guó)內(nèi)外關(guān)于小麥禾谷孢囊線蟲核糖體DNA的ITS區(qū)域有一些研究。主要集中在 ITS序列特征、利用限制性內(nèi)切酶分析ITS區(qū)酶切片段的長(zhǎng)度多態(tài)性等方面，但未見基于基因組DNA的SCAR標(biāo)記引物特異性檢測(cè)小麥禾谷孢囊線蟲的報(bào)道。因此，開發(fā)小麥禾谷孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記，建立快速PCR檢測(cè)方法，對(duì)于快速準(zhǔn)確鑒定小麥禾谷孢囊線蟲的種類，明確其發(fā)生與分布特征，制定相應(yīng)的防控措施等具有重要意義。發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述技術(shù)領(lǐng)域的空白，本發(fā)明提供小麥禾谷孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記的全長(zhǎng)序列，同時(shí)提供了 SCAR標(biāo)記的特異性引物。
本發(fā)明還提供小麥禾谷孢囊線蟲特異性SACR快速PCR檢測(cè)方法，將為制定線蟲的快速分子檢測(cè)方法，開展小麥禾谷孢囊線蟲病的早期診斷，制定其綜合治理對(duì)策提供理論依據(jù)。
小麥禾谷孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記的DNA片段，其特征在于具有如SEQ ID NOl 所示的核苷酸序列。
根據(jù)小麥禾谷孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記的DNA片段設(shè)計(jì)的特異性引物。
優(yōu)選為HaFl和HaRl，其序列為
HaFl :5’ -TGACGAGAACATATGATGGGGAT-3，
HaRl :5，-GAGGGGGTGGGAATGAAATGGAT-3，
小麥禾谷孢囊線蟲SCAR標(biāo)記快速PCR檢測(cè)方法，其特征在于PCR反應(yīng)體系中含有上述特異性引物。
優(yōu)選所述PCR反應(yīng)體系中含有特異性引物HaFl和HaRl。
本發(fā)明利用RAPD技術(shù)，獲得了基于小麥禾谷孢囊線蟲基因組DNA的特異性RAPD 標(biāo)記，將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)換成SCAR標(biāo)記，經(jīng)克隆、測(cè)序后獲得了特異性SCAR標(biāo)記的全長(zhǎng)序列 SEQ ID N01，利用該SCAR標(biāo)記的保守序列可以設(shè)計(jì)出其特異性引物，用于PCR檢測(cè)出目標(biāo)線蟲。
本發(fā)明構(gòu)建了特異性SCAR標(biāo)記的特異性引物HaFl和HaRl (即SEQ ID N02和SEQ ID N03)。利用小麥禾谷孢囊線蟲特異性引物HaFl和HaRl，在PCR擴(kuò)增條件下，所有小麥禾谷孢囊線蟲群體都獲得了 IOlObp的特異性SCAR標(biāo)記片段，而其它線蟲類則沒有IOlObp的特異性SCAR標(biāo)記片段。本發(fā)明構(gòu)建的特異性引物HaFl和HaRl，特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確性好，靈敏度尚。
本發(fā)明應(yīng)用特異性SCAR標(biāo)記PCR技術(shù)檢測(cè)目標(biāo)線蟲，與隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù) (RAPD-PCR)、核糖體DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(RFLP-PCR)檢測(cè)方法相比，更省時(shí)、更準(zhǔn)確、更靈敏，能夠更加快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)小麥禾谷孢囊線蟲。該技術(shù)可應(yīng)用于攜帶小麥禾谷孢囊線蟲的田間土壤樣品及植株的早期快速分子檢測(cè)，具有較高的實(shí)用價(jià)值。


圖1 用隨機(jī)引物0PD13擴(kuò)增的小麥禾谷孢囊線蟲、菲利普孢囊線蟲、大豆孢囊線蟲、旱稻孢囊線蟲大麥孢囊線蟲、馬鈴薯腐爛莖線蟲的RAPD的多態(tài)性結(jié)果。
M為標(biāo)準(zhǔn)的DNA分子質(zhì)量標(biāo)記(DNA markerDL 2,000) ； 1_6為小麥禾谷孢囊線蟲群體(編碼為HaOl，Ha03, Ha07, Hal2, Hal7, Ha 18) ；7-8為菲利普孢囊線蟲群體(編碼為 HfOl, Hf04) ；9為大豆孢囊線蟲群體(編碼為HgOl) ； 10為旱稻孢囊線蟲(編碼為HeOl)； 11為大麥孢囊線蟲群體(編碼為H101) 12為馬鈴薯腐爛莖線蟲群體(編碼為DdOl) ；13為陰性對(duì)照(群體代碼及來(lái)源見表1和表2)
圖2 小麥禾谷孢囊線蟲SCAR標(biāo)記特異性引物擴(kuò)增檢測(cè)的特異性DNA片段M為標(biāo)準(zhǔn)的DNA分子質(zhì)量標(biāo)記(DNA markerDL 2，000) ； 1_8分別為小麥禾谷孢囊線蟲8個(gè)不同群體(編碼為HaOl, Ha03, Ha07, Ha08, HalO, Hall, Hal2，Ha 17) ；9為菲利普孢囊線蟲群體 (編碼為HfOl) ；10為大豆孢囊線蟲群體(編碼為HgOl) ；11為旱稻孢囊線蟲群體(編碼為HeOl) ；12為為大麥孢囊線蟲群體(編碼為H101) 13為馬鈴薯腐爛莖線蟲群體(編碼為 DdOl) ；14為陰性對(duì)照(群體代碼及來(lái)源見表1和表2)
圖3 小麥禾谷孢囊線蟲SCAR標(biāo)記特異性引物的靈敏度檢測(cè)
M 為標(biāo)準(zhǔn)的 DNA 分子質(zhì)量標(biāo)記(DNA marker DL 2,000) ； 1-7 分別為 1，10、IOO"2, 0_3，IO-4, IO-5, IO-6μ 1小麥禾谷孢囊線蟲單個(gè)孢囊的DNA ；8為陰性對(duì)照。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)選用的材料
16個(gè)小麥禾谷孢囊線蟲群體為本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期從山東省、青海省、河南省、甘肅省、 安徽等地收集且在小麥上進(jìn)行繁殖的孢囊線蟲種群，11個(gè)菲利普孢囊線蟲群體為本實(shí)驗(yàn)室從河南等省市收集保存，2個(gè)小麥禾谷孢囊線蟲國(guó)外群體，3個(gè)菲利普孢囊線蟲國(guó)外群體以 及其他線蟲群體為本實(shí)驗(yàn)室工作人員收集(表1、表2〉。上述樣本本實(shí)驗(yàn)室均有保存，可以 對(duì)公眾發(fā)放。
〔0030〕 表1供試小麥禾谷孢囊線蟲及其它線蟲樣品代碼及群體來(lái)源 〔0031〕
權(quán)利要求
1.小麥禾谷孢囊線蟲特異SCAR標(biāo)記的DNA片段，其特征在于該DNA片段具有SEQIDNOl所示的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小麥禾谷孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記的DNA片段的保守序列設(shè)計(jì)的特異性引物。
3.權(quán)利要求2所述的特異性引物，其為HaFl和HaRl，其序列為HaFl :5’ -TGACGAGAACATATGATGGGGAT-3’，HaRl :5’ -GAGGGGGTGGGAATGAAATGGAT-3，。
4.小麥禾谷孢囊線蟲SCAR標(biāo)記快速PCR檢測(cè)方法，其特征在于PCR反應(yīng)體系中含有權(quán)利要求2或3所述的特異性引物。
全文摘要
本發(fā)明為“小麥禾谷孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記及其快速PCR檢測(cè)方法”，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。小麥禾谷孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記的DNA片段，其特征在于該DNA片段具有如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。根據(jù)小麥禾谷孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記的DNA片段設(shè)計(jì)的特異性引物HaF1和HaR1，在PCR快速檢測(cè)小麥禾谷孢囊線蟲的方法中，可擴(kuò)增出1010bp的特異性片段。本發(fā)明提高了分子檢測(cè)靈敏度并且快速準(zhǔn)確，在小麥禾谷孢囊線蟲檢測(cè)和小麥孢囊線蟲病的早期診斷方面，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102559669SQ201210032018
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月13日
發(fā)明者亓?xí)岳? 彭德良, 彭煥, 賀文婷, 黃文坤 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所