專利名稱：輔助鑒定大豆百粒重相關(guān)位點(diǎn)的一種方法及其專用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種輔助鑒定大豆百粒重相關(guān)位點(diǎn)的ー種方法及其專用引物。
背景技術(shù)：
基于表型選擇的常規(guī)育種方法存在選擇效率低和育種周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)，迫切需要注入現(xiàn)代分子技術(shù)手段，輔之于高效率地基因型定向選擇，才能快速高效地培育出優(yōu)異大豆新品種。隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)的迅速發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用更加廣泛?；赑CR 的分子標(biāo)記如微衛(wèi)星或SSR(simple sequence repeat)等具有多態(tài)率高、相對(duì)穩(wěn)定、檢測(cè)方法簡(jiǎn)便快速及易于操作等特點(diǎn)而被廣泛的應(yīng)用。由于分子標(biāo)記輔助選擇不易受環(huán)境因素影響和性狀顯隱性干擾等，可以從分子水平定向選擇目標(biāo)性狀基因(或稱膠上選擇)，同時(shí)還有可能打破不利基因之間的連鎖而高效率地聚合多個(gè)優(yōu)良基因于一體。通常所說(shuō)的分子標(biāo)記既包括目標(biāo)基因的連鎖標(biāo)記也包括目標(biāo)基因自身功能標(biāo)記。分子標(biāo)記輔助多基因聚合育種技術(shù)已經(jīng)成為大豆等作物育種研究的一種發(fā)展趨勢(shì)，運(yùn)用該技術(shù)能否有效地將優(yōu)質(zhì)、多抗和高產(chǎn)等基因聚合到少數(shù)骨干品種中，關(guān)鍵在于能否獲得足夠多的與目標(biāo)性狀基因或主效QTL緊密連鎖的實(shí)用分子標(biāo)記。大豆籽粒產(chǎn)量=単位面積株數(shù)X單株粒數(shù)X粒重。因此，莢粒數(shù)、粒大小(粒長(zhǎng)、 粒寬)、單株英數(shù)/粒數(shù)及單株粒重等均與籽粒產(chǎn)量密切相關(guān)。大豆產(chǎn)量構(gòu)成因素都是由許多微效基因或QTL控制的復(fù)雜數(shù)量性狀，遺傳カ大都較低。但大豆百粒重(是指100粒大豆種子的重量，其數(shù)值的高低直接反映籽粒體積的大小)在產(chǎn)量構(gòu)成因素中是ー個(gè)確定的重要數(shù)量性狀，品種之間差異明顯，遺傳力比較高(55%左右)，以加性遺傳效應(yīng)為主，在產(chǎn)量性狀中其遺傳規(guī)律相對(duì)簡(jiǎn)単，主要受少數(shù)主基因與若干微效基因共同控制。在大豆莢粒數(shù)性狀方面，朱保葛等通過(guò)誘變方法篩選到個(gè)發(fā)生単位點(diǎn)突變的多粒莢(即4粒莢)突變系，使得復(fù)雜的數(shù)量遺傳性狀轉(zhuǎn)變?yōu)楹?jiǎn)單的質(zhì)量遺傳性狀，便于分子標(biāo)記與定位分析，并利用所創(chuàng)造的近等基因系NILfcear isogenic line)材料研究表明，該位點(diǎn)能使大豆植株的4粒莢比率至少提高15%，并發(fā)現(xiàn)與突變位點(diǎn)相連鎖的4個(gè)SSR標(biāo)記 (位于其兩側(cè))，兩側(cè)標(biāo)記Sat_107和Satt491 (3. 2cM和4. 2cM)已經(jīng)成功地用于高產(chǎn)材料的輔助選擇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供輔助鑒定大豆百粒重相關(guān)位點(diǎn)的ー種方法及其專用引物。本發(fā)明提供的輔助篩選具有高百粒重性狀的大豆的方法，包括如下步驟以待測(cè)大豆的基因組DNA為模板，用GNE070a引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物中具有一個(gè)特異DNA片段的待測(cè)大豆為候選的具有高百粒重性狀的大豆；所述GNE070a引物對(duì)為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對(duì)；所述特異DNA片段的大小為；所述高百粒重性狀為籽粒百粒重彡25. 0克的性狀。所述方法可用于大豆育種。具體來(lái)說(shuō)，可將所述候選的具有高百粒重性狀的大豆用于所述育種。本發(fā)明還提供了ー種輔助鑒定大豆高百粒重性狀的方法，包括如下步驟以待測(cè)大豆的基因組DNA為模板，用GNE070a引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物中具有一個(gè)特異DNA片段的待測(cè)大豆具有高百粒重的性狀；所述GNE070a引物對(duì)為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對(duì)；所述特異DNA片段的大小為 275bp-285bp ；所述高百粒重性狀為籽粒百粒重彡25. 0克的性狀。所述方法可用于大豆育種。具體來(lái)說(shuō)，可將具有所述高百粒重性狀的大豆用于所述育種。本發(fā)明還保護(hù)序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對(duì) (GNE070a 引物對(duì))。所述引物對(duì)的功能為如下(a)和/或(b)(a)輔助鑒定大豆百粒重性狀；(b)輔助篩選具有高百粒重性狀的大豆；所述高百粒重性狀為籽粒百粒重> 25. 0 克的性狀。從實(shí)際應(yīng)用角度出發(fā)，所述(a)中，GNE070a引物對(duì)主要用于輔助鑒定大豆的高百粒重性狀；所述高百粒重性狀為籽粒百粒重> 25. 0克的性狀。所述引物對(duì)在制備試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述試劑盒的功能為如下(a)和/或(b)(a)輔助鑒定大豆百粒重性狀；(b)輔助篩選具有高百粒重性狀的大豆；所述高百粒重性狀為籽粒百粒重> 25. 0 克的性狀。從實(shí)際應(yīng)用角度出發(fā)，所述(a)中，所述試劑盒主要用于輔助鑒定大豆高百粒重性狀；所述高百粒重性狀為籽粒百粒重> 25. 0克的性狀。本發(fā)明還保護(hù)ー種試劑盒，包括所述引物對(duì)。所述試劑盒的功能為如下(a)和/或(b)(a)輔助鑒定大豆百粒重性狀；(b)輔助篩選具有高百粒重性狀的大豆；所述高百粒重性狀為籽粒百粒重> 25. 0 克的性狀。從實(shí)際應(yīng)用角度出發(fā)，所述(a)中，所述試劑盒主要用于輔助鑒定大豆高百粒重性狀；所述高百粒重性狀為籽粒百粒重> 25. 0克的性狀。由于大豆的百粒重性狀與大豆產(chǎn)量密切相關(guān)，所述方法、所述引物對(duì)和所述試劑盒均可應(yīng)用于大豆育種(如高產(chǎn)大豆育種)。本發(fā)明同時(shí)發(fā)現(xiàn)一個(gè)控制大豆百粒重性狀的相關(guān)位點(diǎn)(hswl)，被定位于大豆分子遺傳圖譜的A2連鎖群，與EST-SSR功能標(biāo)記GNE070a之間的遺傳距離為2. 8cM。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，GNE070a引物對(duì)可用于選擇大豆的百粒重相關(guān)位點(diǎn)，并且得到了ー個(gè)百粒重相關(guān)位點(diǎn)(高百粒重相關(guān)位點(diǎn)，hswl)，通過(guò)該位點(diǎn)可以輔助篩選高百粒重性狀的大豆材料。從而，應(yīng)用GNE070a引物對(duì)可以輔助篩選大豆的百粒重性狀(特別是高百粒重性狀)和不同百粒重性狀(特別是高百粒重性狀)的大豆。因此，本發(fā)明的引物對(duì)可以應(yīng)用于培育具有高產(chǎn)性狀的大豆品種。
本發(fā)明的方法克服了常規(guī)育種中因表型選擇易受環(huán)境因素干擾而導(dǎo)致育種效率低等問(wèn)題，可以利用GNE070a引物對(duì)對(duì)大豆高百粒重相關(guān)位點(diǎn)進(jìn)行早期世代選擇而縮短育種周期，從而較快地篩選出籽粒較大的高產(chǎn)大豆材料。本發(fā)明可應(yīng)用于大豆高產(chǎn)育種，以提高育種效率和大豆產(chǎn)量水平。


圖1為大豆百粒重性狀相關(guān)位點(diǎn)hswl的定位情況。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。實(shí)施例1、大豆百粒重相關(guān)位點(diǎn)(高百粒重相關(guān)位點(diǎn))hswl的獲得一、引物合成GNE070引物對(duì)序列獲自S0YBASE數(shù)據(jù)庫(kù)；上游正向引物序列為 5，-TGCTTTCCTCTATTGGTTGT-3，；下游反向引物序列為5，-TCTTTCTCTGATCCATCACC-3，，委托北京奧賽博生物公司合成。ニ、雙親基因組擴(kuò)增檢測(cè)用于創(chuàng)建大豆重組自交系(recombinant inbred line，RIL)群體的雙親分別是中黃4 (國(guó)家大豆種質(zhì)資源庫(kù))和中品661 (國(guó)家大豆種質(zhì)資源庫(kù))。中黃4為母本，其籽粒體積較大02. 0-26. 5克/百粒)；中品661為父本，其籽粒體積較小(17. 7-19. 5克/百粒)。采用CTAB法提取雙親葉片的基因組DNA，以GNE070a引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。PCR 反應(yīng)體系(20 μ 1) 10 X Buffer 2 μ 1 (含 Mg2+)，dNTP 0. 4 μ 1 (IOmM)，上游正向引物(5 μ Μ) 和下游反向引物(5μΜ)各2μ 1，基因組DNAGOng/μ 1)1μ l，Taq酶(5U/μ 1) 0. 5 μ 1，其余為 ddH20，滴加一滴礦物油覆蓋。PCR 反應(yīng)程序:94°C 5min ；94°C 60s,53. 5°C 60s,72°C 60s， 35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用9%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，快速銀染法染色并在紫外燈下觀察拍照。結(jié)果顯示，GNE070a引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物在雙親基因組之間呈現(xiàn)多態(tài)性。三、群體擴(kuò)增檢測(cè)及連鎖分析定位用以上兩個(gè)親本進(jìn)行雜交，得到雜種F1,通過(guò)“單粒傳”法構(gòu)建群體，獲得475個(gè)F12 代重組自交系。“單粒傳”法步驟如下在父母本雜交當(dāng)代從母本植株上收獲的一粒種子種植后長(zhǎng)成ー個(gè)F1代單株，其自交(即自花授粉)結(jié)實(shí)收獲1株F2代種子，后者種植長(zhǎng)成ー個(gè)包含分離性狀的F2代株行，它的每ー單株自交結(jié)實(shí)收獲F3代種子，將分離的同類性狀植株單收并脫粒裝袋，每株種子次年單獨(dú)種植ー個(gè)F3株行，自交結(jié)實(shí)收獲F4代種子，……，直至各家系內(nèi)不同植株之間的性狀完全穩(wěn)定一致。像這樣最初由單粒種子經(jīng)過(guò)連續(xù)多代自交、分離、 純化、種植、選育及鑒定等程序，最終發(fā)展成ー個(gè)由數(shù)百個(gè)甚至數(shù)千個(gè)重組自交系構(gòu)成的大群體，即為“單粒傳”法構(gòu)建群體。其特征是各家系內(nèi)不同植株之間的性狀穩(wěn)定一致，而家系間的性狀差異較大。用GNE070a引物對(duì)逐一擴(kuò)增群體中所有株系的基因組DNA，結(jié)合計(jì)算機(jī)作圖軟件 (MAPMAKER/EXP VER 3. 0和WINQTLCART VERSION 2. 5)分析，確定了一個(gè)百粒重性狀相關(guān)位點(diǎn)，將其命名為hswl，被定位于大豆分子遺傳圖譜的A2連鎖群，與其連鎖標(biāo)記GNE070a間的遺傳距離為2. ScM(見(jiàn)圖1)。實(shí)施例2、GNE070a引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物與粒重性狀的相關(guān)性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)樣本為48份大豆植物材料(純合品種或品系)。采用CTAB法分別提取每份大豆植株葉片的基因組DNA，以基因組DNA為模板采用 GNE070a引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。PCR反應(yīng)體系じ0 μ 1) =IOXBuffer 2μ 1 (含Mg2+)，dNTP (IOmM)O. 4 μ 1，上游正向引物(5μΜ)和下游反向引物(5 μ Μ)各2 μ 1，基因組DNA^Ong/ μ 1)1 μ 1，Taq酶(5U/μ 1) 0. 5 μ 1，其余為ddH20，滴加一滴礦物油覆蓋。PCR反應(yīng)程序 940C 5min ；94°C 60s,53. 5°C 60s,72°C 60s，35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用9%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，快速銀染法染色并在紫外燈下觀察?；厥誔CR擴(kuò)增產(chǎn)物并測(cè)序。也可以采用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，觀察相應(yīng)的特異片段。對(duì)48份植株所結(jié)的籽實(shí)進(jìn)行百粒重稱量(設(shè)置三次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果取平均值)，該 48份大豆根據(jù)籽實(shí)的百粒重可以劃分為兩組36份為大粒組(百粒重> 25. 0克)，12份為小粒組(百粒重< 17.3克)，詳見(jiàn)表1。表1大粒組與小粒組大豆材料的百粒重和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序得到的大小
權(quán)利要求
1.ー種輔助篩選具有高百粒重性狀的大豆的方法，包括如下步驟以待測(cè)大豆的基因組DNA為模板，用GNE070a引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物中具有一個(gè)特異 DNA片段的待測(cè)大豆為候選的具有高百粒重性狀的大豆；所述GNE070a引物對(duì)為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對(duì)；所述特異DNA片段的大小為 275bp-285bp ；所述高百粒重性狀為籽粒百粒重彡25. 0克的性狀。
2.ー種輔助鑒定大豆高百粒重性狀的方法，包括如下步驟以待測(cè)大豆的基因組DNA 為模板，用GNE070a引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物中具有一個(gè)特異DNA片段的待測(cè)大豆具有高百粒重的性狀；所述GNE070a引物對(duì)為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對(duì)；所述特異DNA片段的大小為；所述高百粒重性狀為籽粒百粒重彡25. 0克的性狀。
3.序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對(duì)。
4.權(quán)利要求3所述引物對(duì)在制備試劑盒中的應(yīng)用。
5.包括權(quán)利要求3所述引物對(duì)的試劑盒。
6.權(quán)利要求1所述方法在大豆育種中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于將所述候選的具有高百粒重性狀的大豆用于所述育種。
8.權(quán)利要求2所述方法在大豆育種中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于將具有所述高百粒重性狀的大豆用于所述育種。
10.權(quán)利要求3所述引物對(duì)或權(quán)利要求5所述試劑盒在大豆育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了輔助鑒定大豆百粒重相關(guān)位點(diǎn)的一種方法及其專用引物。本發(fā)明提供了輔助篩選具有高百粒重性狀的大豆的一種方法，包括如下步驟以待測(cè)大豆的基因組DNA為模板，用序列1和序列2所示DNA組成的GNE070a引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物中具有一個(gè)特異DNA片段的待測(cè)大豆為候選的具有高百粒重性狀的大豆；所述特異DNA片段的大小為275bp-285bp。本發(fā)明的方法克服了常規(guī)育種中因表型選擇易受環(huán)境因素干擾而導(dǎo)致育種效率低等問(wèn)題，可以利用專用引物對(duì)對(duì)大豆高百粒重相關(guān)位點(diǎn)進(jìn)行早期世代選擇鑒定而縮短育種周期，從而快速篩選出籽粒較大的高產(chǎn)大豆材料。本發(fā)明可應(yīng)用于大豆高產(chǎn)育種，以提高育種效率和大豆產(chǎn)量水平。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102534026SQ201210031778
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月13日
發(fā)明者任海紅, 周國(guó)安, 朱保葛, 李素坤, 楊瑞, 潘毅 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所