專利名稱：一種枯草芽孢桿菌lsse-22及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種枯草芽孢桿菌LSSE-22及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血栓疾病是危害人類健康的重要疾病，每年約有300萬(wàn)患者死亡。因此，溶栓藥物的開(kāi)發(fā)一直是關(guān)乎人類健康的熱點(diǎn)問(wèn)題。傳統(tǒng)的溶栓酶如尿激酶、纖溶酶原激活劑(t-PA)和鏈激酶等，這類酶半衰期短，副作用大，價(jià)格昂貴，且口服利用度低，納豆激酶因其具有可口服、安全、高效、持久和廉價(jià)等優(yōu)勢(shì)，成為近年來(lái)溶栓類產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)熱點(diǎn)(Peng Y,Yang X，Zhang Y.Appl Microbiol Biotechnol，2005，69:126-132)。目前的納豆激酶產(chǎn)品主要包括納豆食品和納豆激酶保健品。納豆食品經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆類而成，富含多種 營(yíng)養(yǎng)元素和多種生理活性物質(zhì)，如納豆激酶、納豆菌、聚谷氨酸、總酚等多種生理活性物質(zhì)，具有溶解血栓、調(diào)節(jié)腸道菌群、抗癌、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)吸收、抗氧化等保健作用。納豆在日本歷史悠久，90%的人習(xí)慣食用納豆食品，是日本人健康長(zhǎng)壽的“秘訣”。納豆在韓國(guó)、美國(guó)也很受歡迎，已有適合本地人口味的產(chǎn)品上市。我國(guó)對(duì)納豆的開(kāi)發(fā)起步比較晚，目前所報(bào)道的納豆激酶產(chǎn)生菌多分離于日本納豆，有一種不愉快的納豆臭味，目前我國(guó)人民對(duì)納豆食品的接受程度還比較低。同時(shí)，國(guó)內(nèi)納豆激酶保健品市場(chǎng)混亂，納豆激酶活性比較低，篩選高活性納豆激酶生產(chǎn)菌有望改善國(guó)內(nèi)納豆激酶產(chǎn)品現(xiàn)狀，提高我國(guó)納豆激酶類產(chǎn)品的競(jìng)爭(zhēng)力。黃豆醬作為我國(guó)人民長(zhǎng)期食用的一種大豆發(fā)酵制品，符合國(guó)人的口味，且其富含枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等多種益生菌。黃豆和鷹嘴豆是世界上最重要的豆類作物，其中鷹嘴豆在我國(guó)新疆地區(qū)被作為維吾爾族習(xí)用藥材，對(duì)糖尿病、高血脂、高血壓病、心腦血管疾病、肺病、消化不良等均有良好的食療作用(全智慧，徐暾海.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20:3111-3112)。鷹嘴豆含有豐富的抗氧化活性成分，如酚類成分和黃酮類成分，這些抗氧化成分可降低癌癥、老年癡呆、心血管疾病的發(fā)病概率(Xu BJ7Yuan SH7Chang SK et al.J FoodSci, 2007, 72:S167-177)。因此，本發(fā)明希望從我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵黃豆醬中分離高產(chǎn)納豆激酶的枯草芽孢桿菌，并以鷹嘴豆和黃豆為發(fā)酵底物，希望得到納豆激酶的高產(chǎn)工藝，制備高活性納豆激酶食品和納豆激酶凍干粉。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的發(fā)明人提出并完成了本發(fā)明。本發(fā)明的目的是提供一種枯草芽孢桿菌LSSE-22。本發(fā)明的另一目的是提供上述枯草芽孢桿菌LSSE-22的應(yīng)用。本發(fā)明的再一目的是提供一種納豆食品，其由上述枯草芽孢桿菌LSSE-22發(fā)酵制得。本發(fā)明的再一目的是提供上述納豆食品的制備方法。
本發(fā)明的再一目的是提供一種納豆激酶水提物凍干粉。本發(fā)明的再一目的是提供制備上述納豆激酶水提物凍干粉的方法。本發(fā)明的再一目的是提供一種同時(shí)制備納豆激酶凍干粉和總酚凍干粉的方法。本發(fā)明提供了一種枯草芽孢桿菌LSSE-22。本發(fā)明的發(fā)明人在黃豆醬制品中，分離篩選出一種納豆激酶生產(chǎn)菌株，適宜生長(zhǎng)溫度28-40°C，適宜PH6.5-7.5。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化鑒定和16S rRNA基因分子鑒定，該菌株被鑒定為枯草芽孢桿菌，命名為L(zhǎng)SSE-22 (Bacillus subtilis)。該菌種保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，100101)，其保藏號(hào)為=CGMCC N0.4970，保藏日期:2011年6月22日。本發(fā)明菌種的分離方法在纖溶酶活性分離法的基礎(chǔ)上，采取獨(dú)特的納豆激酶基因PCR擴(kuò)增法，可快速準(zhǔn)確的篩選到納豆激酶生產(chǎn)菌株。加無(wú)菌水于黃豆醬制品中，80°C加熱lOmin，吸取上清液稀釋涂布篩選培養(yǎng)基平板(纖維蛋白12g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂粉15g/L，pH 7.2)，37°C培養(yǎng)48h，挑選透明圈較大的單菌落，轉(zhuǎn)接LB固體培養(yǎng)基平皿(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂粉15g/L，pH 7.2)，培養(yǎng)后保存于4°C冰箱中。通過(guò)菌種活化，轉(zhuǎn)接至滅菌的鷹嘴豆中，37°C，培養(yǎng)48h。挑選纖溶活性較高的菌株，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增納豆激酶基因。在擴(kuò)增出基因產(chǎn)物的菌株中，收集纖溶活性最高菌株的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)基因序列相似性鑒定該菌為納豆激酶產(chǎn)生菌。納豆激酶活性檢測(cè)通過(guò)纖維蛋白溶解法進(jìn)行:向試管中依次加入0.4mL纖維蛋白原溶液(0.72%, w/v),1.4mL Tris-HCl (50mM, pH 7.8)，37°C 溫浴 5min，然后加入 0.1mL 凝血酶溶液(20U/mL)，37°C溫浴lOmin，再加入0.1mL的稀釋酶樣品，37°C溫浴60min，加入2mL三氯乙酸(0.2M)靜止20min終止反應(yīng)，4000g離心15min，取上清于275nm比色測(cè)定吸光度，I個(gè)單位的纖維蛋白降解酶活(FU)相當(dāng)于每分鐘275nm處吸光度增加0.01所需要的酶量。將篩選到的菌株按照規(guī)定方法進(jìn)行菌種鑒定。本發(fā)明所提供的枯草芽孢桿菌在LB固體培養(yǎng)基上菌落邊緣粗糙，菌苔表面褶皺。適宜生長(zhǎng)溫度28-40°C，適宜pH 6.5-7.5。酪蛋白水解陽(yáng)性，淀粉水解陽(yáng)性，硝酸鹽利用陽(yáng)性，檸檬酸鹽利用陽(yáng)性，明膠液化實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性。菌體呈直桿狀，1.8-2.9X0.8-1.2 μ m，革蘭氏染色陽(yáng)性。本發(fā)明所提供的枯草芽孢桿菌菌株的16S rRNA基因序列有1462個(gè)堿基，該16SrRNA基因序列如SEQ ID N0.1所示:agggaacgtt ggggccgtgc taatacatgc aagtcgagcg gacagatggg agcttgctcc 60ctgatgttag cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcctgtaa gactgggata 120actccgggaa accggggcta ataccggatg gttgtttgaa ccgcatggtt caaacataaa 180aggtggcttc ggctaccact tacagatgga cccgcggcgc attagctagt tggtgaggta 240
acggctcacc aaggcgacga tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac 300tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa 360agtctgacgg agcaacgccg cgtgagtgat gaaggttttc ggatcgtaaa gctctgttgt 420tagggaagaa caagtaccgt tcgaataggg cggtaccttg acggtaccta accagaaagc 480cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggaat 540 tattgggcgt aaagggctcg caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc ccccggctca 600
accggggagg gtcattggaa actggggaac ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca 660cgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg cgactctctg 720gtctgtaact gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt 780agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaagt gttagggggt ttccgcccct tagtgctgca 840gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacggtcgca agactgaaac tcaaaggaat 900tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc 960ttaccaggtc ttgacatcct ctgacaatcc tagagatagg acgtcccctt cgggggcaga 1020gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc 1080aacgagcgca acccttgatc ttagttgcca gcattcagtt gggcactcta aggtgactgc 1140cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg 1200gctacacacg tgctacaatg gacagaacaa agggcagcga aaccgcgagg ttaagccaat 1260cccacaaatc tgttctcagt tcggatcgca gtctgcaact cgactgcgtg aagctggaat 1320cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg 1380cccgtcacac cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt ttaggagcca 1440gccgccgaag ·tgacaagaat gt1462測(cè)得的16S rRNA序列通過(guò)MEG.4軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，進(jìn)化樹顯示菌株LSSE-22屬于枯草芽孢桿菌。綜合形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化鑒定和16S rRNA基因分子鑒定結(jié)果，該菌株被鑒定為枯草芽孢桿菌。該菌株具有較高的納豆激酶生產(chǎn)活性，以鷹嘴豆為底物，納豆激酶最高活性達(dá)到356.25FU/g (鷹嘴豆干重)。本發(fā)明還提供了上述枯草芽孢桿菌LSSE-22的應(yīng)用，優(yōu)選其在生產(chǎn)納豆激酶、總酚、制備納豆食品及在醫(yī)藥、食品工業(yè)中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種納豆食品，其中，所述納豆食品由豆類底物經(jīng)上述枯草芽孢桿菌發(fā)酵制得。根據(jù)本發(fā)明的納豆食品，其中，所述豆類底物為鷹嘴豆或黃豆。本發(fā)明的上述納豆食品的制備方法，包括以下步驟:I)將權(quán)利要求1所述枯草芽孢桿菌LSSE-22菌株接在LB液體培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)12h后放置于無(wú)菌管中，-70°C冷凍保藏；2)制備種子液；3)制備豆類發(fā)酵底物，其中所述豆類為鷹嘴豆或黃豆；4)發(fā)酵培養(yǎng):按照2% -5% (v/w)的接種量，將種子液加入豆類發(fā)酵底物中混勻，31-37°C靜止培養(yǎng)36-48h，獲得納豆食品。根據(jù)本發(fā)明的納豆食品的制備方法，其中，所述種子液制備方法包括以下步驟:I)將冷凍保藏的菌種接種到LB固體培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)12h，使其活化；2)將活化的菌種轉(zhuǎn)接到LB液體種子培養(yǎng)基中，37°C，180rpm培養(yǎng)8-14h，制得種子液。根據(jù)本發(fā)明的納豆食品的制備方法，其中，所述豆類發(fā)酵底物制備方法包括以下步驟:I)精選:去除變色、霉?fàn)€、蟲蛀的豆子，除去其中雜物，并用水清洗；
2)浸泡:加入5倍體積(v/w)的水，室溫浸泡12h ；3)浙水，使豆子的初始含水量為50% -70% ；4)蒸煮:將完整豆子或者經(jīng)破碎處理的豆子在115°C高溫高壓蒸煮30min，制得豆類發(fā)酵底物。本發(fā)明還提供了一種納豆激酶水提物凍干粉，經(jīng)由上述納豆食品制備獲得，富含納豆激酶和總酚。本發(fā)明還提供了一種制備納豆激酶水提物凍干粉的方法，包括以下步驟:向上述納豆食品中添加4倍體積(v/w)的水，200r/min攪拌lh,5000-10000g離心20-40min,除去固體物質(zhì)，上清液冷凍干燥48h，獲得水提物凍干粉。本發(fā)明還提供了一種同時(shí)制備納豆激酶凍干粉和總酚凍干粉的方法，包括以下步驟:I)水提:向上述納豆食品中添加4倍體積(v/w)的水,200r/min攪拌Ih,5000-10000g離心20-40min，除去固體物質(zhì)，獲得水提物；2)乙醇分離:向水提物中添加3倍體積的無(wú)水乙醇，室溫靜止沉淀lh，離心收集沉淀物，冷凍干燥，獲得納豆激酶干粉；同時(shí)，收集上清液，經(jīng)過(guò)冷凍干燥，獲得總酚凍干粉。使用該方法制 備的納豆激酶凍干粉，納豆激酶活性高達(dá)2852.62FU/g (干重)；制備的總酚凍干粉，總酚含量達(dá)14.78mg沒(méi)食子酸/g (干重)。本發(fā)明所提供的枯草芽孢桿菌菌株及用其生產(chǎn)納豆激酶產(chǎn)品的方法，具有較強(qiáng)的創(chuàng)新性和實(shí)用性，其優(yōu)點(diǎn)如下:(I)該菌株具有較高的納豆激酶生產(chǎn)活性，以鷹嘴豆為底物，納豆激酶最高活性達(dá)到356.25FU/g (鷹嘴豆干重)，是目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道最高的。(2)首次制備鷹嘴豆納豆激酶水提物凍干粉，富含納豆激酶和抗氧化活性物質(zhì)總酚。(3)首次通過(guò)乙醇分離法同時(shí)分離制備納豆激酶和抗氧化活性物質(zhì)總酚，納豆激酶活性高達(dá)2852.62FU/g (干重)，總酚含量達(dá)14.78mg沒(méi)食子酸/g (干重)，該方法簡(jiǎn)單高效。


枯草芽孢桿菌LSSE-22 (Bacillus subtilis)，于2011年6月22日保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，100101)，其保藏號(hào)為:CGMCC N0.4970。
具體實(shí)施例方式結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1菌株的篩選本發(fā)明菌種的分離方法綜合了纖溶酶活性分離法和納豆激酶基因PCR擴(kuò)增法，可快速準(zhǔn)確的篩選到納豆激酶生產(chǎn)菌株。加無(wú)菌水于黃豆醬制品中，80°C加熱lOmin，吸取上清液稀釋涂布篩選培養(yǎng)基平板(纖維蛋白12g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉IOg/L，瓊脂粉15g/L，pH 7.2)，37°C培養(yǎng)48h，挑選透明圈較大的單菌落，轉(zhuǎn)接LB固體培養(yǎng)基平皿(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂粉15g/L，pH 7.2)，培養(yǎng)后保存于4°C冰箱中。通過(guò)菌種活化，轉(zhuǎn)接至滅菌的鷹嘴豆中，37°C，發(fā)酵48h。挑選纖溶活性較高的菌株，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增納豆激酶基因。菌株總DNA通過(guò)細(xì)菌基因組抽提試劑盒抽提，PCR擴(kuò)增采用納豆激酶基因開(kāi)放閱讀框特異性引物aprNF(CCGTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCA)和aprNR(ATTTATTGTGCAGCTGCTTGTACGTTG)進(jìn)行。PCR 程序?yàn)?94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30s，52°C退火30s，72°C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。結(jié)果顯示有3株菌可得到PCR產(chǎn)物，其中活性最高的菌株纖溶活性達(dá)173.75FU/g (干豆)，收集該菌株的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示該基因長(zhǎng)度為1146bp，可翻譯成381個(gè)氨基酸組成的蛋白，其中信號(hào)肽29個(gè)氨基酸，前肽77個(gè)氨基酸，成熟肽275個(gè)氨基酸。通過(guò)BioEdit進(jìn)行相似性比對(duì)，該酶同已報(bào)道的納豆激酶的基因序列和氨基酸序列相似性達(dá)到99.9%和99.7%，因此所得菌株生產(chǎn)的纖溶酶被鑒定為納豆激酶。納豆激酶活性檢測(cè)通過(guò)纖維蛋白溶解法進(jìn)行:向試管中依次加入0.4mL纖維蛋白原溶液(0.72%,w/v),1.4mL Tris-HCl (50mM, pH 7.8)，37°C 溫浴 5min，然后加入 0.1mL 凝血酶溶液(20U/mL)，37°C溫浴lOmin，再加入0.1mL的稀釋酶樣品，37°C溫浴60min，加入2mL三氯乙酸(0.2M)靜止20min終止反應(yīng)，4000g離心15min，取上清于275nm比色測(cè)定吸光度，I個(gè)單位的纖維蛋白降解酶活(FU)相當(dāng)于每分鐘275nm處吸光度增加0.01所需要的酶量。實(shí)施例2菌株的鑒定形態(tài)及生理生化鑒定細(xì)菌形態(tài)及生理生化鑒定依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行，分離所得菌株在LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，菌落邊緣粗糙，菌苔表面褶皺。適宜生長(zhǎng)溫度28-40°C，適宜pH
6.5-7.5。酪蛋白水解陽(yáng)性， 淀粉水解陽(yáng)性，硝酸鹽利用陽(yáng)性，檸檬酸鹽利用陽(yáng)性，明膠液化實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性。菌體呈直桿狀，1.8-2.9X0.8-1.2 μ m，革蘭氏染色陽(yáng)性。16S rRNA 分子鑒定菌株總DNA通過(guò)細(xì)菌基因組抽提試劑盒抽提，16S rRNA基因PCR擴(kuò)增采用通用引物(27f:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和(1492r:GGTTACCTTGTTACGACTT)進(jìn)行。PCR 程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min ;94°C變性45s，55。。退火45s，72。。延伸1.5min，28個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin?；驕y(cè)序通過(guò)ABI Prism 370自動(dòng)測(cè)序儀完成。測(cè)序結(jié)果顯示該菌株的16S rRNA基因序列有1462個(gè)堿基(SEQ ID N0.1)，與枯草芽孢桿菌JBE0016的序列相似性達(dá)到99.1%。通過(guò)MEG.4軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，進(jìn)化樹也顯示菌株屬于枯草芽孢桿菌。結(jié)合16SrRNA分子鑒定與前面的形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定結(jié)果,鑒定該菌株為芽孢桿菌屬枯草芽孢桿菌，命名為L(zhǎng)SSE-22(Bacillus subtilis)。該菌種保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，100101)，其保藏號(hào)為=CGMCC N0.4970，保藏日期:2011年6月22日。實(shí)施例3鷹嘴豆固體發(fā)酵1、用冷凍保藏的枯草芽孢桿菌LSSE-22為原始菌種；2、斜面菌種活化:將冷凍保藏的菌種，轉(zhuǎn)接到LB固體平板，37°C培養(yǎng)12h。3、種子液培養(yǎng):
將LB固體平板活化的種子轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基，37°C，180rpm培養(yǎng)8h ；4、鷹嘴豆底物制備:(I)鷹嘴豆精選:去除變色、霉?fàn)€、蟲蛀的鷹嘴豆，除去其中混有的砂石、土塊等雜物，并用水清洗兩邊。(2)浸泡:加入5倍體積(v/w)水,室溫浸泡12h。(3)浙水:浙去浸泡后的鷹嘴豆中多余的水分，初始含水量為50%。(4)蒸煮:115°C高溫高壓蒸煮30min，冷卻至室溫。5、發(fā)酵培養(yǎng):按照2% (v/w)的接種量，加入鷹嘴豆中混勻，31°C靜止培養(yǎng)36h，獲得鷹嘴豆納豆食品 。6、納豆激酶活性分析:向發(fā)酵鷹嘴豆中加入4倍體積(v/w)水，200r/min水提lh，5000g離心20min除去菌體，上清液為納豆激酶水提物。采用實(shí)施例1所述納豆激酶活性分析方法，檢測(cè)分析發(fā)酵鷹嘴豆中納豆激酶活性為150.35FU/g (干重)，水提物凍干粉中納豆激酶活性為788.95FU/g (干重)。實(shí)施例4鷹嘴豆固體發(fā)酵1、用冷凍保藏的枯草芽孢桿菌LSSE-22為原始菌種；2、斜面菌種活化:將冷凍保藏的菌種，轉(zhuǎn)接到LB固體平板，37°C培養(yǎng)12h。3、種子液培養(yǎng):將LB固體平板活化的種子轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基，37°C，180rpm培養(yǎng)14h ；4、鷹嘴豆底物制備:(I)鷹嘴豆精選:去除變色、霉?fàn)€、蟲蛀的鷹嘴豆，除去其中混有的砂石、土塊等雜物，并用水清洗兩邊。(2)浸泡:加入5倍體積(v/w)自來(lái)水，室溫浸泡12h。(3)浙水:浙去浸泡后的鷹嘴豆中多余的水分，初始含水量為70%。(4)破碎:用研磨機(jī)將鷹嘴豆磨成鷹嘴豆碎片。(5)蒸煮:115 °C高溫高壓蒸煮30min，冷卻至室溫。5、發(fā)酵培養(yǎng):按照5% (v/w)的接種量，加入鷹嘴豆中混勻，37°C靜止培養(yǎng)48h，獲得鷹嘴豆納豆食品。6、納豆激酶活性分析:向發(fā)酵鷹嘴豆中加入4倍(v/w)體積水，200r/min水提lh，IOOOOg離心20min除去菌體，上清液為納豆激酶水提物。采用實(shí)施例1所述納豆激酶活性分析方法，檢測(cè)分析發(fā)酵鷹嘴豆中納豆激酶活性為310.58FU/g (干重)，水提物凍干粉中納豆激酶活性為996.45FU/g (干重)。實(shí)施例5鷹嘴豆固體發(fā)酵1、用冷凍保藏的枯草芽胞桿菌LSSE-22為原始菌種；2、斜面菌種活化:將冷凍保藏的菌種，轉(zhuǎn)接到LB固體平板，37°C培養(yǎng)12h。3、種子液培養(yǎng):將LB固體平板活化的種子轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基，370C，180rpm培養(yǎng)12h ；4、鷹嘴豆底物制備:
(I)鷹嘴豆精選:去除變色、霉?fàn)€、蟲蛀的鷹嘴豆，除去其中混有的砂石、土塊等雜物，并用自來(lái)水清洗兩邊。(2)浸泡:加入5倍體積自來(lái)水，室溫浸泡12h。(3)浙水:浙去浸泡后的鷹嘴豆中多余的水分，初始含水量為50%。(4)破碎:用研磨機(jī)將鷹嘴豆磨成鷹嘴豆碎片。(5)蒸煮:115 °C高溫高壓蒸煮30min，冷卻至室溫。5、發(fā)酵培養(yǎng):按照5% (v/w)的接種量，加入鷹嘴豆中混勻，34°C靜止培養(yǎng)44h。6、納豆激酶活性分析:向發(fā)酵鷹嘴豆中加入4倍體積自來(lái)水，200r/min水提lh，5000g離心20min除去菌體，上清液為納豆激酶水提物。采用實(shí)施例1所述納豆激酶活性分析方法，檢測(cè)分析發(fā)酵鷹嘴豆中納豆激酶活性為356.25FU/g (干重)，水提物凍干粉中納豆激酶活性為1113.28FU/g (干重)。7、總酚含量分析:0.2mL樣品加入到0.2mL的福林酚試劑(IN)中，反應(yīng)3min，加入
0.4mLNa2C03溶液(IN),室溫反應(yīng)90min,加入2mL去離子水,4000g離心lOmin, 725nm測(cè)定上清吸光度，以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品(10、20、30、40、50 μ g/mL)，總酚含量等價(jià)表示為mg沒(méi)食子酸/g干重。檢測(cè)分析發(fā)酵鷹嘴豆中總酚含量為3.Slmg沒(méi)食子酸/g干重，水提物凍干粉中總酚含量為11.6Img沒(méi)食子酸/g干重。實(shí)施例6 —步分離納豆激酶和總酚活性物質(zhì)向?qū)嵤├?所制備的納豆激酶水提物中加入3倍體積(v/w)的無(wú)水乙醇，放置Ih后，5000g離心lOmin，收集沉淀和上清液。沉淀物冷凍干燥，即得納豆激酶凍干粉，凍干粉產(chǎn)量為115.74mg/g (干重)，凍干粉納豆`激酶活性為2852.62FU/g (干重)，酶活回收率達(dá)92.65% ;上清液冷凍干燥，即得總酚凍干粉，產(chǎn)物檢測(cè)總酚含量為14.78mg沒(méi)食子酸/g干重，回收率為89.23%。實(shí)施例7黃豆固體發(fā)酵1、用冷凍保藏的枯草芽孢桿菌LSSE-22為原始菌種；2、斜面菌種活化:將冷凍保藏的菌種，轉(zhuǎn)接到LB固體平板，37°C培養(yǎng)12h。3、種子液培養(yǎng):將LB固體平板活化的種子轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基，370C，180rpm培養(yǎng)12h ；4、黃豆底物制備:(I)黃豆精選:去除變色、霉?fàn)€、蟲蛀的黃豆，除去其中混有的砂石、土塊等雜物，并用自來(lái)水清洗兩邊。(2)浸泡:加入5倍體積(v/w)自來(lái)水，室溫浸泡12h。(3)浙水:浙去浸泡后的黃豆中多余的水分，初始含水量為50%。(4)蒸煮:115 °C高溫高壓蒸煮30min，冷卻至室溫。5、發(fā)酵培養(yǎng):按照5% (v/w)的接種量，加入黃豆中混勻，34°C靜止培養(yǎng)44h，獲得納 食品。6、納豆激酶活性分析:向發(fā)酵黃豆中加入4倍體積(v/w)自來(lái)水，200r/min水提lh, IOOOOg離心20min除去菌體，上清液為納豆激酶水提物。檢測(cè)分析發(fā)酵黃豆中納豆激酶活性為188.75FU/g(干重)，水提物凍干粉中納豆激酶活性為686.36FU/g(干重)。
實(shí)施例8黃豆固體發(fā)酵1、用冷凍保藏的枯草芽孢桿菌LSSE-22為原始菌種；2、斜面菌種活化:將冷凍保藏的菌種，轉(zhuǎn)接到LB固體平板，37°C培養(yǎng)12h。3、種子液培養(yǎng):將LB固體平板活化的種子轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基，37°C，180rpm培養(yǎng)12h ；4、黃豆底物制備:(I)黃豆精選:去除變色、霉?fàn)€、蟲蛀的黃豆，除去其中混有的砂石、土塊等雜物，并用自來(lái)水清洗兩邊。

(2)浸泡:加入5倍體積(v/w)自來(lái)水，室溫浸泡12h。(3)浙水:浙去浸泡后的黃豆中多余的水分，初始含水量為70%。(4)破碎:用研磨機(jī)將黃豆磨成l_5mm的碎片。(5)蒸煮:115 °C高溫高壓蒸煮30min，冷卻至室溫。5、發(fā)酵培養(yǎng):按照5% (v/w)的接種量，加入黃豆中混勻，37°C靜止培養(yǎng)48h，獲得納 食品。6、納豆激酶活性分析:向發(fā)酵黃豆中加入4倍體積(v/w)自來(lái)水，200r/min水提lh, IOOOOg離心20min除去菌體，上清液為納豆激酶水提物。檢測(cè)分析發(fā)酵黃豆中納豆激酶活性為292.5FU/g(干重)。向納豆激酶水提物中加入3倍體積(v/w)的無(wú)水乙醇，放置Ih后，5000g離心lOmin，收集沉淀，沉淀物檢測(cè)納豆激酶活性為2242.96FU/g (干重)。
權(quán)利要求
1.一種枯草芽孢桿菌 LSSE-22 (Bacillus subtilis)，其保藏編號(hào)為:CGMCC N0.4970。
2.權(quán)利要求1所述枯草芽孢桿菌LSSE-22的應(yīng)用。
3.—種納豆食品，其特征在于，所述納豆食品由豆類底物經(jīng)權(quán)利要求1所述枯草芽孢桿菌發(fā)酵制得。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的納豆食品，其特征在于，所述豆類底物為鷹嘴豆或黃豆。
5.一種納豆食品的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)將權(quán)利要求1所述枯草芽孢桿菌LSSE-22菌株接在LB液體培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)12h后放置于無(wú)菌管中，-70°C冷凍保藏； 2)制備種子液； 3)制備豆類發(fā)酵底物，其中所述豆類為鷹嘴豆或黃豆； 4)發(fā)酵培養(yǎng):按照2%-5% (v/w)的接種量，將種子液加入豆類發(fā)酵底物中混勻，31-37°C靜止培養(yǎng)36-48h，獲得納豆食品。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的納豆食品的制備方法，其特征在于，所述種子液制備方法包括以下步驟: 1)將冷凍保藏的菌種接種到LB固體培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)12h，使其活化； 2)將活化的菌種轉(zhuǎn)接到LB液體種子培養(yǎng)基中，37°C，180rpm培養(yǎng)8_14h，制得種子液。
7.根據(jù)權(quán)利要求4·所述的納豆食品的制備方法，其特征在于，所述豆類發(fā)酵底物制備方法包括以下步驟: 1)精選:去除變色、霉?fàn)€、蟲蛀的豆子，除去其中雜物，并用水清洗； 2)浸泡:加入5倍體積(v/w)的水,室溫浸泡12h； 3)浙水，使豆子的初始含水量為50%-70% ； 4)蒸煮:將完整豆子或者經(jīng)破碎處理的豆子在115°C高溫高壓蒸煮30min，制得豆類發(fā)酵底物。
8.—種納豆激酶水提物凍干粉，其特征在于，經(jīng)由權(quán)利要求2所述納豆食品制備獲得，富含納豆激酶和總酚。
9.一種制備納豆激酶水提物凍干粉的方法，其特征在于，包括以下步驟: 向權(quán)利要求2所述納豆食品中添加4倍體積(v/w)的水,200r/min攪拌Ih,5000-10000g離心20-40min，除去固體物質(zhì)，上清液冷凍干燥48h，獲得水提物凍干粉。
10.一種同時(shí)制備納豆激酶凍干粉和總酚凍干粉的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)水提:向權(quán)利要求2所述納豆食品中添加4倍體積(v/w)的水，200r/min攪拌lh，5000-10000g離心20-40min，除去固體物質(zhì)，獲得水提物； 2)乙醇分離:向水提物中添加3倍體積的無(wú)水乙醇，室溫靜止沉淀lh，離心收集沉淀物，冷凍干燥，獲得納豆激酶干粉；同時(shí)，收集上清液，經(jīng)過(guò)冷凍干燥，獲得總酚凍干粉。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種枯草芽孢桿菌LSSE-22及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種枯草芽孢桿菌LSSE-22(Bacillus subtilis)，其保藏編號(hào)為CGMCC No.4970。本發(fā)明還提供了上述枯草芽孢桿菌LSSE-22的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種納豆食品，由豆類底物經(jīng)上述枯草芽孢桿菌LSSE-22發(fā)酵制得。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌LSSE-22具有較高的納豆激酶生產(chǎn)活性，以鷹嘴豆為底物，納豆激酶最高活性達(dá)到356.25FU/g(鷹嘴豆干重)；本發(fā)明通過(guò)乙醇分離法同時(shí)分離制備納豆激酶和抗氧化活性物質(zhì)總酚，納豆激酶活性高達(dá)2852.62FU/g(干重)，總酚含量達(dá)14.78mg沒(méi)食子酸/g(干重)，該方法簡(jiǎn)單高效。
文檔編號(hào)C12N9/56GK103243040SQ20121003129
公開(kāi)日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2012年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月13日
發(fā)明者劉會(huì)洲, 魏雪團(tuán), 羅明芳, 謝渝春, 李昊劍, 楊良嶸 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所